血液直接PCR法检测叶酸代谢相关基因多态性的引物、引物组、试剂盒及检测方法.pdf

本发明涉及分子生物学检测，尤其涉及一种血液直接PCR法检测叶酸代谢相关基因多态性的引物、引物组、试剂盒及检测方法。引物组包含以下引物对：1)正向引物MTRR-PF，其核苷酸序列SEQ ID NO.1:atgccttgaagtgatgag；反向引物MTRR-PR，其核苷酸序列SEQ ID NO.2:actgtaacggctctaacc;2)正向引物MTHFR-677PF；反向引物MTHFR-677PR;3)正向引物MTHFR-1298PF；反向引物MTHFR-1298PR。本发明无需抽提人基因组DNA即可判断检测基因多态性。

权利要求书
1.   血液直接PCR法检测叶酸代谢相关基因多态性的引物，其特征在于包括以下引物对：
（1）正向引物MTRR-PF，其核苷酸序列SEQ ID NO.1: atgccttgaagtgatgag；
反向引物MTRR-PR，其核苷酸序列SEQ ID NO.2: actgtaacggctctaacc; 和/或
（2）由正向引物MTRR-PF或反向引物MTRR-PR的核苷酸序列经增加、缺失或替换单个核苷酸得到的引物；
上述引物对应的目的基因为5,10- 亚甲基四氢叶酸还原酶基因，以该基因为模板扩增所得DNA片段包含rs1801133 号SNP 位点。

2.   血液直接PCR法检测叶酸代谢相关基因多态性的引物，其特征在于包括以下引物对：
（1）正向引物MTHFR-677PF，其核苷酸序列SEQ ID NO.3: AGGACAGTGTGGGAGTTTGG；
反向引物MTHFR-677PR，其核苷酸序列SEQ ID NO.4: GAAAAGCTGCGTGATGATGA; 和/或
（2）由正向引物MTHFR-677PF或反向引物MTHFR-677PR的核苷酸序列经增加、缺失或替换单个核苷酸得到的引物；
上述引物对应的目的基因为5,10- 亚甲基四氢叶酸还原酶基因，以该基因为模板扩增所得DNA片段包含rs1801131号SNP 位点。

3.   血液直接PCR法检测叶酸代谢相关基因多态性的引物，其特征在于包括以下引物对：
（1）正向引物MTHFR-1298PF，其核苷酸序列SEQ ID NO.5: CCAGACCAAAGAGTTACATCTACCG；
反向引物MTHFR-1298PR，其核苷酸序列SEQ ID NO.6: CTTACCCTTCTCCCTTTGCCA; 和/或
（2）由正向引物MTHFR-1298PF或反向引物MTHFR-1298PR的核苷酸序列经增加、缺失或替换单个核苷酸得到的引物；
上述引物对应的目的基因为甲硫氨酸合成酶还原酶基因，以该基因为模板扩增所得DNA片段包含rs1801394号SNP 位点。

4.   血液直接PCR法检测叶酸代谢相关基因多态性的引物组，其特征在于：所述引物组包含以下引物对：
1) 正向引物MTRR-PF，其核苷酸序列SEQ ID NO.1: atgccttgaagtgatgag；
反向引物MTRR-PR，其核苷酸序列SEQ ID NO.2: actgtaacggctctaacc;
2) 正向引物MTHFR-677PF，其核苷酸序列SEQ ID NO.3: AGGACAGTGTGGGAGTTTGG；
反向引物MTHFR-677PR，其核苷酸序列SEQ ID NO.4: GAAAAGCTGCGTGATGATGA;
3) 正向引物MTHFR-1298PF，其核苷酸序列SEQ ID NO.5: CCAGACCAAAGAGTTACATCTACCG；
反向引物MTHFR-1298PR，其核苷酸序列SEQ ID NO.6: CTTACCCTTCTCCCTTTGCCA。

5.   血液直接PCR法检测叶酸代谢相关基因多态性的试剂盒，其特征在于：试剂盒包括2×Taq Master Mix，权利要求4所述的引物组和去离子水ddH2O。

6.   根据权利要求5所述的血液直接PCR法检测叶酸代谢相关基因多态性的试剂盒，其特征在于：所述2×Taq Master Mix的配方是：0.04-0.06U/ml HaemoTaq酶、0.4-0.6mM dNTP，50-70mM Tricine，4-6mM (NH4)2SO4，2.5-4.5mM MgCl2，4-7%甘油，pH 8-9（25℃），90-110ng/ml T4 32 gene。

7.   根据权利要求5所述的血液直接PCR法检测叶酸代谢相关基因多态性的试剂盒，其特征在于：所述2×Taq Master Mix的配方是：0.05U/ml HaemoTaq酶、0.5mM dNTP，60mM Tricine，5mM (NH4)2SO4，3.5mM MgCl2，6%甘油，pH 8.7（25℃），100ng/ml T4 32 gene。

8.   血液直接PCR法检测叶酸代谢相关基因多态性的检测方法，其特征在于：所述方法包括利用权利要求5-7任一项所述试剂盒进行PCR反应，将所得的PCR反应产物测序，在测序图上分析突变位点。

9.   根据权利要求8所述的血液直接PCR法检测叶酸代谢相关基因多态性的检测方法，其特征在于：所述方法包括配制PCR反应体系，每个样本共计3个反应，具体为：
MTRR(A66G)突变：

MTHFR(C677T)突变：

MTHFR(A1298C)突变：
。

10.   根据权利要求8所述的血液直接PCR法检测叶酸代谢相关基因多态性的检测方法，其特征在于：所述方法包括PCR反应具体程序的设置，具体为：
。

说明书血液直接PCR法检测叶酸代谢相关基因多态性的引物、引物组、试剂盒及检测方法
技术领域
本发明涉及分子生物学检测，尤其涉及一种血液直接PCR法检测叶酸代谢相关基因多态性的引物、引物组、试剂盒及检测方法。
背景技术
叶酸属B族维生素，是合成核酸所必须的元素，是细胞生长和组织修复所必需的物质，更是胚胎发育过程中不可缺少的营养素。近年来大量研究已经证实，叶酸缺乏是导致出生缺陷的主要原因。叶酸的临床功能除了预防胎儿神经管缺陷外，还能降低孕妇妊娠高血压、自发性流产和胎儿宫内发育迟缓、早产以及新生儿低出生体重等发病率。
科学研究发现，叶酸利用能力受遗传结构（基因）影响，如果与叶酸代谢相关的酶活性偏低（即相关基因功能异常），这一人群如按常量（400微克/天）补充叶酸，机体叶酸水平也会不足。遗传体质的差异导致了机体对叶酸利用能力的差异，因此，叶酸增补应因人而异，增补过多或过少都不利于胎儿健康和孕妇健康。
科学研究已经证实，与甲基类维生素（叶酸及维生素B12）代谢密切相关的基因是MTHFR和MTRR。MTHFR编码蛋白5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶，MTRR编码蛋白甲硫氨酸合成酶还原酶。MTHFR和MTRR基因变异会引起相应的酶活性降低，阻抑同型半胱氨酸转化为甲硫氨酸，导致低叶酸血症和高同型半胱氨酸血症，从而增加新生儿出生缺陷风险或自发性流产等风险。
MTHFR全称5,10-methylenetetrahydrofolatereductase（5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶），位于一号染色体lp36.3位置。MTHFE全长19.3kb，mRNA全长7105bp，共有外显子12个，编码共有657个氨基酸编码子的蛋白。亚甲基四氢叶酸还原酶催化5,10-亚甲基四氢叶酸转换成5-甲基四氢叶酸盐，使之能为同型半胱氨酸提供甲基甲硫氨酸。该酶是人体叶酸代谢中的一个十分重要的酶。
MTRR全称5-methyltetrahydrofolate-homocysteinemethyltransferase reductase,编码甲硫氨酸合成酶还原酶，位于5p15.3-p15.2。MTRR基因全长32021 kb，mRNA全长3274bp，共有15个外显子，编码具有726个氨基酸的蛋白质。甲硫氨酸是蛋白质合成和一碳代谢的必须氨基酸，它的合成是由甲硫氨酸合酶（MTR编码）催化的，而甲硫氨酸合酶因为辅助因子维生素B12被氧化而最终失活。MTRR编码的甲硫氨酸合成酶还原酶能够通过还原型甲基化作用重新生成具有功能活性的甲硫氨酸合酶。甲硫氨酸合成酶还原酶是具有电子转移作用的铁氧化还原蛋白-NADP（+）还原酶（ferredoxin-NADP（+）reductase，FNR）家族成员。MTRR突变是造成叶酸/甲基维生素缺乏症的主要病因。
CN103834733A(2014-6-4)公开了一种单管联合测定乙醛脱氢酶2基因与亚甲基四氢叶酸还原酶基因突变位点的试剂盒及其测定方法，所述试剂盒包括：全血基因组DNA提取试剂、多重PCR扩增引物、多重PCR扩增反应试剂、单链DNA分离和纯化试剂、焦磷酸测序引物、焦磷酸测序试剂和盒体。所述方法：人类全血基因组DNA提取；多重PCR扩增反应；单链DNA样本分离和纯化；焦磷酸测序与结果分析。用途：希望了解个体对乙醇和叶酸代谢能力情况的健康体检者；预测个体对硝酸甘油代谢能力和疗效，指导心梗患者合理选择和备用血管舒张急救药物；预测个体对叶酸的代谢能力，指导孕产妇和儿童补充适合剂量的叶酸补充剂等。然而该方法需要抽提基因组DNA。
目前市面上检测5，10- 亚甲基四氢叶酸还原酶基因(MTHFR)、甲硫氨酸合成酶还原酶基因(MTRR) 上的3 个SNP 位点多态性的方法都是需要从人全血或口腔上皮组织中抽提人基因组DNA，然后在荧光定量PCR仪上，利用荧光探针或荧光染料法进行荧光定量PCR，根据荧光信号强弱或溶解曲线来判断突变类型。这些方法虽然可以做到当天出结果，但是不适合国内二三线城市的医院或妇幼保健院内检测。原因如下：
1、荧光定量PCR仪价格昂贵，国产仪器售价也超过三十万元，不是所有医院都能配备；
2、试剂盒在不同厂家或不同型号的荧光定量PCR仪上判读方法或结果不一致，需要做预实验或测序验证后才能大规模检测；
3、需要抽提基因组DNA，额外增加检测人员工作量及检测成本，并且容易造成样本污染。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种无需抽提人基因组DNA，而从全血直接PCR，无需昂贵的荧光定量PCR仪，检测5,10- 亚甲基四氢叶酸还原酶基因上rs1801133 号SNP 位点的血液直接PCR法检测叶酸代谢相关基因多态性的引物。
本发明的目的之二是提供一种无需抽提人基因组DNA，而从全血直接PCR，无需昂贵的荧光定量PCR仪，检测5,10- 亚甲基四氢叶酸还原酶基因上rs1801131 号SNP位点的血液直接PCR法检测叶酸代谢相关基因多态性的引物。
本发明的目的之三是提供一种无需抽提人基因组DNA，而从全血直接PCR，无需昂贵的荧光定量PCR仪，检测甲硫氨酸合成酶还原酶基因上rs1801394 号SNP位点的血液直接PCR法检测叶酸代谢相关基因多态性的引物。
本发明的目的之四是提供一种无需抽提人基因组DNA，而从全血直接PCR，无需昂贵的荧光定量PCR仪，同时检测5,10- 亚甲基四氢叶酸还原酶基因上rs1801133 号SNP 位点、5,10- 亚甲基四氢叶酸还原酶基因上rs1801131 号SNP 和甲硫氨酸合成酶还原酶基因上rs1801394 号SNP 位点的血液直接PCR法检测叶酸代谢相关基因多态性的引物组。
本发明的目的之五是提供一种无需抽提人基因组DNA，而从全血直接PCR，无需昂贵的荧光定量PCR仪，同时检测5,10- 亚甲基四氢叶酸还原酶基因上rs1801133 号SNP 位点、5,10- 亚甲基四氢叶酸还原酶基因上rs1801131 号SNP 和甲硫氨酸合成酶还原酶基因上rs1801394 号SNP 位点的、通过PCR产物测序来判断的血液直接PCR法检测叶酸代谢相关基因多态性的试剂盒。
本发明的目的之六是提供一种无需抽提人基因组DNA，而从全血直接PCR，无需昂贵的荧光定量PCR仪，同时检测5,10- 亚甲基四氢叶酸还原酶基因上rs1801133 号SNP 位点、5,10- 亚甲基四氢叶酸还原酶基因上rs1801131 号SNP 和甲硫氨酸合成酶还原酶基因上rs1801394 号SNP 位点的、通过PCR产物测序来判断的血液直接PCR法检测叶酸代谢相关基因多态性的检测方法。
本发明的第一技术目的是通过以下技术方案得以实现的：
血液直接PCR法检测叶酸代谢相关基因多态性的引物，其包括以下引物对：
（1）正向引物MTRR-PF，其核苷酸序列SEQ ID NO.1: atgccttgaagtgatgag；
反向引物MTRR-PR，其核苷酸序列SEQ ID NO.2: actgtaacggctctaacc; 和/或
（2）由正向引物MTRR-PF或反向引物MTRR-PR的核苷酸序列经增加、缺失或替换单个核苷酸得到的引物；
上述引物对应的目的基因为5,10- 亚甲基四氢叶酸还原酶基因，以该基因为模板扩增所得DNA片段包含rs1801133 号SNP 位点。
本发明设定并合成特定的所述特异性引物，可检测5,10- 亚甲基四氢叶酸还原酶基因上rs1801133 号SNP 位点。
本发明的第二技术目的是通过以下技术方案得以实现的：
血液直接PCR法检测叶酸代谢相关基因多态性的引物，其包括以下引物对：
（1）正向引物MTHFR-677PF，其核苷酸序列SEQ ID NO.3: AGGACAGTGTGGGAGTTTGG；
反向引物MTHFR-677PR，其核苷酸序列SEQ ID NO.4: GAAAAGCTGCGTGATGATGA; 和/或
（2）由正向引物MTHFR-677PF或反向引物MTHFR-677PR的核苷酸序列经增加、缺失或替换单个核苷酸得到的引物；
上述引物对应的目的基因为5,10- 亚甲基四氢叶酸还原酶基因，以该基因为模板扩增所得DNA片段包含rs1801131号SNP 位点。
本发明设定并合成特定的所述特异性引物，可检测5,10- 亚甲基四氢叶酸还原酶基因上rs1801131 号SNP位点。
本发明的第三技术目的是通过以下技术方案得以实现的：
血液直接PCR法检测叶酸代谢相关基因多态性的引物，其包括以下引物对：
（1）正向引物MTHFR-1298PF，其核苷酸序列SEQ ID NO.5: CCAGACCAAAGAGTTACATCTACCG；
反向引物MTHFR-1298PR，其核苷酸序列SEQ ID NO.6: CTTACCCTTCTCCCTTTGCCA; 和/或
（2）由正向引物MTHFR-1298PF或反向引物MTHFR-1298PR的核苷酸序列经增加、缺失或替换单个核苷酸得到的引物；
上述引物对应的目的基因为甲硫氨酸合成酶还原酶基因，以该基因为模板扩增所得DNA片段包含rs1801394号SNP 位点。
本发明设定并合成特定的所述特异性引物，可检测甲硫氨酸合成酶还原酶基因上rs1801394 号SNP位点。
本发明的第四技术目的是通过以下技术方案得以实现的：
血液直接PCR法检测叶酸代谢相关基因多态性的引物组，所述引物组包含以下引物对：
1) 正向引物MTRR-PF，其核苷酸序列SEQ ID NO.1: atgccttgaagtgatgag；
反向引物MTRR-PR，其核苷酸序列SEQ ID NO.2: actgtaacggctctaacc;
2) 正向引物MTHFR-677PF，其核苷酸序列SEQ ID NO.3: AGGACAGTGTGGGAGTTTGG；
反向引物MTHFR-677PR，其核苷酸序列SEQ ID NO.4: GAAAAGCTGCGTGATGATGA;
3) 正向引物MTHFR-1298PF，其核苷酸序列SEQ ID NO.5: CCAGACCAAAGAGTTACATCTACCG；
反向引物MTHFR-1298PR，其核苷酸序列SEQ ID NO.6: CTTACCCTTCTCCCTTTGCCA。
5,10- 亚甲基四氢叶酸还原酶基因上rs1801133 号SNP 位点、5,10- 亚甲基四氢叶酸还原酶基因上rs1801131 号SNP 和甲硫氨酸合成酶还原酶基因上rs1801394 号SNP 位点是目前已公认的会引起叶酸代谢障碍的基因突变。这三个基因多态性位点分别是MTRR(A66G),MTHFR(C677T),MTHFR(A1298C)。本发明无需抽提人基因组DNA，而从全血直接PCR，无需昂贵的荧光定量PCR仪，通过所述引物可同时检测5,10- 亚甲基四氢叶酸还原酶基因上rs1801133 号SNP 位点、5,10- 亚甲基四氢叶酸还原酶基因上rs1801131 号SNP 和甲硫氨酸合成酶还原酶基因上rs1801394 号SNP 位点。
叶酸代谢有关基因多态性

本发明的第五技术目的是通过以下技术方案得以实现的：
血液直接PCR法检测叶酸代谢相关基因多态性的试剂盒，试剂盒包括2×Taq Master Mix，权利要求4所述的引物组和去离子水ddH2O。
作为优选，所述2×Taq Master Mix的配方是：0.04-0.06U/ml HaemoTaq酶、0.4-0.6mM （毫摩尔）dNTP，50-70mM Tricine（N-三(羟甲基)甲基甘氨酸），4-6mM (NH4)2SO4，2.5-4.5mM MgCl2，4-7%甘油，pH 8-9（25℃），90-110ng/ml T4 32 gene（T4噬菌体基因32编码蛋白）。其中，ml指微升，10-6升。
HaemoTaq酶，该酶是截短后的 Taq DNA聚合酶，它缺失了5'-3'外切酶活性，可购自上海近岸科技有限公司。
作为优选，所述2×Taq Master Mix的配方是：0.05U/ml HaemoTaq酶、0.5mM dNTP，60mM Tricine，5mM (NH4)2SO4，3.5mM MgCl2，6%甘油，pH 8.7（25℃），100ng/ml T4 32 gene。
本发明的第六技术目的是通过以下技术方案得以实现的：
血液直接PCR法检测叶酸代谢相关基因多态性的检测方法，其所述方法包括利用本发明试剂盒进行PCR反应，将所得的PCR反应产物测序，在测序图上分析突变位点。
作为优选，所述方法包括配制PCR反应体系，每个样本共计3个反应，具体为：
MTRR(A66G)突变：

MTHFR(C677T)突变：

MTHFR(A1298C)突变：
。
作为优选，所述方法包括PCR反应具体程序的设置，具体为：

可使用杭州晶格KF960 PCR仪进行反应。
本发明检测试剂盒有如下优点：
1、血液成分复杂，里面含有很多抑制PCR反应的因子，血浆、血红蛋白和乳铁蛋白等会抑制Taq酶活性，扩增效率下降，还有一些成分会使引物发生降解，从而造成全血直接PCR的失败。我们设计了特异性PCR引物，使用经过改造的Taq酶和减少血液中抑制因子影响的PCR缓冲液，配制了适合全血PCR的反应体系，使之耐受全血中PCR抑制剂。
2、PCR条件宽泛，无需预实验，适用于多数普通PCR仪。
3、PCR模板为全血，无论是EDTA抗凝，肝素抗凝还是柠檬酸钠抗凝，都适用。无需抽提基因组DNA，所以不需要额外购买基因组DNA抽提试剂盒，节约成本，同时减少污染机会，适合大规模样本的检测。
4、所需全血样本极少，最少只需2ul，且对在4度冰箱保存7天内的血液样本，检测结果稳定，有利于复查，或者可以利用病人其他检测的血液样本，无需病人专门采血，减轻病人痛苦。
5、PCR产物直接外送商业化公司测序，无需电泳纯化，减少工作量。同时，在测序图上分析突变位点，一目了然，准确率100%。操作简单，成本低廉，快捷准确高通量，满足二三线城市普通医院的检测。
附图说明
图1是本发明PCR检测方法凝胶电泳结果图；
图2是本发明实施例一不同抗凝来源的血液PCR凝胶电泳结果图;
图3是本发明实施例二PCR结果电泳图；
图4是本发明实施例三不同退火温度的MTRR(A66G)突变 PCR电泳图；
图5是本发明实施例三不同退火温度的MTHFR(C677T)突变 PCR电泳图；
图6是本发明实施例三不同退火温度的MTHFR(A1298C)突变 PCR电泳图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明作进一步详细说明。
叶酸代谢有关基因多态性

PCR检测方法凝胶电泳结果图见图1，
M：DL2000分子Marker，从上到下依次为2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp。其中750bp是亮带。
1：MTRR(A66G)突变
2：MTHFR(C677T)突变
3：MTHFR(A1298C)突变
电泳结果表明，PCR产物大小与预期一致，条带清晰，无杂带，说明PCR体系、反应条件以及引物特异性非常好。
PCR产物交由上海美吉生物科技有限公司测序。各种突变类型的测序结果如下：。
PCR产物序列如下，其中，PCR产物序列划横线为引物结合部位，斜体部分为基因外显子，黑色加粗为内含子，双划线部位为SNP位点。
MTRR  A66G：
ATGCCTTGAAGTGATGAGGAGGTTTCTGTTACTATATGCTACACAGCAGGGACAGGCAAAGGCCATCGCAGAAGAAATA/GTGTGAGCAAGCTGTGGTACATGGATTTTCTGCAGATCTTCACTGTATTAGTGAATCCGATAAGgttagagccgttacagt。
MTHFR   C677T：
ggaaggtgcaagatcagagcccccaaagcagaggactctctctgcccagtccctgtggtctcttcatccctcgccttgaacaggtggaggccagcctctcctgactgtcatccctattggcagGTTACCCCAAAGGCCACCCCGAAGCAGGGAGCTTTGAGGCTGACCTGAAGCACTTGAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGAGC/TCGATTTCATCATCACGCAGCTTTTCTTTGAGGCTGACACATTCTTCCGCTTTGTGAAGGCATGCACCGACATGGGCATCACTTGCCCCATCGTCCCCGGGATCTTTCCCATCCAGgtgaggggcccaggagagcccataagctccctccaccccactctcaccgcaccgtcctcgcacaggctgggggctctgggtggagtgctgagttcgctgagttcttcccag。
MTHFR  A1298C：
CCAGACCAAAGAGTTACATCTACCGTACCCAGGAGTGGGACGAGTTCCCTAACGGCCGCTGgtgagggcctgcagaccttccttgcaaatacatctttgttcttgggagcgggagggcagaagaagtttgcatgcttgtggttgacctgggaggagtcaggggcagaatttacaggaatggcctcctgggcatgtggtggcactgccctctgtcaggagtgtgccctgacctctgggcacccctctgccagGGGCAATTCCTCTTCCCCTGCCTTTGGGGAGCTGAAGGACTACTACCTCTTCTACCTGAAGAGCAAGTCCCCCAAGGAGGAGCTGCTGAAGATGTGGGGGGAGGAGCTGACCAGTGAAGA/CAAGTGTCTTTGAAGTCTTCGTTCTTTACCTCTCGGGAGAACCAAACCGGAATGGTCACAAAgtgagtgatgctggagtggggaccctggttcatcccctgcccctggcctgaccccagctgcaggccaggctgcggggctgtgacttccccatcctgtgccctcccctccatgctgtggacatggcaaagggagaagggtaag。
实施例一
不同抗凝来源的血液样本的PCR 不同抗凝不同采集同一人的新鲜血液，分别收集在EDTA抗凝管，肝素钠抗凝管和柠檬酸钠抗凝管内，各编号为A,B,C。
按以下方法配制PCR反应液，



PCR反应条件如下：

不同抗凝来源的血液PCR电泳图见图2，其中
M：DL2000分子Marker，从上到下依次为2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp。其中750bp是亮带。
1：EDTA抗凝血的MTRR(A66G)突变 PCR；
2：EDTA抗凝血的MTHFR(C677T)突变 PCR；
3：EDTA抗凝血的MTHFR(A1298C)突变 PCR；
4：肝素钠抗凝血的MTRR(A66G)突变 PCR；
5：肝素钠抗凝血的MTHFR(C677T)突变 PCR；
6：肝素钠抗凝血的MTHFR(A1298C)突变 PCR；
7：柠檬酸钠抗凝血的MTRR(A66G)突变 PCR；
8：柠檬酸钠抗凝血的MTHFR(C677T)突变 PCR；
9：柠檬酸钠抗凝血的MTHFR(A1298C)突变 PCR。
电泳结果表明：不同抗凝方法来源的血液在该PCR反应体系中都能获得预期的结果，PCR条带清晰，无杂带。测序结果验证这三种抗凝方法来源的血液突变位点一致。
实施例二
新鲜抽取的血液分成三组，第一组用天根公司的血液基因组DNA抽提试剂盒按照试剂盒说明书抽提血液基因组DNA，检测基因组DNA浓度，用ddH2O稀释到100ng/ul后PCR；第二组新鲜血液直接血液PCR，第三组在4℃冰箱放置7天（7D）后直接血液PCR。的EDTA抗凝血的PCR。PCR方法按照实例1。PCR结果见图3。
图3中的
1：4度保存7天的血液MTRR(A66G)突变 PCR；
2：4度保存7天的血液MTHFR(C677T)突变 PCR；
3：4度保存7天的血液MTHFR(A1298C)突变 PCR；
4：新鲜血液MTRR(A66G)突变 PCR；
5：新鲜血液MTHFR(C677T)突变 PCR；
6：新鲜血液MTHFR(A1298C)突变 PCR；
7：血液抽提基因组DNA 的MTRR(A66G)突变 PCR；
8：血液抽提基因组DNA MTHFR(C677T)突变 PCR；
9：血液抽提基因组DNA MTHFR(A1298C)突变 PCR。
电泳和测序验证突变结果表明，本发明试剂盒对4℃冰箱放置7天的血液样本同样有效，与新鲜血液提取基因组DNA后再PCR的结果一致。
实施例三
不同PCR反应程序对实验结果的影响
因为，虽然实验人员在PCR仪上设置了相同的PCR程序，但由于不同的PCR仪升降温速度会有差异，这种差异会导致各温度反应时间的差异。影响PCR结果关键的步奏是退火，所以我们采用晶格梯度PCR仪来验证不同的PCR反应条件，主要是退火温度对PCR结果的影响。
将新鲜采集的EDTA抗凝血按照实施例一方法配制PCR反应液。PCR反应程序如下：

不同退火温度的MTRR(A66G)突变 PCR电泳图见图4，其中，
1：退火温度50度的MTRR(A66G)突变 PCR；
2：退火温度52度的MTRR(A66G)突变 PCR；
3：退火温度54度的MTRR(A66G)突变 PCR；
4：退火温度56度的MTRR(A66G)突变 PCR；
5：退火温度58度的MTRR(A66G)突变 PCR；
6：退火温度60度的MTRR(A66G)突变 PCR。
不同退火温度的MTHFR(C677T)突变 PCR见图5，其中，
1：退火温度50度的MTHFR(C677T)突变 PCR；
2：退火温度52度的MTHFR(C677T)突变 PCR；
3：退火温度54度的MTHFR(C677T)突变 PCR；
4：退火温度56度的MTHFR(C677T)突变 PCR；
5：退火温度58度的MTHFR(C677T)突变 PCR；
6：退火温度60度的MTHFR(C677T)突变 PCR。
不同退火温度的MTHFR(A1298C)突变 PCR见图6，其中，
1：退火温度50度的MTHFR(A1298C)突变 PCR；
2：退火温度52度的MTHFR(A1298C)突变 PCR；
3：退火温度54度的MTHFR(A1298C)突变 PCR；
4：退火温度56度的MTHFR(A1298C)突变 PCR；
5：退火温度58度的MTHFR(A1298C)突变 PCR；
6：退火温度60度的MTHFR(A1298C)突变 PCR。
结果表明：本发明的试剂盒实际可以满足不同的PCR退火温度，拥有比较宽范的实验条件，适合不同的PCR仪。
本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。
SEQUENCE LISTING
 
<110>  湖州鼎晶医学检验所有限公司
 
<120>  血液直接PCR法检测叶酸代谢相关基因多态性的引物、引物组、试剂盒及检
       测方法
 
<130>  1
 
<160>  6    
 
<170>  PatentIn version 3.3
 
<210>  1
<211>  18
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  1
atgccttgaa gtgatgag                                                   18
 
 
<210>  2
<211>  18
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  2
actgtaacgg ctctaacc                                                   18
 
 
<210>  3
<211>  20
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  3
aggacagtgt gggagtttgg                                                 20
 
 
<210>  4
<211>  20
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  4
gaaaagctgc gtgatgatga                                                 20
 
 
<210>  5
<211>  25
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  5
ccagaccaaa gagttacatc taccg                                           25
 
 
<210>  6
<211>  21
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  6
cttacccttc tccctttgcc a                                               21