一种具有可光致细胞脱附的二氧化钛/白蛋白/生物信号分子复合涂层及其制备方法.pdf

本发明公开的具有可光致细胞脱附的二氧化钛/白蛋白/生物信号分子复合涂层，自下而上依次有基底、二氧化钛纳米点层以及白蛋白与生物信号分子层，其中，二氧化钛纳米点层中二氧化钛纳米点的尺寸为20～300nm，密度为1.0×109～1×1011/cm2，白蛋白与生物信号分子层充满二氧化钛纳米点之间的间隙，并覆盖二氧化钛纳米点。其制备：包括制备二氧化钛前驱体溶胶；依次将前驱体溶胶、白蛋白与生物信号分子的混合物旋涂在基底上并进行热处理。该所得到的复合涂层具有良好的生物相容性有利于细胞的初始附着、增殖和后续脱附。可广泛用于体外细胞培养和组织工程等生物医学工程领域。

权利要求书
1.  具有可光致细胞脱附的二氧化钛/白蛋白/生物信号分子复合涂层，其特征是自下而上依次有基底（1）、二氧化钛纳米点层（2）以及白蛋白与生物信号分子层（3），其中，二氧化钛纳米点层中二氧化钛纳米点的尺寸为20～300nm，密度为1.0×109～1×1011/cm2，白蛋白与生物信号分子层（3）充满二氧化钛纳米点之间的间隙，并覆盖二氧化钛纳米点，白蛋白与生物信号分子的质量比为1000:1~10:1，白蛋白与信号分子层的质量之和是复合涂层总质量的0.4-50%。

2.  根据权利要求1所述的具有可光致细胞脱附的二氧化钛/白蛋白/生物信号分子复合涂层，其特征在于所述的基底为石英玻璃、硅玻璃、硅片、钽片、纯钛片或钛镍合金片。

3.  根据权利要求1所述的具有可光致细胞脱附的二氧化钛/白蛋白/生物信号分子复合涂层，其特征在于所述的生物信号分子为RGD、RGDS或GYRGDS。

4.  根据权利要求1所述的具有可光致细胞脱附的二氧化钛/白蛋白/生物信号分子复合涂层，其特征在于白蛋白与生物信号分子的质量比为500:1~100:1。

5.  制备如权利要求1所述的具有可光致细胞脱附的二氧化钛/白蛋白/生物信号分子复合涂层的方法，其特征在于步骤如下：
1）将钛源、络合剂和去离子水按摩尔比1:0.3:1的比例加入到无水乙醇中，然后加入聚乙烯吡咯烷酮，在室温下充分搅拌，配制成钛原子浓度为0.1-0.5mol/L，聚乙烯吡咯烷酮浓度为10~100mg/ml的二氧化钛前驱体溶胶；将二氧化钛前驱体溶胶滴至清洗净的基底表面至其铺满，并以4000-8000rpm的速度旋涂20-60s，之后将其置于400-600℃下保温0.5-2h，在基底上得到二氧化钛纳米点层；
2) 将浓度为0.01mg/ml~0.1mg/ml的生物信号分子和浓度为0.5mg/ml~10 mg/ml的白蛋白按质量比白蛋白：生物信号分子=1000:1~10:1混合；
3)按白蛋白与生物信号分子层的质量之和是复合涂层总质量的0.4-50% 取步骤2）的混合物，将该混合物滴至步骤1）制得的二氧化钛纳米点层上至其铺满，并以100-1000rpm的速度旋涂，然后将其置于37℃下保温0.5-2h。

6.  根据权利要求5所述的具有可光致细胞脱附的二氧化钛/白蛋白/生物信号分子复合涂层的制备方法，其特征在于所述的钛源为钛酸四丁酯、四氯化钛、三氯化钛、氟化钛或硫酸钛；所述的络合剂为乙酰丙酮或乙醇胺。

7.  根据权利要求5所述的具有可光致细胞脱附的二氧化钛/白蛋白/生物信号分子复合涂层的制备方法，其特征在于所述的络合剂为乙酰丙酮或乙醇胺。

8.  根据权利要求5所述的具有可光致细胞脱附的二氧化钛/白蛋白/生物信号分子复合涂层的制备方法，所述的生物信号分子是 RGD、RGDS或GYRGDS。

说明书一种具有可光致细胞脱附的二氧化钛/白蛋白/生物信号分子复合涂层及其制备方法
技术领域
本发明属于生物医用涂层领域，具体涉及兼具促进细胞粘附和脱附二氧化钛基复合涂层及其制备方法。
背景技术
目前体外细胞培养收获细胞时主要用胰酶处理，但胰酶处理会使细胞与细胞外基质分离，不利于细胞的后续利用；近年来，OKANO等采用温敏聚合物利用其憎水亲水特性可随温度变化的特性成功地通过温度变化实现了细胞从细胞培养器皿上分离而不破坏细胞外基质蛋白的连接[N. Matsuda, T. Shimizu, M. Yamato, T. Okano, Tissue Engineering Based on Cell Sheet Technology, Advanced Materials, 2007, 19, 3089–3099]。但是，以温度作为外场仍需要较长的时间，而所需的低温过程在一定程度可损伤细胞的功能。
由于TiO2材料具有良好的生物相容性和特有的光学响应性，使得其在生物医用方面的应用不断的扩展。洪逸等人[Y. Hong et al. Light-induced cell detachment for cell sheet technology [J]. Biomaterials (2012) 1-8.] 在TiO2纳米点薄膜上培养细胞，首次发现通过紫外照射，细胞可以从TiO2纳米点薄膜上脱附下来，而且细胞外基质和细胞连接蛋白可以一起被脱附下来，获取下来的细胞具有良好的细胞活性。RGD被认为是目前促进细胞黏附最有效且应用最广泛的多肽序列。由于多种机体细胞均表达多种整合素，它能特异性结合细胞黏附识别位点RGD片段，活化信号通路如MAPK和JNK，调节转录因子活性，指导细胞生长和分化。白蛋白是细胞体外培养液的主要蛋白。也是材料表面首先吸附的蛋白，二氧化钛具有光致亲水性，在紫外UV365的激发下，锐钛矿 TiO2 纳米点上吸附白蛋白会由外向内逐渐脱附，致使细胞脱附。为了更快的在体外获取生物活性更强的细胞薄层，设计出一种能加快体外细胞成膜并且能快速脱附的材料十分重要。故在二氧化钛表面复合一层白蛋白与生物信号分子的混合物。这种复合涂层结构，不仅能提高材料的生物相容性还能加速细胞的粘附与脱附，对于组织工程、细胞生物传感器等的发展都有重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有良好生物相容性且制备方法简便、成本低的具有可光致细胞脱附的二氧化钛/白蛋白/生物信号分子复合涂层及其制备方法。
本发明的具有可光致细胞脱附的二氧化钛/白蛋白/生物信号分子复合涂层，自下而上依次有基底、二氧化钛纳米点层以及白蛋白与生物信号分子层，其中，二氧化钛纳米点层中二氧化钛纳米点的尺寸为20～300nm，密度为1.0×109～1×1011/cm2，白蛋白与生物信号分子层充满二氧化钛纳米点之间的间隙，并覆盖二氧化钛纳米点，白蛋白与生物信号分子的质量比为1000:1~10:1，白蛋白与信号分子层的质量之和是复合涂层总质量的0.4-50%。
本发明的具有可光致细胞脱附的二氧化钛/白蛋白/生物信号分子复合涂层的制备方法，其步骤如下：
1）将钛源、络合剂和去离子水按摩尔比1:0.3:1的比例加入到无水乙醇中，然后加入聚乙烯吡咯烷酮，在室温下充分搅拌，配制成钛原子浓度为0.1-0.5mol/L，聚乙烯吡咯烷酮浓度为10~100mg/ml的二氧化钛前驱体溶胶；将二氧化钛前驱体溶胶滴至清洗净的基底表面至其铺满，并以4000-8000rpm的速度旋涂20-60s，之后将其置于400-600℃下保温0.5-2h，在基底上得到二氧化钛纳米点层；
2) 将浓度为0.01mg/ml~0.1mg/ml的生物信号分子和浓度为0.5mg/ml~10 mg/ml的白蛋白按质量比白蛋白：生物信号分子=1000:1~10:1混合；
3)按白蛋白与生物信号分子层的质量之和是复合涂层总质量的0.4-50% 取步骤2）的混合物，将该混合物滴至步骤1）制得的二氧化钛纳米点层上至其铺满，并以100-1000rpm的速度旋涂，然后将其置于37℃下保温0.5-2h。
本发明中所述的基底可以是石英玻璃、硅玻璃、硅片、钽片、纯钛片或钛镍合金片。
本发明中所述的钛源可以为钛酸四丁酯、四氯化钛、三氯化钛、氟化钛或硫酸钛；所述的络合剂为乙酰丙酮或乙醇胺。
本发明中所述的生物信号分子为：RGD（精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸）、RGDS（精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸）、GYRGDS（甘氨酸-酪氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸）。
本发明中所述的白蛋白为牛血清白蛋白或人血清白蛋白。
本发明中优选白蛋白与生物信号分子的质量比为500:1~100:1。
本发明的二氧化钛基复合涂层，由于采用白蛋白与生物信号分子修饰二氧化钛纳米颗粒，构建了复合涂层，生物信号分子和白蛋白都具有良好的生物相容性有利于细胞的初始附着、增殖和后续脱附。本发明的制备方法简便，成本低，便于推广应用，可广泛应用于体外细胞培养、组织工程等生物医学工程领域。
附图说明
图1是具有可光致细胞脱附的二氧化钛/白蛋白/生物信号分子复合涂层的示意图；
图2是二氧化钛纳米点薄膜的SEM图；
图3是二氧化钛/白蛋白与RGD复合涂层的SEM图；
图4是二氧化钛/白蛋白与RGD混合物的复合涂层和二氧化钛纳米点薄膜培养细胞24h后的吸光度值；
图5是二氧化钛/白蛋白与RGD混合物复合涂层和二氧化钛纳米点薄膜用紫外UV365光照15min的脱附率。
具体实施方式
下面结合实施例和附图详细说明本发明，但本发明并不仅限于此。
具有可光致细胞脱附的二氧化钛/白蛋白/生物信号分子复合涂层如图1所示，自下而上依次有基底1、二氧化钛纳米点层2以及白蛋白与生物信号分子层3。其中，二氧化钛纳米点层中二氧化钛纳米点的尺寸为20～300nm，密度为1.0×109～1×1011/cm2，白蛋白与生物信号分子层3充满二氧化钛纳米点之间的间隙，并覆盖二氧化钛纳米点，白蛋白与生物信号分子的质量比为1000:1~10:1，白蛋白与信号分子层的质量之和是复合涂层总质量的0.4-50%。
实施例1
1）将钛酸四丁酯、乙酰丙酮和去离子水按摩尔比1:0.3:1的比例加入到无水乙醇中，然后加入聚乙烯吡咯烷酮，在室温下充分搅拌，配制成钛原子浓度为0.2 mol/L，聚乙烯吡咯烷酮浓度为40mg/ml的二氧化钛前驱体溶胶；将二氧化钛前驱体溶胶滴至清洗净的石英玻璃表面至其铺满，并以8000rpm的速度旋涂40s，之后将其置于500℃下保温1h，在石英玻璃上得到二氧化钛纳米点层(见图2)。该二氧化钛纳米点的尺寸为30nm～200nm，密度为3.0×1010/cm2。
2）将浓度10mg/ml的牛血清白蛋白与浓度为0.01mg/ml 的RGD混合，牛血清白蛋白：RGD的质量比为100:1；
3)按牛血清白蛋白与RGD层的质量之和是复合涂层总质量的0.4% 取步骤2）的混合物，将该混合物滴至步骤1）制得的二氧化钛纳米点层上至其铺满，并以500rpm的速度旋涂，然后将其置于37℃下保温1h，得到具有可光致细胞脱附的二氧化钛/牛血清白蛋白/RGD复合涂层（见图3）。
在上述复合涂层上进行成纤维胞体外培养，培养一天后，利用CCK-8(Cell Counting Kit-8)法测定 OD值(Optical Density，又称吸光度)，所制备的二氧化钛/牛血清白蛋白/RGD复合涂层相比二氧化钛纳米点薄膜的OD值更大(见图4)，说明二氧化钛/牛血清白蛋白/RGD复合涂层对细胞粘附有一定的促进作用。而二天后，细胞的获取用紫外UV365光照15min即可获得。获取单细胞后二氧化钛/牛血清白蛋白/RGD复合涂层用CCK-8(Cell Counting Kit-8)法测定 OD值(Optical Density，又称吸光度)，可计算出脱附率。二氧化钛/牛血清白蛋白/RGD复合涂层和二氧化钛纳米点薄膜的脱附率分别为98%和85%。（见图5），说明二氧化钛/牛血清白蛋白与RGD复合涂层更有利于细胞薄层的脱附。
实施例2
1）将钛酸四丁酯、乙酰丙酮和去离子水按摩尔比1:0.3:1的比例加入到无水乙醇中，然后加入聚乙烯吡咯烷酮，在室温下充分搅拌，配制成钛原子浓度为0.2 mol/L，聚乙烯吡咯烷酮浓度为10mg/ml的二氧化钛前驱体溶胶；将二氧化钛前驱体溶胶滴至清洗净的硅玻璃表面至其铺满，并以4000rpm的速度旋涂40s，之后将其置于400℃下保温2h，在石英玻璃上得到二氧化钛纳米点层。该二氧化钛纳米点的尺寸为20nm～200nm，密度为4.0×1010/cm2。
2）将浓度10mg/ml的牛血清白蛋白与浓度为0.01mg/ml 的RGD混合，牛血清白蛋白：RGD的质量比为1000:1；
3)按牛血清白蛋白与RGD层的质量之和是复合涂层总质量的0.8% 取步骤2）的混合物，将该混合物滴至步骤1）制得的二氧化钛纳米点层上至其铺满，并以400rpm的速度旋涂，然后将其置于37℃下保温1h。得到具有可光致细胞脱附的二氧化钛/牛血清白蛋白/RGD复合涂层。
在上述复合涂层上进行成纤维胞体外培养，培养一天后，利用CCK-8(Cell Counting Kit-8)法测定 OD值(Optical Density，又称吸光度)，所制备的二氧化钛/牛血清白蛋白/RGD复合涂层相比二氧化钛纳米点薄膜的OD值更大，说明二氧化钛/牛血清白蛋白/RGD复合涂层对细胞粘附有一定的促进作用。而二天后，细胞的获取用紫外UV365光照15min即可获得。获取单细胞后二氧化钛/牛血清白蛋白/RGD复合涂层用CCK-8(Cell Counting Kit-8)法测定 OD值(Optical Density，又称吸光度)，可计算出脱附率。二氧化钛/牛血清白蛋白/RGD复合涂层和二氧化钛纳米点薄膜的脱附率分别为90%和85%。说明二氧化钛/牛血清白蛋白/RGD复合涂层更有利于细胞薄层的脱附。
实施例3
1）三氯化钛、乙酰丙酮和去离子水按摩尔比1:0.3:1的比例加入到无水乙醇中，然后加入聚乙烯吡咯烷酮，在室温下充分搅拌，配制成钛原子浓度为0.2 mol/L，聚乙烯吡咯烷酮浓度为10mg/ml的二氧化钛前驱体溶胶；将二氧化钛前驱体溶胶滴至清洗净的硅玻璃表面至其铺满，并以4500rpm的速度旋涂20s，之后将其置于600℃下保温0.5h，在硅玻璃上得到二氧化钛纳米点层。该二氧化钛纳米点的尺寸为20nm～300nm，密度为4.0×1010/cm2。
2）将浓度10mg/ml的牛血清白蛋白与浓度为0.01mg/ml 的RGDS混合，牛血清白蛋白：RGDS的质量比为50:1；
3)按牛血清白蛋白与RGDS层的质量之和是复合涂层总质量的50% 取步骤2）的混合物，将该混合物滴至步骤1）制得的二氧化钛纳米点层上至其铺满，并以100rpm的速度旋涂，然后将其置于37℃下保温1h。得到具有可光致细胞脱附的二氧化钛/牛血清白蛋白/RGDS复合涂层。
在上述复合涂层上进行成纤维胞体外培养，培养一天后，利用CCK-8(Cell Counting Kit-8)法测定 OD值(Optical Density，又称吸光度)，所制备的二氧化钛/牛血清白蛋白/RGDS复合涂层相比二氧化钛纳米点薄膜的OD值更大，说明二氧化钛/牛血清白蛋白/RGDS复合涂层对细胞粘附有一定的促进作用。而二天后，细胞的获取用紫外UV365光照15min即可获得。获取单细胞后二氧化钛/牛血清白蛋白/RGDS复合涂层用CCK-8(Cell Counting Kit-8)法测定 OD值(Optical Density，又称吸光度)，可计算出脱附率。二氧化钛/牛血清白蛋白/RGDS复合涂层和二氧化钛纳米点薄膜的脱附率分别为94%和85%。说明二氧化钛/牛血清白蛋白/RGDS复合涂层更有利于细胞薄层的脱附。
实施例4
1）将钛酸四丁酯、乙酰丙酮和去离子水按摩尔比1:0.3:1的比例加入到无水乙醇中，然后加入聚乙烯吡咯烷酮，在室温下充分搅拌，配制成钛原子浓度为0.2 mol/L，聚乙烯吡咯烷酮浓度为100mg/ml的二氧化钛前驱体溶胶；将二氧化钛前驱体溶胶滴至清洗净的硅玻璃表面至其铺满，并以8000rpm的速度旋涂60s，之后将其置于600℃下保温2h，在硅玻璃上得到二氧化钛纳米点层。该二氧化钛纳米点的尺寸为30nm～300nm，密度为9.0×1010/cm2。
2）将浓度10mg/ml的人血清白蛋白与浓度为0.01mg/ml 的RGDS混合，人血清白蛋白：RGDS的质量比为50:1；
3)按人血清白蛋白与RGDS层的质量之和是复合涂层总质量的30% 取步骤2）的混合物，将该混合物滴至步骤1）制得的二氧化钛纳米点层上至其铺满，并以100rpm的速度旋涂，然后将其置于37℃下保温2h。得到具有可光致细胞脱附的二氧化钛/牛血清白蛋白/RGDS复合涂层。
在上述复合涂层上进行成纤维胞体外培养，培养一天后，利用CCK-8(Cell Counting Kit-8)法测定 OD值(Optical Density，又称吸光度)，所制备的二氧化钛/人血清白蛋白/RGDS复合涂层相比二氧化钛纳米点薄膜的OD值更大，说明二氧化钛/人血清白蛋白/RGDS复合涂层对细胞粘附有一定的促进作用。而二天后，细胞的获取用紫外UV365光照15min即可获得。获取单细胞后二氧化钛/人血清白蛋白/RGDS复合涂层用CCK-8(Cell Counting Kit-8)法测定 OD值(Optical Density，又称吸光度)，可计算出脱附率。二氧化钛/牛血清白蛋白/RGDS复合涂层和二氧化钛纳米点薄膜的脱附率分别为93%和85%。说明二氧化钛/牛血清白蛋白/RGDS复合涂层更有利于细胞薄层的脱附。
实施例5
1）将四氯化钛、乙醇胺和去离子水按摩尔比1:0.3:1的比例加入到无水乙醇中，然后加入聚乙烯吡咯烷酮，在室温下充分搅拌，配制成钛原子浓度为0.2 mol/L，聚乙烯吡咯烷酮浓度为80mg/ml的二氧化钛前驱体溶胶；将二氧化钛前驱体溶胶滴至清洗净的纯钛片表面至其铺满，并以4000rpm的速度旋涂45s，之后将其置于600℃下保温1h，在纯钛片上得到二氧化钛纳米点层。该二氧化钛纳米点的尺寸为30nm～150nm，密度为1.0×1010/cm2。
2）将浓度10mg/ml的人血清白蛋白与浓度为0.1mg/ml 的RGDS混合，人血清白蛋白：RGDS的质量比为450:1；
3)按人血清白蛋白与RGDS层的质量之和是复合涂层总质量的50% 取步骤2）的混合物，将该混合物滴至步骤1）制得的二氧化钛纳米点层上至其铺满，并以100rpm的速度旋涂，然后将其置于37℃下保温2h。得到具有可光致细胞脱附的二氧化钛/人血清白蛋白/RGDS复合涂层。
在上述复合涂层上进行成纤维胞体外培养，培养一天后，利用CCK-8(Cell Counting Kit-8)法测定 OD值(Optical Density，又称吸光度)，所制备的二氧化钛/人血清白蛋白/RGDS复合涂层相比二氧化钛纳米点薄膜的OD值更大，说明二氧化钛/人血清白蛋白/RGDS复合涂层对细胞粘附有一定的促进作用。而二天后，细胞的获取用UV365光照15min即可获得。获取单细胞后二氧化钛/人血清白蛋白/RGDS复合涂层用CCK-8(Cell Counting Kit-8)法测定 OD值(Optical Density，又称吸光度)，可计算出脱附率。二氧化钛/人血清白蛋白/RGDS复合涂层和二氧化钛纳米点薄膜的脱附率分别为99%和85%。说明二氧化钛/牛血清白蛋白与RGDS混合物的复合涂层更有利于细胞薄层的脱附。
实施例6
1）将四氯化钛、乙醇胺和去离子水按摩尔比1:0.3:1的比例加入到无水乙醇中，然后加入聚乙烯吡咯烷酮，在室温下充分搅拌，配制成钛原子浓度为0.2 mol/L，聚乙烯吡咯烷酮浓度为60mg/ml的二氧化钛前驱体溶胶；将二氧化钛前驱体溶胶滴至清洗净的纯钛片表面至其铺满，并以7000rpm的速度旋涂35s，之后将其置于600℃下保温1h，在纯钛片上得到二氧化钛纳米点层。该二氧化钛纳米点的尺寸为30nm～100nm，密度为1.0×1011/cm2。
2）将浓度10mg/ml的人血清白蛋白与浓度为0.05mg/ml 的GYRGDS混合，人血清白蛋白：GYRGDS的质量比为300:1；
3)按人血清白蛋白与GYRGDS层的质量之和是复合涂层总质量的45% 取步骤2）的混合物，将该混合物滴至步骤1）制得的二氧化钛纳米点层上至其铺满，并以100rpm的速度旋涂，然后将其置于37℃下保温0.5h。得到具有可光致细胞脱附的二氧化钛/人血清白蛋白/GYRGDS复合涂层。
在上述复合涂层上进行成纤维胞体外培养，培养一天后，利用CCK-8(Cell Counting Kit-8)法测定 OD值(Optical Density，又称吸光度)，所制备的二氧化钛/人血清白蛋白/GYRGDS复合涂层相比二氧化钛纳米点薄膜的OD值更大，说明二氧化钛/人血清白蛋白/GYRGDS复合涂层对细胞粘附有一定的促进作用。而二天后，细胞的获取用UV365光照15min即可获得。获取单细胞后二氧化钛/人血清白蛋白/GYRGDS复合涂层用CCK-8(Cell Counting Kit-8)法测定 OD值(Optical Density，又称吸光度)，可计算出脱附率。二氧化钛/人血清白蛋白/GYRGDS复合涂层和二氧化钛纳米点薄膜的脱附率分别为99%和85%。说明二氧化钛/牛血清白蛋白与GYRGDS复合涂层更有利于细胞薄层的脱附。