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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201410563725.1(22)申请日 2014.10.22CGMCC 6326 2012.07.10C12N 1/20(2006.01)A61K 35/742(2015.01)A61P 37/04(2006.01)A23L 1/29(2006.01)C12R 1/25(2006.01)(71)申请人天津科技大学地址 300457 天津市塘沽区经济技术开发区第十三大街29号(72)发明人王艳萍(74)专利代理机构天津佳盟知识产权代理有限公司 12002代理人侯力(54) 发明名称一株具有增强免疫活性的植物乳杆菌(57) 摘要本发明涉及。
2、一株具有增强免疫活性的植物乳杆菌，及含有所述菌株的组合物，其中所述的菌株为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，保藏编号为：CGMCC6326。该菌株具有提高机体免疫力的能力，所述组合物为食品或药物组合物形式。本发明还公开了筛选测定乳酸菌菌株的方法，以及通过提高调节机体的脏器指数、非特异性免疫及特异性免疫反应来达到提高机体免疫力的方法。本发明的一个目标就是以日常摄入益生菌乳酸菌来替代药物，达到提高人体免疫力；将对人体无毒、副作用且有益健康的乳酸菌作为治疗免疫力低下患者的新选择。(83)生物保藏信息(51)Int.Cl.(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利。
3、申请权利要求书1页 说明书11页 附图4页(10)申请公布号 CN 104480032 A(43)申请公布日 2015.04.01CN 104480032 A1/1 页21.一株具有增强免疫活性的植物乳杆菌BC299(Lactobacillus plantarum BC299)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为 ：CGMCC 6326。2.一种组合物，该组合物是含有权利要求 1 所述植物乳杆菌 BC299 的生理上可接受的赋形剂或稀释剂。3.如权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述的植物乳杆菌BC299为活菌或死菌或该菌株的衍生物，所述的生理上可接受的赋形剂或稀释。
4、剂为一种食品或药品。4.如权利要求 3 所述的组合物，其特征在于，所述的食品是发酵乳、乳酪、含乳饮料、乳粉、发酵果蔬或其他含有该菌株或该菌株衍生物的食品的任何一种。5.如权利要求 3 所述的组合物，其特征在于，所述的药品是胶囊、粉剂、片剂或其他药学上可以接受的赋形剂或稀释剂的任何一种。6.如权利要求2至5任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物用于增强机体的免疫反应，为口服形式。7.如权利要求 6 所述的组合物，其特征在于所述组合物，用于提高机体的免疫脏器指数、血液中白细胞数，促进脾淋巴细胞的转化，增强巨噬细胞的吞噬活性、NK 细胞的杀伤活性及 DTH 反应 ；或者，用于调节机体的 IL-1。
5、2 或 IFN- 或 IL-10 或免疫球蛋白 IgG 的产生 ；或者，用于调节肠道菌群，抑制肠道大肠杆菌的增殖或促进肠道乳酸杆菌的增殖。权 利 要 求 书CN 104480032 A1/11 页3一株具有增强免疫活性的植物乳杆菌技术领域0001 本发明属于生物技术领域，具体涉及一株具有免疫调节活性的植物乳杆菌。背景技术0002 益生菌是指一类对宿主产生有益作用的活性微生物，通过定植于宿主肠道、生殖系统内，能够对宿主产生确切的健康功效，从而改善宿主体内微生态平衡、发挥有益作用的活性微生物的总称。乳酸菌作为益生菌中最具代表性的菌属，具有帮助消化、促进营养物质的吸收、缓解乳糖不耐症、预防和治疗腹泻。
6、、调节肠道菌群和缓解便秘、调节机体免疫功能、降低血液总的胆固醇、改善食物引起的过敏性疾病、延缓衰老及抗肿瘤等生理活性。0003 随着年龄的增长、人们的生活与工作压力不断增大、饮食作息不合理、以及环境污染等原因造成亚健康人群不断增加，而亚健康最明显的症状就是机体免疫力低下，从而易引起其他疾病。大量体内外及临床实验表明乳酸菌具有调节机体免疫力的活性，市场上也相继出现具有改善机体免疫力的乳酸菌产品，深受消费者的欢迎。然而，目前中国市场的乳酸菌产品使用的菌株多为国外供应商提供的菌株，如丹麦科汉森公司的动物双歧杆菌BB12、芬兰维利奥公司的鼠李糖乳杆菌 LGG 等，国内研发的具有自主知识产权的调节免疫力。
7、的菌株少之又少，能够成功上市的菌株更是凤毛麟角。0004 目前，国内外研究比较多的有双歧杆菌、干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、瑞士乳杆菌等菌株。然而，由于乳酸菌的益生活性具有菌株特异性，不同菌株之间的益生活性差别较大。因此，需要更有针对性的筛选具有特殊生理活性的菌株，特别是我国有大量的传统发酵食品，其中有大量的乳酸菌亟待研究与开发。发明内容0005 本发明目的是提供一株具有增强免疫活性的植物乳杆菌，以便解决中国市场上乳酸菌产品使用的菌株的国产化问题。0006 本发明提供的植物乳杆菌是从中国传统泡菜中分离得到的植物乳杆菌 BC299，该菌株具有提高机体免疫力的活性。该菌株由天津科技大学食品。
8、工程与生物技术学院食品生物技术实验室分离并保藏，编号 BC299 ；该菌株已于 2012 年 7 月 10 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址，北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号，中国科学院微生物研究所，菌种保藏编号为 ：CGMCC 6326，建议分类命名为 ：植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。0007 本发明同时提供了一种组合物，该组合物是包含所述植物乳杆菌 BC299 菌株的生理上可接受的赋形剂或稀释剂，可以是食品或药品。所述的植物乳杆菌 BC299 为活菌或死菌或该菌株的衍生物。0008 所述的食品可以是发酵乳、乳酪、含乳饮料、乳粉、。
9、发酵果蔬或其他含有该菌株或该菌株衍生物的食品的任何一种。所述的药品是胶囊、粉剂、片剂或其他药学上可以接受的赋形剂或稀释剂的任何一种。说 明 书CN 104480032 A2/11 页40009 本发明所提供的组合物可以用于增强机体的免疫反应，为口服形式。具体包括 ：0010 用于提高机体的免疫脏器指数、血液中白细胞数，促进脾淋巴细胞的转化，增强巨噬细胞的吞噬活性、NK 细胞的杀伤活性及 DTH 反应 ；0011 或者，用于调节机体的 IL-12 或 IFN- 或 IL-10 或免疫球蛋白 IgG 的产生 ；0012 或者，用于调节肠道菌群，抑制肠道大肠杆菌的增殖或促进肠道乳酸杆菌的增殖。001。
10、3 此外，本发明还提供了利用植物乳杆菌 BC299 菌株制备用于调节机体免疫力的食品或药品的方法。0014 本发明所述食品或药品的用途可广义包括一种提高机体免疫力、改善肠道菌群的方法，所述方法包括给予哺乳动物可达到提高免疫力效果剂量的该菌株的组合物。0015 无须做进一步阐述，本发明所属领域技术人员根据上述说明即可利用本发明至最广的程度。因此，以下说明仅作为示例说明，并非以任何方式限制其余的揭露内容。若本文所述及的明确完整事物已在与本发明有关的相关技术中出现已知的同等物时，这些已知的同等物将视为独立事项并入本文中。0016 本发明的优点和有益效果 ：0017 本发明提供了一株具有免疫调节及改善。
11、肠道菌群的植物乳杆菌 BC299，该菌株可以通过调节机体的非特异性免疫功和特异性免疫功能，从而达到提高机体免疫力的目的。此外，植物乳杆菌 BC299 还可有效抑制肠道内大肠杆菌的增殖，促进乳酸杆菌的增殖，可有效改善机体内肠道菌群的平衡。本发明的一个目标就是以日常摄入益生菌乳酸菌来替代药物，达到提高人体免疫力 ；将对人体无毒、副作用且有益健康的乳酸菌作为治疗免疫力低下患者的新选择。本发明菌株可以是食品或药品形式的组合物，并可为发酵食品提供特殊的风味与口感。附图说明0018 图1所示为本发明分离菌株植物乳杆菌BC299在显微镜和扫描电镜下观察到的个体形态。0019 图 2 所示为本发明分离菌株植物。
12、乳杆菌 BC299 体外促进 BALB/c 小鼠脾细胞增殖的效果，RPMI-1640 细胞培养基为空白对照组，脂多糖为阳性对照组。0020 图3所示为本发明分离菌株植物乳杆菌BC299体外促进鼠源巨噬细胞株RAW264.7增殖的效果，RPMI-1640 细胞培养基为空白对照组，脂多糖为阳性对照组。0021 图 4 所示为 BALB/c 小鼠灌喂本发明分离菌株植物乳杆菌 BC299 后，对体重的影响，生理盐水为空白对照组。0022 图 5 所示为 BALB/c 小鼠灌喂本发明分离菌株植物乳杆菌 BC299 后，对其摄食量的影响，生理盐水为空白对照组。0023 图 6 所示为 BALB/c 小鼠灌。
13、喂本发明分离菌株植物乳杆菌 BC299 后，对其脾淋巴细胞转化的影响，生理盐水为空白对照组，其中包括脂多糖(LPS)诱导B细胞转化和刀豆蛋白A(ConA) 诱导 T 细胞转化。0024 图 7 所示为 BALB/c 小鼠灌喂本发明分离菌株植物乳杆菌 BC299 后，对其脾脏巨噬细胞吞噬能力的影响，生理盐水为空白对照组，。0025 图 8 所示为 BALB/c 小鼠灌喂本发明分离菌株植物乳杆菌 BC299 后，对其外周血 T说 明 书CN 104480032 A3/11 页5淋巴细胞亚群的影响，生理盐水为空白对照组，。具体实施方式0026 以下通过具体实施例进一步说明本发明的技术特点，图中显示的。
14、具体实施例是目前最佳的，但这些实施例并非用以限定本发明的保护范围。0027 首先，本发明提供了一株分离自泡菜中、具有免疫调节活性的植物乳杆菌 BC299，该菌株由天津科技大学食品工程与生物技术学院食品生物技术实验室分离并保藏，编号BC299 ；于 2012 年 7 月 10 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种编号为 ：CGMCC 6326。0028 实施例 1 ：菌株的分离与培养0029 采集中国传统泡菜，经研磨后，无菌生理盐水梯度稀释至适当浓度，采用平板涂布法涂布于 MRS 平板培养基上，于 37下静置厌氧培养 36 72h，培养得乳杆菌疑似菌株的各菌落。取该菌落涂布于。
15、 MRS 平板培养基上，于 37下静置厌氧培养 36 72h，挑取单菌落做进一步纯化，依照以下实施例 2 进行菌株鉴定，获得分离菌株 BC299。0030 将分离菌株采用划线法接种于 MRS 平板培养基上，于 37下厌氧培养 36 72h，挑取单菌落至 0.5 2mL 新鲜无菌的 MRS 液体培养基中，于 372下厌氧培养 24 48h，待菌株生长状况良好后，以 1 4 (v/v) 的接种量接种至 5 8mL 新鲜无菌的 MRS 液体培养基中，于 372下厌氧培养 18 24h。重复此步骤直至菌株回复活力，培养所得菌液供后续实验使用。0031 实施例 2 ：菌株鉴定0032 2.1、初步分析0。
16、033 根据菌种鉴定的标准方法进行初步分析，结果表明本发明的分离菌株 BC299 为革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性杆菌 ( 附图 1)，无运动性，不产孢子，于有氧及厌氧条件下均能生长。0034 2.2、16S rDNA 的 PCR 分析0035 以菌株 BC299 的基因组 DNA 为模板，向 PCR 管中添加细菌通用引物 (P1 序列为5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3；P2 序列为 ：5-AAGGAGGTGATCCAGCC-3)，DNA 聚合酶、缓冲液、dNTPs 等试剂后，进行 PCR 扩增。0036 各试剂添加量及扩增程序如下 ：0037 各试剂添加量 ：DNA 基因组 (1。
17、00ng/L)1L 作为 PCR 反应模板，0.5mmol/L 引物P1、P2 各 1L，10PCR buffer( 含 Mg2+)2L，dNTPs(2mmol/L)1L，Taq DNA 聚合酶 (5U/L)1L，ddH2O 13L ；总体系 20L。0038 16S rDNA PCR反应程序 ：94，10min ；94，30s ；52，30s ；72，110s ；30循环后72延伸 10min。反应结束后，采用琼脂糖电泳分析 PCR 产物，对产物片段进行切胶回收。纯化后的产物进行序列分析。测序结果与 GeneBank 中的标准株序列 (http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/b。
18、last) 进行同源性比较，并计算同源性百分比，选取相似度最高的菌种名称作为初步鉴定结果。0039 菌株 BC299 的 16S rDNA PCR 产物扩增片断的测序结果显示，该菌株的基因序列与乳杆菌属的植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum) 的同源相似性为 99 ( 登录号 ：说 明 书CN 104480032 A4/11 页6JX280493.1)。0040 2.3 菌株 BC299 的 API 50CHL 系统鉴定0041 挑取活化好的乳酸菌菌落，在API 50CHL培养基中制得相当于2McFarland浑浊度的菌悬浮液，将此菌的悬浮液加入API 50CHL试剂条。
19、中，进行系统鉴定。阳性结果记为“+”，阴性结果记为“”，将结果输入系统测定软件中，通过归纳菌株测试结果确定其归属的种类。0042 表 1 菌株 BC299 的 API 鉴定分析结果0043 0044 测试结果通过系统软件进行比对后，显示菌株BC299为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。0045 综合上述结果，本发明的分离菌株 BC299 属于植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)。0046 实施例 3 ：植物乳杆菌 BC299 的耐酸耐胆盐试验0047 为了检测植物乳杆菌 BC299 是否能够顺利通过胃肠道的酸性和高胆盐环境，从而得以顺利地在。
20、肠道发挥其提高免疫力的功能，实验流程如下 ：0048 将植物乳杆菌BC299于MRS液体培养基中连续活化至恢复活力后，以4(v/v)的说 明 书CN 104480032 A5/11 页7接种量接种于 pH 值为 2.0 的 MRS 液体培养基中，37静置厌氧培养。分别于 0、30、60、90、120min进行取样，梯度稀释至10-510-7后，采用平板涂布法进行菌落计数(平均值SD)，确定菌株对胃酸的耐受性。0049 此外，将活化后的植物乳杆菌 BC299 以 4 (v/v) 的接种量接种于含有 0.3 (w/v) 牛胆盐的 MRS 液体培养基中，以不含胆盐的 MRS 液体培养基作为对照，37。
21、静置厌氧培养。每隔 30min 取样，梯度稀释至 10-4 10-6后，采用平板涂布法进行菌落计数 ( 平均值SD)，确定菌株对胃酸的耐受性。0050 表 2 植物乳杆菌 BC299 在 pH2.0 条件下的耐胃酸能力0051 0052 由表2可知，在pH 2.0的条件下，植物乳杆菌BC299在2h内菌活数由(2.511.01)108cfu/mL 下降到 (1.811.58)106cfu/mL，仍有足够数量的活菌可以通过胃部环境。0053 表 3 植物乳杆菌 BC299 对胆盐的耐受性实验0054 0055 由表 3 可知，植物乳杆菌 BC299 在 0.3 (w/v) 的胆盐浓度下，5h 内。
22、其菌活由初始的 5.34107下降到 1.94106cfu/mL，说明该菌株具有良好的胆盐耐受性，可以在肠道中定植并发挥益生作用。0056 实施例 4 ：免疫调节活性分析0057 4.1 体外细胞试验0058 4.1.1 对 BALB/c 小鼠脾细胞增殖的影响0059 颈椎脱臼法处死小鼠，无菌取脾，用 RPMI-1640 培养基进行漂洗，用注射器活塞芯轻轻挤压，过200目尼龙网后离心(1000r/min，5min)，弃去上清，加入红细胞裂解液(RPMI-1640 ：红细胞裂解液2 ：1)，吹打混匀2min，离心(1000r/min，5min)，重复23次，以除去红细胞，得到脾细胞悬液，备用。0。
23、060 将小鼠脾细胞悬液浓度调整至 1106/mL 后加入至 96 孔板中 (180L/ 孔 )，然后加入植物乳杆菌BC299的菌悬液(20L/孔)，细胞:菌体1:10。混匀后，置于饱和湿度、37、5 CO2的细胞培养箱内培养 48h。采用 MTT 法检测植物乳杆菌 BC299 对 BALB/c 小鼠脾细胞增殖的影响，空白对照组为 RPMI-1640 培养基，阳性对照组为脂多糖 (10g/mL)。0061 统计分析结果如表 4 及图 2 所示，以平均值 SD 表示。植物乳杆菌 BC299 可非常显著促进 BALB/c 小鼠脾细胞的增殖 (p0.01)。0062 表 4 植物乳杆菌 BC299 。
24、对 BALB/c 小鼠脾细胞增殖的影响0063 说 明 书CN 104480032 A6/11 页80064 4.1.2 对巨噬细胞株 RAW264.7 的增殖的影响0065 取对数生长期的 RAW264.7 细胞，通过血球计数板计数后，用 RPMI-1640 培养基将细胞浓度调整至 1106个 /mL。然后加入至 96 孔细胞培养板中 (200L/ 孔 )，置于饱和湿度、37、5 CO2培养箱中培养 24h。用 PBS 洗 3 次后，加入植物乳杆菌 BC299 的菌悬液，细胞:菌体1:10。混匀后，置于饱和湿度、37、5CO2的细胞培养箱内培养48h。采用MTT法检测植物乳杆菌 BC299 。
25、对巨噬细胞株 RAW264.7 增殖的影响。空白对照组为 RPMI-1640培养基，阳性对照组为脂多糖 (10g/mL)。0066 统计分析结果如表 5 及图 3 所示，以平均值 SD 表示。植物乳杆菌 BC299 可显著促进巨噬细胞株 RAW264.7 增殖 (p0.01)。0067 表 5 植物乳杆菌 BC299 对巨噬细胞株 RAW264.7 增殖的影响0068 0069 4.2 动物实验0070 4.2.1 菌粉的制备0071 将保存于-80的测试菌植物乳杆菌BC299进行平板划线、镜检、活化及扩大培养，经离心后(4，8000r/min，20min)，弃去上清收集菌泥，将菌泥重悬于适当。
26、的保护剂中，-80下预冻4h后进行真空冷冻干燥，得到本发明的植物乳杆菌BC299菌粉(1.21011cfu/g)。0072 4.2.2 动物来源及日常管理0073 选取 SPF 级 BALB/c 雌性小鼠，18-22g，购自中国食品药品检定研究院，许可证号 ：SCXK( 京 )2009-0017，饲养于天津科技大学食品工程与生物技术学院屏障系统动物实验中心。饲养条件 ：温度为 231，昼夜光照交替 12h，自由摄水和饮食。0074 将 BALB/c 小鼠分为空白对照组与实验组，10 只 / 组。实验组每天灌喂 0.4mL 受试菌株悬浮液 (1109cfu/mL)，空白对照组灌喂无菌生理盐水，0。
27、.4mL/ 只，连续 30d。0075 4.2.3 数据统计分析0076 试验结果以平均值 SD 表示。实验结果采用 SPSS(Windows version 13.0，SPSS Inc.，Chicago，IL，USA) 进行单因素方差分析 (One-Way ANOVA)，均值比较用 Lsd 和 Duncan法。0077 4.2.4BALB/c 小鼠体重的检测0078 试验期间，每 5d 记录一次小鼠的摄食量，每 6d 称量一次小鼠体重，以评估喂食受试益生菌对小鼠生长的影响。0079 表 6 小鼠摄食量的测定结果0080 说 明 书CN 104480032 A7/11 页90081 表 7 小。
28、鼠体重测定结果0082 0083 试验结果如表6、表7以及图4和图5所示，与空白对照组相比，喂食本发明菌株能够提高小鼠摄食量，促进肠道对营养物质的吸收利用，进而增加体重。0084 4.2.5 免疫脏器指数的测定0085 于实验第 30d，颈椎脱臼致死后立刻解剖，摘取胸腺和脾脏，小心去除粘附的其它组织，用吸水纸轻轻吸取表面粘液后进行称重。试验结果以平均值 SD 表示。0086 0087 0088 式 中 ：m1脾脏重量 (mg) ；0089 m2胸腺重量 (mg) ；0090 M体重 (g)。0091 表 8 小鼠免疫脏器指数测定结果0092 0093 注 ：与空白对照组相比，* ：p 0.05。
29、。0094 实验结果由表 8 可知，与空白对照组相比，BALB/c 小鼠在灌喂本发明菌株后，能显著提高 BALB/c 小鼠免疫器官胸腺指数与脾指数 (p0.05)。0095 4.2.6 小鼠血液中白细胞数的测定0096 于实验第30d，对BALB/c小鼠眼眶取血，准确吸血20L，枪头外壁无血，迅速将血轻轻放入盛有 380L 白细胞稀释液中，摇匀。按红细胞计数的方法，将白细胞混悬液滴入计数池内，静置 2-3min，待白细胞下沉后计数。在低倍镜下，白细胞呈圆形，浆透亮，核呈紫黑色，稍有折光，借此特点可与杂质相区别。0097 白细胞数 5 个大格的总数 *500说 明 书CN 104480032 A。
30、8/11 页100098 表 9 BALB/c 小鼠血液中白细胞数测定结果0099 0100 注 ：与空白对照组相比，* ：p 0.01。0101 由表 9 可知，与空白对照组相比，BALB/c 小鼠在灌喂本发明菌株后，血液中的白细胞的数量能非常显著的增加 (p0.01)，说明其能够降低机体免疫系统的损伤程度，起到免疫调节的作用。0102 4.2.7BALB/c 小鼠脾淋巴细胞转化的测定0103 BALB/c 小鼠灌喂受试菌悬液 30d 后，颈椎脱臼致死，无菌摘取脾脏，制备成脾细胞悬液。将小鼠脾细胞悬液浓度调整至 1106个 /mL，加入至 96 孔细胞培养板中 (100L/孔)，分别添加10。
31、0L ConA(终浓度为5g/mL)和LPS(终浓度为10g/mL)，以RPMI-1640培养基为空白对照，每组均设 3 个平行孔，置于饱和湿度、37、5 CO2培养箱中培养 48h。采用 MTT 法测定受试菌株对脾淋巴细胞转化的影响。结果以刺激指数表示如下 ：0104 刺激指数 (SI) 样品组 OD570/ 空白组 OD5700105 结果如图 6 所示，与空白对照组相比，BALB/c 小鼠在灌喂本发明菌株后，能够显著提高其脾淋巴细胞的转化 (p0.05)，说明本发明菌株能够提高 BALB/c 小鼠脾淋巴细胞的免疫水平。0106 4.2.8BALB/c 小鼠脾脏巨噬细胞吞噬活性的测定010。
32、7 BALB/c 小鼠灌喂受试菌悬液 30d 后，颈椎脱臼致死，无菌摘取脾脏，制备成脾细胞悬液。将小鼠脾细胞悬液浓度调整至 1106个 /mL，加入至 96 孔细胞培养板中 (200L/孔 )，置于饱和湿度、37、5 CO2细胞培养箱中培养 2h，弃去上清和未贴壁细胞，PBS 洗 2次，除去未贴壁细胞，则得巨噬细胞。加入 RPMI-1640 细胞培养基 (200L/ 孔 )，置于饱和湿度、37、5的 CO2细胞培养箱中培养 4h，弃去培养基，加入 0.072 (m/v) 中性红溶液(100L/孔)，反应30min后弃去中性红溶液。用PBS液洗2次，加入细胞溶解(V冰醋酸:V乙醇 1:1，100。
33、L/ 孔 )，4过夜，待细胞完全溶解后，酶标仪 570nm 处测定吸光度值。0108 结果如图 7 所示，与空白对照组相比，BALB/c 小鼠在灌喂本发明菌株后，能够非常显著提高其脾脏巨噬细胞的吞噬能力 (p0.01)。说明本发明菌株具有活化巨噬细胞的能力，从而能够提高机体的非特异性免疫功能。0109 4.2.9BALB/c 小鼠 NK 细胞活性的测定0110 靶细胞的制备 ：取处于对数生长期的 H22 肝癌细胞，用 RPMI-1640 培养基洗涤1 次，离心 (1000r/min，5min) 弃去上清液，将细胞沉淀用 RPMI-1640 培养基重悬后计数，并用台盼蓝染色检查活细胞数量 ( 细胞活性应大于 95 )，调整细胞浓度至 1106个 /mL，备用。0111 BALB/c小鼠灌喂受试菌悬液30d后，颈椎脱臼致死，无菌摘取脾脏，制备成脾细胞悬液。将小鼠脾细胞悬液浓度调整至 2107/mL，作为效应细胞。取靶细胞 (H22 细胞 )和效应细胞各 100L( 效靶比 20:1)，加入至 96 孔细胞培养板中，另设效应细胞对照孔、靶细胞对照孔，上述各项均设 3 个平行孔。于饱和湿度、37、5 CO2细胞培养箱中培养 4h，说 明 书CN 104480032 A。