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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201410824320.9(22)申请日 2014.12.26C12N 15/80(2006.01)C12N 1/15(2006.01)C12R 1/685(2006.01)(71)申请人 湖北工业大学地址 430068 湖北省武汉市武昌区南湖李家墩1村1号(72)发明人 薛栋升(74)专利代理机构 武汉科皓知识产权代理事务所 ( 特殊普通合伙 ) 42222代理人 常海涛(54) 发明名称一种表达纤维素外切酶和内切酶双活性蛋白构建纤维素酶高产菌株的方法(57) 摘要本发明公开了一种表达纤维素外切酶和内切酶双活性蛋白构建纤维素酶高产菌株。
2、的方法，属于酶工程领域。该方法为通过同源重组和基因工程技术将具有纤维素外切酶和内切酶双活性蛋白的编码基因整合到黑曲霉热激蛋白基因的位置。首先合成核苷酸序列如 SEQ ID NO.1 所示的同源重组片段，用 SalI酶切该重组片段和pWM1质粒再连接转化 DH5 得到同源重组质粒 ；用该同源重组质粒转化农杆菌，通过农杆菌介导转化得到纤维素酶高产黑曲霉菌株。本发明利用热激表达实现了通过提高温度大幅度增加目的蛋白的表达，从而更显著的提高纤维素外切酶和内切酶的活性，增加纤维素酶的酶活。(51)Int.Cl.(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书1页 说明书5页序列表6页(1。
3、0)申请公布号 CN 104480139 A(43)申请公布日 2015.04.01CN 104480139 A1/1页21.一种表达纤维素外切酶和内切酶双活性蛋白构建纤维素酶高产黑曲霉菌株的方法，其特征在于：为将具有纤维素外切酶和内切酶双活性蛋白的编码基因整合到黑曲霉热激蛋白基因的位置。2.一种纤维素酶高产黑曲霉菌株，其特征在于：为在热激蛋白基因的位置整合有纤维素外切酶和内切酶双活性蛋白编码基因的黑曲霉菌株。3.权利要求2所述的纤维素酶高产黑曲霉菌株的构建方法，其特征在于包含如下步骤：（1）合成黑曲霉热激蛋白基因的前段序列-纤维素外切酶和内切酶双活性蛋白的编码序列-黑曲霉热激蛋白基因的后段序。
4、列的同源重组片段，该同源重组片段两端含有限制性内切酶酶切位点；将该重组片段连接到pWM1质粒上得到同源重组质粒；（2）用同源重组质粒转化农杆菌；（3）通过农杆菌介导转化得到目的菌株。4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于步骤（1）为：合成核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的同源重组片段，用 SalI酶切；将pWM1质粒也用 SalI酶切；将酶切后的重组片段和质粒通过DNA连接酶连接，并转化DH5得到同源重组质粒。权 利 要 求 书CN 104480139 A1/5页3一种表达纤维素外切酶和内切酶双活性蛋白构建纤维素酶高产菌株的方法0001 技术领域0002 本发明属于酶工程领域，具体。
5、涉及一种表达纤维素外切酶和内切酶双活性蛋白构建纤维素酶高产黑曲霉菌株的方法。背景技术0003 纤维素是地球上最丰富的可再生资源，地球上每年因光合作用产生的纤维素达到100亿吨左右，利用纤维素生产生物能源，是缓解能源危机、实现人类可持续发展的关键。0004 纤维素利用的关键是把纤维素降解为可发酵性的糖类-葡萄糖。纤维素的降解需要外切酶、内切酶、葡聚糖苷酶的共同作用。其中，外切酶降解纤维素的晶体结构，是纤维素酶降解纤维素的限速步骤，内切酶降解长片段的纤维素成为二聚体，是纤维素降解的关键步骤。用纤维素酶降解纤维素具有绿色、条件温和、转化率高的特点，但是纤维素较高的生产成本成为纤维素酶降解纤维素的瓶颈。
6、。0005 获得高产纤维素酶的菌株，降低纤维素酶的生产成本成为纤维素酶工业化利用的必由之路。纤维素酶的生产菌株主要有黑曲霉。黑曲霉由于其较高的安全性，被认为是生产纤维素酶最有应用前景的菌株之一。黑曲霉生产的纤维素酶由纤维素内切酶、葡糖苷酶和外切酶组成。其中外切酶破坏纤维素晶体结构，把晶体纤维素降解为可溶性的纤维素片段，该过程是纤维素降解的限速步骤。纤维素的高效降解需要大量的纤维素外切酶。然而，黑曲霉生产的纤维素酶中，葡糖苷酶的活性比外切酶的活性和内切酶的活性高的多。由于黑曲霉产生的纤维素外切酶活性和内切酶活性的不足，致使黑曲霉产生的纤维素酶对天然纤维素的降解效率非常低。因此增加纤维素外切酶和内。
7、切酶的活性，成为提高黑曲霉纤维素酶降解效率的重要措施。0006 现有的增加黑曲霉纤维素酶的方法有和高外切酶活性的纤维素酶混合或黑曲霉菌株与里氏木霉混菌发酵。与高外切酶活性纤维素酶的混合，本身就增加了混合这一道工艺，增加了降解成本。而且高外切酶活性的纤维素酶成本也较高。混菌发酵由于里氏木霉产生毒素，大大限制了纤维素酶的使用范围。0007 已报道的构建黑曲霉纤维素酶高产菌株的方法是导入的基因与黑曲霉已有纤维素酶的基因共同表达，但是表达的酶仅仅具有一种活性，不能同时增加内切酶和外切酶的活性。同时已有的基因工程菌不能通过条件（温度、酸度等）控制单一的大幅度增加某一种酶的表达，对纤维素酶酶系组成的改变有。
8、限。发明内容0008 本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种表达纤维素外切酶和内切酶双活性蛋白构建纤维素酶高产黑曲霉菌株的方法。本发明的目的还在于提供一种基于说 明 书CN 104480139 A2/5页4该方法构建得到的纤维素酶高产黑曲霉菌株。0009 本发明的目的通过下述技术方案实现：一种表达纤维素外切酶和内切酶双活性蛋白构建纤维素酶高产黑曲霉菌株的方法，为通过同源重组和基因工程技术将具有纤维素外切酶和内切酶双活性蛋白的编码基因整合到黑曲霉热激蛋白基因的位置。0010 一种纤维素酶高产黑曲霉菌株，为在热激蛋白基因的位置整合有纤维素外切酶和内切酶双活性蛋白编码基因的黑曲霉菌株。0。
9、011 所述的纤维素酶高产黑曲霉菌株的构建方法优选包含如下步骤：（1）合成黑曲霉热激蛋白基因的前段序列-纤维素外切酶和内切酶双活性蛋白的编码序列-黑曲霉热激蛋白基因的后段序列的同源重组片段，该同源重组片段两端含有限制性内切酶酶切位点；将该重组片段连接到pWM1质粒上得到同源重组质粒。0012 （2）用同源重组质粒转化农杆菌。0013 （3）通过农杆菌介导转化得到目的菌株。0014 优选的，步骤（1）为：合成核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的同源重组片段，用SalI酶切；将pWM1质粒也用 SalI酶切；将酶切后的重组片段和质粒通过DNA连接酶连接，并转化DH5得到同源重组质粒。0015 。
10、本发明通过同源重组技术，合成黑曲霉热激蛋白编码序列的前后两段作为同源重组序列，把具有纤维素内切酶和外切酶的蛋白编码序列连接，通过基因工程技术，让具有纤维素内切酶和外切酶活性的蛋白整合到热激蛋白的位置，构建出热激表达的菌株，构建的菌株纤维素酶的6.7U/g，是出发菌株5.6U/g 的1.2倍。0016 本发明的黑曲霉菌株能够内表达外切酶和内切酶活性的蛋白，为纤维素酶的高产菌株。本发明最大的优点是通过表达一种蛋白，能同时增加外切酶和内切酶的活性，更具有创新意义的是利用热激表达实现了通过提高温度大幅度增加目的蛋白的表达，从而更显著的提高纤维素外切酶和内切酶的活性，增加纤维素酶的酶活。具体实施方式00。
11、17 以下实施例用于进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制，在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换均属于本发明的范围。若为特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。0018 实施例1A、同源重组质粒的构建（1）材料：黑曲霉（ Aspergillus niger）、大肠杆菌（ E.coli） DH5、农杆菌EHA105和质粒 pWM1 均为商业化产品。其中，黑曲霉从 ATCC 购买，菌株编号 ATCC10582；农杆菌 EHA105和质粒pMW1从Biovector公司购买。0019 （2）同源重组片段的合成及酶切合成由黑曲。
12、霉热激蛋白基因的前段同源序列（该序列可能的起始密码子被其它碱基替代以确保转录从双活性蛋白的起始密码子开始，序列如SEQ ID NO.2所示）纤维素外切酶和内切酶双活性蛋白的编码序列（SEQ ID NO.3）黑曲霉热激蛋白基因的后段同源序列说 明 书CN 104480139 A3/5页5（SEQ ID NO.4）组成的同源重组片段（核苷酸序列如SEQ ID NO.1 所示）。0020 往100L该同源重组片段中加入 SalI 酶液 2L（TakaRa 购买），30酶切 16h，酶切后65水浴10min。0021 （3）pWM1 质粒的提取及酶切含有pWM1质粒的大肠杆菌E .coli DH5于L。
13、B中（50g/mL的卡那霉素）37振荡培养12h。取1.5mL菌体于EP管，以4000rpm离心3min，弃上清液。加0.1mL溶液I（1%葡萄糖，50mM EDTA pH8.0，25mM Tris-HCl pH8.0）充分混合。加入0.2mL溶液II（0.2mM NaOH，1% SDS），轻轻翻转混匀，置于冰浴5min。加入0.15mL预冷溶液III（5mol/L KAc，pH4.8），轻轻翻转混匀，冰浴5min。以10000rpm离心20min，取上清液于另一新EP管。加入等体积的异戊醇，混匀后静置10min。再以10000rpm离心20min，弃上清。用70%乙醇0.5mL洗涤一次，抽干。
14、所有液体。待沉淀干燥后，溶于0.05mL TE缓冲液中。0022 提取的 pWM1 质粒 50L 加入 SalI 酶液 2L（TakaRa 购买），30酶切 16h，酶切后65水浴10min。0023 （4）连接酶切的同源重组片段100L和酶切的pWM1质粒20L用5L T4 DNA ligase（TakaRa购买）16连接24h。0024 B、大肠杆菌感受态细胞的制备（1）将E .coli DH5置于LB培养基上，在37下过夜培养。0025 （2）高温灭菌大的离心瓶（250-500mL）以备第二天摇瓶用。0026 （3）准备几瓶灭菌水（总量约1.5 升），保存于冷冻室中以备第二天重悬浮细胞用。
15、。0027 （4）转移0.2-1mL过夜培养物至装有20mL LB（或其他营养丰富的培养基）的100mL摇瓶。0028 （5）37下剧烈振荡培养6 小时。0029 （6）监控培养液OD600值（培养1小时后每半小时测定一次）。0030 （7）当OD600值达到0.5-1.0时，从摇床中取出摇瓶，置于冰上冷却15分钟。0031 （8）细胞在4 5000g 下离心15分钟，弃上清液。0032 （9）用灭菌的冰水重悬浮细胞。先用涡旋仪或吸液管重悬浮细胞于少量体积中（几毫升），然后加水稀释至离心管的2/3体积。0033 （10）照上面步骤重复离心，小心弃去上清液。0034 （11）照上面步骤用灭菌的冰。
16、水重悬浮细胞。0035 （12）离心，弃上清液。0036 （13）用20mL 灭菌的、冰冷后的10%甘油重悬浮细胞。0037 （14）照上面步骤离心，小心弃去上清液（沉淀可能会很松散）。0038 （15）用10% 甘油重悬浮细胞至最终体积为2-3mL。0039 （16）将细胞按150L 等份装入微量离心管，于-80保存。0040 C、连接产物转化大肠杆菌（1）在冰上解冻B步骤制得的感受态细胞。0041 （2）每100L感受态细胞添加10L连接的质粒（A步骤（4）的连接产物），冰上培育约5分钟。说 明 书CN 104480139 A4/5页60042 （3）转移DNA/ 细胞混合物至冷却后的2m。
17、m电穿孔容器中。0043 （4）加载电转化仪，准备好300L LB 培养基。0044 （5）对电穿孔容器进行脉冲（200欧姆，25Fd，2.5 千伏）（检查时间常数，应该在3 以 上 ）。0045 （6）立即添加300L 的LB至电穿孔容器中。0046 （7）37下培养细胞40 分钟至1小时以复原。0047 （8）转移细胞至含有卡那霉素（50g/mL）选择培养基上培养，长出的菌落为含有同源重组质粒（连入同源重组片段的pMW1质粒）的转化子。0048 D、同源重组质粒的提取C步骤得到的转化子37振荡培养12h。取1.5mL菌液于EP管中，以4000rpm离心3min，弃上清液。加0.1mL溶液I。
18、（1%葡萄糖，50 mM EDTA pH 8.0，25mM Tris-HCl pH 8.0）充分混合。加入0.2mL溶液II（0.2mM NaOH，1% SDS），轻轻翻转混匀，置于冰浴5min。加入 0.15mL 预冷溶液 III（5mol/L KAc，pH4.8），轻轻翻转混匀，冰浴 5min。以 10000rpm离心20min，取上清液于另一新EP管中。加入等体积的异戊醇，混匀后静置10min。再以10000rpm离心20min，弃上清。用70%乙醇0.5mL洗涤一次，抽干所有液体。待沉淀干燥后，溶于0.05mL TE缓冲液中。0049 E、同源重组质粒转化农杆菌农杆菌感受态的制备：液体。
19、保存的农杆菌EHA105涂布于LB培养基上，28培养，等到单菌落长出后，挑取单菌落，接种于5mL的液体培养基中，28、150r/m培养24h，按照1:10的接种比例接种于5mL新鲜的液体培养基中，28、150r/m培养24h。培养的菌体冰浴40min，5000r/m离心5min，用10mL的0.02mol/L CaCl2菌体重悬菌体。再次5000r/m离心5min，菌体悬浮于1mL的0.02mol/L CaCl2溶液，放置于冰上保藏。0050 取提取的同源重组质粒1L与40L的农杆菌感受态悬液混合，轻轻摇动混合5min后，在液氮上迅速冰冻5min，37水浴5min。加入 1mL液体LB培养基，。
20、28轻轻震荡4h。菌体5000r/m离心5min，弃去上清液，加入LB培养基50L，震荡重新悬浮液体。液体涂布于含有50g/mL卡那霉素LB平板上，长出的菌落接种于含有50g/mL卡那霉素的LB液体培养基中28、150r/m培养24h。0051 F、农杆菌介导转化黑曲霉黑曲霉接种于PDA培养基斜面上，37培养72h，用灭菌的蒸馏水冲洗下孢子，孢子用蒸馏水稀释到108个孢子/mL。孢子与等体积的含有同源重组质粒的农杆菌混合均匀，加入乙酰丁香酮至200mol/L，30避光培养24h。然后把孢子涂布在平板上（200g土豆用自来 1L 水煮沸 30min，纱布过滤，加入 20g 葡萄糖、20g 可溶性。
21、淀粉、20g 琼脂、200mol 头孢噻肟、200mg潮霉素B），30培养到长出菌落。0052 长出的菌落分别接种到斜面上（200g土豆用自来1L水煮沸30min，纱布过滤，加入20g葡萄糖、20g琼脂），30培养72h，用接种环刮取孢子，接种到麸皮培养基中（麸皮:自来水=1:3（W/W），每个250mL三角瓶装入30g麸皮培养基，30培养4d，然后升温到39保温12h，降温到28培养1d。逐一测定每个转化子的纤维素酶酶活，酶活高的为转化子。筛选得到一个纤维素酶酶活达到6.7U/g的菌株，是出发菌株5.6U/g的1.2倍。对筛选的菌株进一步测序证实纤维素外切酶和内切酶双活性蛋白的编码基因已整合。
22、到黑曲霉热激说 明 书CN 104480139 A5/5页7蛋白基因的位置，表明本发明表达纤维素外切酶和内切酶双活性蛋白构建纤维酶高产菌株构建成功。0053 将上述筛选的菌株接种到斜面上（200g土豆用自来1L水煮沸30min，纱布过滤，加入20g葡萄糖、20g琼脂），30培养72h，用接种环刮取孢子，接种到麸皮培养基中（麸皮:自来水 =1:3（W/W），250mL 三角瓶装入 30g 麸皮培养基，28培养 5.5d。测定酶活为 5.9U/g，这说明没有热激，纤维素酶酶活没有热激的酶活高，说明热激表达策略使纤维素酶的酶活提高。0054 纤维素酶酶活的测定方法：取发酵结束时的培养基5.0g，加入。
23、0.05M柠檬酸缓冲液50mL，200r/m浸提30min，滤纸过滤得到酶液。在50进行酶降解反应。在25mL试管中加入 10mL pH 5.0 的 0.05M 柠檬酸缓冲液，滤纸条（0.5cm2cm）两片作为底物，加入发酵液离心后上清液2mL，在水浴锅中50保温30min，然后用沸水煮沸5min，用DNS法测定还原糖的含量。酶活定义为：每分钟释放出1mol还原糖所需要的酶量为一个酶活单位U。说 明 书CN 104480139 A1/6页8SEQUENCE LISTING湖北工业大学一种表达纤维素外切酶和内切酶双活性蛋白构建纤维素酶高产菌株的方法14PatentIn version 3.512。
24、296DNAArtificial Sequence同源重组片段1ccgtcgactt gtctgccgag actttcgagt tccaggctga gatctctcag ctcctctccc 60tcatcatcaa cactgtctac tccaacaagg agattttcct gcgtgagctg atctccaacg 120cctccgatgc tctggacaag attcgctatg agtccctgtc cgacccctcc aagctcgact 180cgggcaagga tctccgcatc gacctgatcc ccaacgccga ggccaagacc ctcacca。
25、tcc 240gtgataccgg tatcggtatg accaaggctg taagtttttc tttcctatca ctccccgctc 300tttcttctgc cattgagcgg taccctctta cgattagagt gaattctgac tttgtgggct 360ttttttagga cctcatcaac aacctcggta ccattgctcg ctctggtact aagcagttca 420tggaggctct ctccgctggt gctgatatct ccttgaatcc gtgatatttc atcaaaggaa 480ttgattaagg aaatga。
26、attt cggttggaat ttaggtaata ctatggatgc tcaatgtatt 540序 列 表CN 104480139 A2/6页9gaatacttaa attatgaaaa ggatcaaact gcttcagaaa cttgctgggg taatccaaag 600actactgaag atatgttcaa ggttttaatc gacaaccaat ttaatgtctt ccgtattcca 660actacttggt ctggtcactt cggtgaagct ccagattata agattgatga aaaatggtta 720aagagagttc atgaag。
27、ttgt tgattatcca tacaagaacg gagcatttgt tatcttaaat 780cttcatcatg aaacctggaa tcatgccttc tctgaaactc ttgatacagc caaggaaatt 840ttagaaaaga tctggtctca aattgctgaa gaatttaagg attatgatga acacttaatc 900ttcgaaggat taaacgaacc aagaaagaat gatactccag ttgaatggac tggtggtgat 960caagaaggtt gggatgctgt taatgctatg aatgctgt。
28、tt tcttaaagac tgttcgtagt 1020gctggtggta ataatccaaa gcgtcatctt atgattccac catatgctgc tgcttgtaat 1080gaaaactcat tcaacaactt tatcttccca gaagatgatg ataaggttat tgcttctgtt 1140catgcctatg ctccatacaa ctttgcctta aataacggtg aaggagctgt tgataagttt 1200gatgcagctg gtaagagaga tcttgaatgg aacattaatt taatgaagaa gagatt。
29、tgtt 1260gatcaaggta ttccaatgat tcttggtgaa tatggtgcta tgaaccgtga caatgaagaa 1320gatcgtgcta cttgggctga attctacatg gaaaaggtta ctgctatggg agttccacaa 1380atctggtggg ataatggtgt cttcgaaggt actggtgaac gttttggtct tcttgatcgt 1440aagaacttaa agattgttta tccaactatt gttgctgctt tacaaaaggg tagaggttta 1500gaagttaatg 。
30、ttgttcatgc tattgaaaaa gaaacagagg aataagtatg cccgagcacc 1560agaagcagat ctactacatc accggcgagt ccatcaaggc cgttgccaag tctcccttcc 1620tggacagcct caagcagaag aacttcgagg ttctgttcct ggttgacccc attgacgagt 1680序 列 表CN 104480139 A3/6页10acgccttcac tcagctgaag gagttcgacg gcaagaagct ggtcgacatc accaaggact 1740tcgagc。
31、ttga ggagtccgag gaggagaagg ctgagcgcga gaaggaggag aaggagttcg 1800agggtctcgc caagagcctc aagaacatcc tcggcgacaa ggtcgagaag gtcgttgtct 1860cccacaagct cgttggctct ccttgcgcca tccgtaccgg ccagttcggt tggtccgcta 1920acatggagcg tatcatgaag gcccaggccc tccgtgacac ctccatgagc tcttacatgt 1980cctccaagaa gactttcgag atct。
32、ctccca agtcctctat catcaaggag ctccgcaaga 2040aggttgaggc cgatggcgag ggtgaccgca ctgtcaagtc catcactcag ctgctcttcg 2100agacctctct cctggtctcc ggtttcacca ttgaggagcc cgccagcttc gctgagcgca 2160tccacaagct cgtctccctt ggtctgaaca tcgacgagga ggctgagacc accgaggaga 2220aggctgctga ggaggctgcc cctgccgccg ccgctgccga ga。
33、gctccatg gaggaggttg 2280actaaccgtc gacttt 22962456DNAArtificial Sequence黑曲霉热激蛋白基因的前段同源序列2ccgtcgactt gtctgccgag actttcgagt tccaggctga gatctctcag ctcctctccc 60tcatcatcaa cactgtctac tccaacaagg agattttcct gcgtgagctg atctccaacg 120cctccgatgc tctggacaag attcgctatg agtccctgtc cgacccctcc aagctcgact 180cgggcaagga tctccgcatc gacctgatcc ccaacgccga ggccaagacc ctcaccatcc 240序 列 表CN 104480139 A。