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1、10申请公布号CN104159591A43申请公布日20141119CN104159591A21申请号201280066237922申请日2012110661/556,66120111107USA61K35/18200601A61M1/3620060171申请人通用医疗公司地址美国马萨诸塞州72发明人WM扎波尔B于74专利代理机构北京市柳沈律师事务所11105代理人张文辉54发明名称红细胞的处理57摘要本申请公开了处理红细胞的组合物和方法。所述方法包括使红细胞样品活体外与，足以使得红细胞样品中存在的至少部分胞外亚铁血红蛋白转化成高铁血红蛋白的量的、氧化氮或者释放氧化氮的化合物接触。在经所述的活。
2、体外处理后将红细胞施用于哺乳动物，降低了所施用的红细胞对被施用的哺乳动物的副作用。30优先权数据85PCT国际申请进入国家阶段日2014070786PCT国际申请的申请数据PCT/US2012/0636902012110687PCT国际申请的公布数据WO2013/070592EN2013051651INTCL权利要求书2页说明书18页附图14页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书18页附图14页10申请公布号CN104159591ACN104159591A1/2页21处理红细胞样品的方法，所述方法包括使红细胞样品活体外与足以使得红细胞样品中存在的至少部分胞外亚铁。
3、血红蛋白转化成高铁血红蛋白的量的、氧化氮或者释放氧化氮的化合物接触。2权利要求1的方法，其中，所述的红细胞样品在与氧化氮或释放氧化氮的化合物接触前，已活体外经历过血液透析,术中血液抢救，或心切开吸引术。3权利要求1的方法，其中，所述的红细胞样品在与氧化氮或释放氧化氮的化合物接触前，已活体外经历过一种或以上的泵、膜或气泡。4权利要求1的方法，其中，从供体中移除后、与氧化氮或释放氧化氮的化合物接触前，所述的红细胞样品已活体外保存了至少24小时。5权利要求1的方法，其中，从供体中移除后、与氧化氮或释放氧化氮的化合物接触前，所述的红细胞样品已活体外保存了至少7天。6权利要求1的方法，其中，从供体中移除。
4、后、与氧化氮或释放氧化氮的化合物接触前，所述的红细胞样品已活体外保存了至少14天。7权利要求1的方法，其中，从供体中移除后、与氧化氮或释放氧化氮的化合物接触前，所述的红细胞样品已活体外保存了至少28天。8权利要求1的方法，其中，从供体中移除后、与氧化氮或释放氧化氮的化合物接触前，所述的红细胞样品已活体外保存了至少42天。9前述任一项权利要求的方法，其中所述红细胞样品中的至少20的胞外亚铁血红蛋白转化成高铁血红蛋白。10前述任一项权利要求的方法，其中所述红细胞样品中的至少50的胞外亚铁血红蛋白转化成高铁血红蛋白。11前述任一项权利要求的方法，其中所述红细胞样品中的至少80的胞外亚铁血红蛋白转化成。
5、高铁血红蛋白。12前述任一项权利要求的方法，其中所述的红细胞样品与含气态氧化氮的治疗性气体接触。13权利要求12的方法，其中所述的治疗性气体中气态氧化氮的浓度是至少20PPM。14权利要求12的方法，其中所述的治疗性气体中气态氧化氮的浓度是至少40PPM。15权利要求12的方法，其中所述的治疗性气体中气态氧化氮的浓度是至少80PPM。16权利要求12的方法，其中所述的治疗性气体中气态氧化氮的浓度在100PPM到800PPM的范围。17权利要求12的方法，其中所述的治疗性气体中气态氧化氮的浓度在40PPM到200PPM的范围。18权利要求12的方法，其中所述的治疗性气体中气态氧化氮的浓度在40P。
6、PM到3,000PPM的范围。19权利要求12到18任一项所述的方法，其中所述的红细胞样品与所述的治疗性气体接触不到5秒。20权利要求12到18任一项所述的方法，其中所述的红细胞样品与所述的治疗性气体接触至少15分钟。21权利要求12到18任一项所述的方法，其中所述的红细胞样品与所述的治疗性气体权利要求书CN104159591A2/2页3接触至少1小时。22权利要求12到18任一项所述的方法，其中所述的红细胞样品与所述的治疗性气体接触至少2小时。23权利要求1到11任一项所述的方法，其中所述的红细胞样品与释放氧化氮的化合物接触。24权利要求23的方法，其中所述的释放氧化氮的化合物包括亚硝酸盐。。
7、25权利要求23的方法，其中所述的释放氧化氮的化合物是超短作用的释放氧化氮的化合物。26权利要求25的方法，其中所述的超短作用的释放氧化氮的化合物是12羧基吡咯烷1基二氮烯1鎓1,2二氧化物DIOLATE或Z1N甲基N6N甲基铵基己基氨基二氮烯1鎓1,2二氧化物。27前述任一项权利要求的方法，其中所述方法在无菌条件下进行。28防止或降低施用红细胞后哺乳动物中的血管收缩的方法，所述方法包括给哺乳动物施用，已活体外与足以使得红细胞样品中存在的至少部分胞外亚铁血红蛋白转化成高铁血红蛋白的量的、氧化氮或者释放氧化氮的化合物接触的红细胞样品。29权利要求28的方法，其中所述的红细胞样品包含自体红细胞。3。
8、0权利要求28的方法，其中所述的红细胞样品包含同种异型的红细胞。31权利要求28到30任一项所述的方法，其中所述的红细胞样品在用氧化氮或释放氧化氮的化合物处理之前经冻融。32权利要求28到31任一项所述的方法，其中所述的红细胞样品与作为顺序输注系统的一部分的氧化氮接触，其中所述的红细胞样品从含有所述红细胞样品的容器流出，和连接着氧化氮源的透气材料接触，使红细胞样品暴露于氧化氮，并在暴露于氧化氮之后递送至所述哺乳动物。33权利要求32的方法，其中所述的氧化氮源是含压缩氧化氮气体的罐。34权利要求32的方法，其中所述的氧化氮是电动氧化氮发生器。35前述任一项权利要求的方法，其中所述的哺乳动物是人。。
9、权利要求书CN104159591A1/18页4红细胞的处理0001对相关申请的交叉引用0002本申请要求2011年11月7日提交的美国临时专利申请NO61/556,661的优先权，所述在先申请的全部内容通过参考的形式全部并入本申请。技术领域0003本发明涉及在施用于哺乳动物之前处理红细胞的组合物和方法。0004发明背景0005储存长达两周以上的红细胞输血与感染率提高、住院时间延长，以及重症监护治疗病房和正接受心血管手术的患者死亡率升高相关TRIULZI等人,TRANSFUSAPHERSCI2010；4395106。延长的红细胞储存引起红细胞中显著的生化的，机械的以及功能性的改变，总称为“储存性。
10、损伤STORAGELESION”。KIMSHAPIRO等人,TRANSFUSION2011；5184451。需要用于降低或去除用储存红细胞输血的副作用的组合物和方法。0006发明概述0007本发明至少部分地基于下述发现，即用氧化氮活体外EXVIVO处理储存的红细胞可使得胞外亚铁血红蛋白氧化成为高铁血红蛋白，此种处理防止储存的红细胞在被施用于哺乳动物后诱导血管收缩。氧化氮或释放氧化氮的化合物预处理储存的红细胞，可用作减少或消除与用储存的血液输血相关的副作用的手段。在施用于哺乳动物之前对血液进行处理，可免除为了解决由用储存的血液输血所导致的副作用，而对输血后的哺乳动物进行治疗的需要。0008本申请。
11、公开了，通过使红细胞样品活体外与，足以使得红细胞样品中存在的至少部分胞外亚铁血红蛋白转化成高铁血红蛋白的量的、氧化氮或者释放氧化氮的化合物接触，对红细胞样品进行处理的方法。胞外亚铁血红蛋白包括无细胞血红蛋白和含胞外血红蛋白的微颗粒参见DONADEE等人,CIRCULATION2011；12446576。0009本申请还公开了，通过对哺乳动物施用下述的红细胞样品以防止或减少在施用红细胞后哺乳动物中的血管收缩，所述的红细胞样品已活体外与，足以使得红细胞样品中存在的至少部分胞外亚铁血红蛋白转化成高铁血红蛋白的量的、氧化氮或者释放氧化氮的化合物接触。0010在本申请所公开的方法的一些具体实施方案中，所。
12、述的方法并不显著地氧化样品中的红细胞或减弱它们的携氧能力例如，红细胞中低于20，低于15，低于10，或低于5的血红蛋白被转化成高铁血红蛋白。0011本申请所公开的方法的一些具体实施方案中，所述的红细胞样品在与氧化氮或释放氧化氮的化合物接触前，已经历过一种或以上活体外，泵例如，负压泵吸引，膜，和/或气泡AIRBUBBLES处理。在本申请所公开的方法的一些具体实施方案中，所述的红细胞样品在与氧化氮或释放氧化氮的化合物接触前，已或活体外经历过，血液透析,术中血液抢救，心切开吸引术。在这些方法中，所述的红细胞在遭受使其需要经本申请所公开的方法进行处理的损伤之前，仅需要处于哺乳动物体外，一小段时间例如，。
13、几秒或几分钟。说明书CN104159591A2/18页50012红细胞样品包含红细胞和上清液或血浆。所述的红细胞样品可以是，例如，全血或浓缩红细胞。0013所述红细胞样品可活体外储存,例如，在从供体中移除后、与氧化氮或释放氧化氮的化合物接触前，至少24小时。在一些具体实施方案中，所述红细胞样品从供体中移除后、与氧化氮或释放氧化氮的化合物接触前，活体外储存至少7天，至少14天，至少28天，至少42天或更长时间。所述红细胞样品在储存之前可任选地用储存溶液稀释。0014施用于哺乳动物之前，红细胞可来源于自体或同种异型供体。因此，所述红细胞样品可包含自体红细胞或同种异型的红细胞。所述红细胞样品可储存于。
14、多种储存介质例如，ADSOL。在用氧化氮或释放氧化氮的化合物处理之前，所述红细胞样品可任选地被冻融。0015本申请所公开的方法的一些具体实施方案中，所述的处理使得所述红细胞样品中至少20或至少50，或至少80的胞外亚铁血红蛋白被转化成高铁血红蛋白。0016在本申请所公开的方法的一些具体实施方案中，所述红细胞样品与用惰性气体稀释的、含气态氧化氮的治疗性气体接触。治疗性气体中所述气态氧化氮的浓度可以是，例如至少20PPM，至少40PPM，至少50PPM，至少80PPM，至少100PPM，至少200PPM，至少300PPM，或至少500PPM。在一些具体实施方案中，所述治疗性气体中气态氧化氮的浓度在。
15、50PPM到800PPM例如，40PPM到200PPM,80PPM到200PPM,80PPM到500PPM,100PPM到800PPM,或40PPM到3,000PPM的范围。所述红细胞样品可与治疗性气体在不同长度的时间段例如，至少1秒，低于5秒,低于30秒，至少1秒但低于5秒，至少1秒但低于30秒，至少1分钟，至少2分钟，至少3分钟，至少4分钟，至少5分钟，至少6分钟，至少7分钟，至少8分钟，至少9分钟，至少10分钟，至少1小时，至少2小时，或更长的时间内相接触。0017在本申请所公开的方法的一些具体实施方案中，所述红细胞样品与释放氧化氮的化合物接触。所述释放氧化氮的化合物任选地包含亚硝酸盐。。
16、所述释放氧化氮的化合物可以是超短作用ULTRASHORTACTING释放氧化氮的化合物例如，12羧基吡咯烷1基二氮烯1鎓1,2二氧化物DIOLATE或Z1N甲基N6N甲基铵基己基氨基二氮烯1鎓1,2二氧化物或释放二醇二氮烯鎓NONOATE的中间物。0018本申请所公开的方法的一些具体实施方案中，所述方法在无菌条件下进行。所述红细胞样品在其从供体获得，乃至用氧化氮或释放氧化氮的化合物进行处理的整个过程中，均保持在无菌条件之下。0019在本申请所公开的方法的一些具体实施方案中，所述红细胞样品与作为顺序INLINE输注INFUSION系统的一部分的氧化氮接触，其中，所述的红细胞样品从含所述样品的容器。
17、流出，和与惰性气体中的氧化氮源相连的层流设备或第二流式气体交换设备中的透气材料例如微孔膜接触，使红细胞样品暴露于氧化氮，并在暴露于氧化氮之后递送至所述哺乳动物。所述的氧化氮源可以是例如，含压缩的氧化氮气体的罐或电动氧化氮发生器含或不含NO2净化剂。0020经本申请所描述的方法治疗的哺乳动物可以是人，或非人灵长类，或另外的哺乳动物，如狗、猫、马、牛、猪、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、豚鼠、兔或仓鼠。0021本申请所提及的全部的出版物，专利申请，专利，序列，数据条目以及其他参考文说明书CN104159591A3/18页6献，均以参考的形式全文并入本申请。除非另外定义，本申请所用的全部技术和科学术语具有本。
18、发明所属领域普通技术人员通常所理解的含义。存在分歧时，包括定义在内，以本说明书为准。下文中描述了用于本发明的材料和方法，但是类似或等价于本申请所描述的其他合适的材料和方法也可以用于实施或检验本发明。所述的材料、方法和实施例仅作为示例，并非旨在进行限定。0022本发明的其它特征和有益效果，在下述的详细描述以及权利要求中显而易见。0023附图简述0024图1A1D提供，在体外鼠RBC中储存诱导的形态，生化和功能改变。A新鲜红细胞FRBC,上部的图和储存的红细胞SRBC,下部的图的染色涂片,下部图中的箭头显示储存两周后增多的异型RBC数量。BFRBC和SRBC的氧解离曲线ODC。P50,定义为HB5。
19、0饱和时的氧分压,由所述的ODC计算出来。所述SRBC的ODC向左偏移，其P50为211MMHG,相比之下，FRBC的P50是430MMHG。CFRBCN5和SRBCN5与P50的FRBCN3和SRBCN3的2,3DPG水平变化比较。D通过WT小鼠中输血后24小时测定的、GFP标记的RBC百分比除以在0时间GFP标记的RBC的百分比，确定FRBCN6或SRBCN6存活率。FRBC，新鲜红细胞24H；SRBC,储存的红细胞2周。P001，与FRBC相比的差异。0025图2A2C是显示用FRBC或SRBC输血2小时后，清醒的WTA,给予HFD的WTB以及DB/DBC小鼠中的血清铁水平的图表。对照，。
20、没有输血N4/组；FRBC,用FRBCN6/组输血；SRBC,用SRBCN6/组输血。P005，与对照和FRBC相比的差异。0026图3A3C是显示用FRBC或SRBC输血2小时后，清醒的WTA,给予HFD的WTB以及DB/DBC小鼠中，IL6A,HPB,和HXC的血浆水平的图表。对照，没有输血N4/组；FRBC,用新鲜RBCN6/组输血；SRBC,用储存的RBCN6/组输血。P005，与对照相比的差异；与FRBC相比的差异。0027图4A4C是显示用FRBC或SRBC输血2小时后，清醒的WTA,给予HFD的WTB以及DB/DBC小鼠中，肝HO1MRNA水平的图表。对照，没有输血N4/组；FR。
21、BC,用新鲜RBCN6/组输血；SRBC,用储存的RBCN6/组输血。P005，与对照和FRBC相比的差异。0028图5A5E是显示经历不同类型的输血10估算血容量后，清醒的WT，给予HFD的WT，或DB/DB小鼠中的体循环血压SBP,MMHG的图表。A清醒的WT小鼠中以FRBCN5或SRBCN6输血。B清醒的给予HFD的WT小鼠中以FRBCN6或SRBCN6输血。C清醒的DB/DB小鼠中，以呼吸了N12、或没有呼吸N9氧化氮INO,80PPM的FRBCN9或SRBC输血。D清醒的DB/DB小鼠中，以来自FRBCSFRBC,N11的上清液，来自SRBCSSRBC,N7的上清液，或氧化的SSRB。
22、CN6输血。E清醒的DB/DB小鼠中以洗过的FRBCN9或洗过的SRBCN6输血。FRBC,新鲜红细胞；SRBC,储存的红细胞。P005，与FRBC和SRBCINO相比的差异。0029图6A6B是显示比较用FRBCSFRBC,N6上清液，SRBCSSRBC,N6上清液，FRBCN7或SRBCN7输血之前之后，经麻醉的DB/DB小鼠中体循环血流动力测定结果的变化的图表。A输血前和输血10分钟后LVESPMMHG的变化。B输血前和输血10分钟后SVRI的变化。LVESP,左心室收缩期末压力；SVRI，体循环血管阻力指标，说明书CN104159591A4/18页7P005，与FRBC上清液或FRBC。
23、组相比的差异。0030图7是显示在添加溶液1ADDITIVESOLUTION1中储存的、白细胞减少的LEUKOREDUCED羊PRBC的体内存活率的图表。Y轴显示循环中的生物素化的PRBC。输血后第一个24小时964的生物素化的新鲜PRBC存活，而767的生物素化的储存PRBC在输血后24小时在循环中。P0001,与新鲜PRBC相比的差异值,与新鲜PRBC相比的差异值，P0001，与新鲜PRBC相比的差异值，P0002，新鲜PRBC与储存PRBC相比的差异值。PRBC浓缩的红细胞。所有数据平均值SD。0031图8A8B是显示用新鲜的和储存的PRBC输血过程中和之后，在清醒的小羊羔中测定的A肺动。
24、脉平均压，和B肺血管阻力指标的图表。一些小羊羔在用储存的PRBC输血过程中和之后接受了吸入的氧化氮。P005,储存的PRBC值与新鲜PRBC和储存的PRBCINO,ANOVA的差异。INO吸入的氧化氮；PAP肺动脉平均压；PRBC浓缩的红细胞；PVRI肺血管阻力指标。全部数据平均值SD。0032图9A9C是显示用新鲜的和储存的PRBC输血过程中和之后测定的A肺动脉平均压,B肺毛细血管楔压，和C肺血管阻力指标的图表。一些小羊羔在用储存的PRBC输血过程中和之后接受了吸入的氧化氮。P005,储存的PRBC值与新鲜PRBC和储存的PRBCINO,ANOVA的差异。LNAME在输血前施用以诱导内皮功能。
25、不良各组中，在第60分钟LNAME之前的测定值，与第50分钟和第10分钟之间的测定值的差异INO吸入的氧化氮；LNAMENG硝基L精氨酸甲基酯；PAP肺动脉平均压；PCWP肺毛细血管楔压；PRBC浓缩的红细胞；PVRI肺血管阻力指标。全部数据平均值SD。0033图10是显示用新鲜的和储存的PRBC输血之前和之后，在健康的清醒的小羊羔中测定的血浆血红蛋白水平的图表。一些小羊羔在用储存的PRBC输血过程中和之后接受了吸入的氧化氮。P005,新鲜PRBC值与储存的PRBC和储存的PRBCINO,ANOVA的差异。INO吸入的氧化氮；PRBC浓缩的红细胞。全部数据平均值SD。0034图11A11B是显。
26、示用新鲜的和储存的PRBC输血之前和之后，在清醒的小羊羔中测定的血浆A硝酸盐和B亚硝酸盐水平的图表。P005,储存的PRBCINO值与新鲜PRBC和储存的PRBC,ANOVA的差异。INO吸入的氧化氮；PRBC浓缩的红细胞。全部数据平均值SD。0035图12是显示红细胞上清液中血红蛋白种类的相对浓度的图表，所述的红细胞上清液，经由微孔气体交换器，用氮气中的气态氧化氮处理过。0036图13是显示红细胞中高铁血红蛋白相对浓度的图表，所述的红细胞，经由微孔气体交换器，用氮气中的气态氧化氮处理过。0037图14A14B是显示MAHMA/NO处理对人和鼠储存的红细胞的作用的图表。A无细胞上清液血红蛋白与。
27、胞内高铁血红蛋白红细胞水平的氧化比较，B上清液HB,M和红细胞HCT,中的血红蛋白浓度。0038图15是显示在将储存的红细胞储存2周和经1MMMAHMA/NO，5V/V，预处理的储存的红细胞输注到清醒的DB/DB小鼠之前和之后，通过非侵入性的尾部套囊测定的收缩压MMHG，P005，与用MAHMA/NO预处理的SRBC相比的差异。说明书CN104159591A5/18页80039图16显示用于气体气体转移实验的含膜设备。0040图17是显示不同的气流比例数据以平均值SD表示,N6；G1/G271,气流比例71；G1/G2141,气流比例141通过微孔的MP和聚甲基戊烯PMP膜的氧化氮浓度的图表。。
28、0041发明详述0042将储存的红细胞施用于哺乳动物引起血管收缩以及其他的副作用。本发明提供用于减少和消除施用储存的红细胞后所出现的副作用的组合物和方法。如所附的实施例中详细描述的，通过将其暴露于氧化氮，氧化储存的红细胞上清液，将胞外活性的亚铁血红蛋白转化成无活性的高铁血红蛋白，消除由于施用储存的红细胞所出现的血管收缩。0043红细胞0044红细胞可来源于自体或同种异型的供体，接下来，将其施用于受体。红细胞的储存导致在将储存所血液施用于受体后诱导血管收缩REYNOLDS等人2007PROCNATLACADSCI1041705862；BENNETTGUERRERO等人2007PROCNATLAC。
29、ADSCI1041706368。根据本申请所描述的方法，在向供体输注前，可在多种时间段例如，至少1,2,3,4,5,6,或12小时，或至少1,2,3,4,5,6,7,14,21,28,42天，或更长时间内储存人红细胞。红细胞可以，例如全血或浓缩红细胞的形式施用。0045氧化氮0046根据诸如所述红细胞样品的大小，流速，暴露于氧化氮的时间长度，相对于微孔气体渗析膜中的混合的层流程度之类的因素，和/或治疗医师认为相关的其他因素，合适用于处理红细胞样品的氧化氮浓度不尽相同，例如，从20PPM到80PPM,200PPM到500PPM,500PPM到800PPM,2,800PPM,3,000PPM,或更。
30、高。药品级的氧化氮是可商购的INOMAXTM,IKARIA,INC,CLINTON,NJ。0047用于处理红细胞样品的气态氧化氮可由储存的、压缩氧化氮气体源施用。所述的氧化氮源可以是100氧化氮，或是用N2或任何其他惰性气体例如氦稀释的。所述的氧化氮可以，以不含O2或氮气的高价氧化物的混合物形式获得并储存。需要时，可通过化学发光分析证明氧化氮的纯度。化学发光NONOX分析仪是可商购的例如MODEL14A,THERMOENVIRONMENTALINSTRUMENTS,FRANKLIN,MA。混合物中氧化氮的最终浓度可通过化学的或化学发光技术参见例如，FONTIJIN等人,ANALCHEM4257。
31、51970证明。另外，NO和NO2浓度可通过电化学分析仪方式监控。任何杂质，如NO2，可通过暴露于NAOH溶液，二氧化碳吸收剂BARALYME或者碱石灰SODALIME洗去。作为额外的对照，还可以评估最终气体混合物中的FIO2。0048将氧化氮气体施用于红细胞样品可通过，例如，N2或惰性气体中的压缩的氧化氮气体的罐和第二氮气或另一种惰性气体罐附加在设计用于将两种来源的气体混合的设备来实现。通过控制每一来源的气体的流速，可将最终施用于所述红细胞样品的氧化氮浓度保持在最佳水平。也可以利用标准的低流量混合器例如，BIRDBLENDER,PALMSPRINGS,CA使氧化氮气体与室内空气ROOMAIR。
32、混合。0049氧化氮可由N2和O2即空气通过电动氧化氮发生器生成。此种发生器如ZAPOL,USPATENTNO5,396,882中所描述。由此类设备形成的NO2可在将血液样品暴露于NO2之前，通过净化所述的气体混合物来减少。说明书CN104159591A6/18页90050用于将氧化氮递送到红细胞样品的气体递送设备可包含氧化氮计量器，以监控暴露于样品的氧化氮的总剂量。通过使用计量器，即可确定样品已经接受了所需量的氧化氮，由此可以逐渐停止或终止氧化氮的施用。计量器可将治疗性气体中的氧化氮浓度由氧化氮浓度计测定与气体流速由气体流量计测定整合，以确定暴露于所述红细胞样品的氧化氮的总量。0051可使用。
33、透气材料使得气态氧化氮扩散通过，与所述红细胞样品接触。此类材料的示例包括透气膜，如在血液氧合器中所使用的那些例如，二甲聚硅氧烷或聚烷基砜，和微孔性材料，如GORETEXTM或CELGARDTM,其允许氧化氮之类的气体分子通过其微孔，溶解在液体中。一种示例性的氧合器LIVINGSYSTEMSINSTRUMENTATIONINC,STALBANS,VERMONT的使用在后附的实施例中有描述。所述透气材料的部件可被设置成，一面与所述红细胞样品接触，另一面与氧化氮源接触，使红细胞和氧化氮源相分离，但允许氧化氮气体的单个分子通过并扩散到所述的样品中。在输注过程中，氧化氮可任选地与红细胞样品接触，由此，使。
34、从包含所述红细胞样品的容器流出的红细胞样品暴露于通过所述透气材料其允许氧化氮扩散到红细胞样品中的氧化氮，并最终施用于所述的受体。也可以使用具有第二流量SECONDARYFLOWS的气体交换器参见，例如，ZAPOL和QVIST,ARTICIALLUNGSFORACUTERESPIRATORYFAILURE,NEWYORK,ACADEMICPRESS,1976。0052可制备包含氧化氮的水溶液，用于将氧化氮递送给红细胞样品。在引入到所述红细胞样品之前，所述的氧化氮可溶解于药品可接受的载液CARRIERLIQUID中。可用于此种目的的载液包括标准的盐溶液和小份ALIQUOTS的所述红细胞样品，以及液。
35、体，如氧化氮在其中展现高水平溶解度的碳氟化合物或有机的溶剂SHAW和VOSPERJCHEMSOCFARADAYTRANS17312391244,1977；YOUNG,SOLUBILITYDATASERIES8336351,1981，由此大量聚集的氧化氮可以在小容量的载体中递送。0053释放氧化氮的化合物0054作为所使用的氧化氮的替代或另外的选择，根据本申请所描述的方法可将释放氧化氮的化合物暴露于红细胞样品。适用于本申请的方法的释放氧化氮的化合物包括亚硝基或亚硝酰化合物S亚硝基N乙酰青霉胺，S亚硝基L半胱氨酸，和亚硝基胍，其以氧化氮组分自发释放、或在生理条件下由所述化合物转移出来为特征；化合物。
36、，其中的氧化氮是过渡金属复合物上的配体，因此可以容易地释放或在生理条件下由所述化合物转移出来例如，硝普盐，氧化氮铁氧还原蛋白或氧化氮血红素复合物；和酶代谢产生氧化氮自由基的含氮化合物例如，精氨酸，三硝酸甘油，亚硝酸异戊酯，亚硝酸钠，无机亚硝酸盐叠氮化物，和羟胺。另外的释放氧化氮的化合物包括硝酸甘油和SIN1。0055释放氧化氮的化合物可以是超短作用释放氧化氮的化合物，例如12羧基吡咯烷1基二氮烯1鎓1,2二氧化物“PROLI/NO”,1羟基2氧代3N甲基3氨基丙基3甲基1三氮烯“NOC7”；ZHANG等人1996CIRCULATION942235，N,N二甲基乙二胺的氧化氮加合物“DMHD/N。
37、O”；KAUL等人1997JCARDIOVASCPHARMACOLTHER199723181，或Z1N甲基N6N甲基铵基己基氨基二氮烯1鎓1,2二氧化物“MAHMA/NO”。在一些具体实施方案中，所述的超短作用释放氧化氮的化合物具有低于90分钟或低于60分钟，低于30分钟，低于20分钟，低于10分钟，低于5分钟，低于2分钟，或低于1分钟的半寿期。说明书CN104159591A7/18页100056已知的化合物或据信可以释放氧化氮的化合物例如，超短作用释放氧化氮的化合物可使用本申请所述的动物模型直接试验其效力。此外，此种化合物可首先根据其激发鸟苷酸环化酶的能力进行筛选，在如ISHII等人1991。
38、AMJPHYSIOL261H598H603所描述的体外试验中，氧化氮结合鸟苷酸环化酶并由此发挥其生物学活性。0057以下是实施本发明的实施例。所述实施例不以任何形式构成对本发明范围的限制。实施例0058实施例1小鼠中糖尿病加剧AUGMENTS以及氧化氮防止同基因的SYNGENEIC储存血液输血后的不良血流动力影响0059动物0060所有的动物研究均得到位于MASSACHUSETTSGENERALHOSPITAL,BOSTON,MA的动物研究委员会的许可。对810周龄的雄性C57BL/6J野生型WT小鼠和B6CGM/LEPRDB/JC57BL/6J背景糖尿病DB/DB小鼠进行了研究。另外的WT小。
39、鼠饲喂高脂饮食60KCAL脂肪；RESEARCHDIETS,INC,NEWBRUNSWICK,NJ46周给予HFD的WT。810周龄的,在其红细胞上表达GFP的、雄性、绿荧光蛋白GFP转基因C57BL/6TGUBCGFP30SCHA/JC57BL/6J背景小鼠用于测定RBC存活率。全部的小鼠均由JACKSONLABORATORYBARHARBOR,ME获得。0061鼠血液收集与储存0062在无菌条件下，通过开胸心脏穿刺将C57BL/6JWT小鼠的血液1ML/小鼠收集到含CPDA1的注射器SIGMAALDRICH,STLOUIS,MO中。CPDA1的终浓度是14。收集后，使血液通过新生儿白细胞减。
40、少滤器NEONATALLEUKOREDUCTIONLTERPALLBIOMEDICALPRODUCTSCO,EASTHILLS,NY，减少白细胞。减少了白细胞的血液600G离心15MIN，去除血浆调节血细胞比容HCT7075，于4下储存于EPPENDORF管。利用鲎变形细胞溶解物试验LAL参见NOVITSKY等人JCLINMICROBIOL1985；212116测定新鲜的白细胞减少的鼠RBCFRBC或储藏的白细胞减少的鼠RBCSRBC样品中脂多糖LPS水平。0063储存的RBC组分的制备0064将FRBC或SRBC在4，以400G离心10MIN后获得上清液。为使得因洗涤导致的溶血降至最低，用1。
41、0倍体积的15氯化钠轻柔洗涤FRBC和SRBC，并于4下400G离心10MIN。输血前,洗过的FRBC或SRBC重悬于新鲜的鼠血浆以获得最终7075的HCT。0065为氧化SRBC上清液中的亚铁HB，将所述的上清液暴露于经由氧合器LIVINGSYSTEMSINSTRUMENTATIONINC,STALBANS,VERMONT的、于氮气中的800PPM氧化氮气体2小时，以产生METHBYU等人,CIRCULATION2008；117198290。将上清液2ML以3L、09盐水透析3次SPECTRA/POR分子多孔膜MWCO1214,000,SPECTRUMLABORATORIESINC,RANC。
42、HODOMINGUEZ,CA以减少低分子量的氧化氮代谢物。0066储存的鼠RBC中的生化,血液学和形态改变0067测定ABL800FLEX,RADIOMETER,WESTLAKE,OHFRBC和SRBC中的血气张力PCO2和PO2,PH,以及标准碱过剩SBE。FRBC和SRBC中的电介质浓度钠，钾，钙，氯化物，HCO3说明书CN104159591A108/18页11和乳酸盐也进行了测定CRITICALCAREXPRESS,NOVABIOMEDICAL,WALTHAM,MA。0068为确定上清液中的HB水平，在4下，将FRBC或SRBC，以1700G离心8MIN，用QUANTICHROMHB分析。
43、试剂盒BIOASSAYSYSTEMS,HAYWARD,CA测定上清液HB水平。利用下述标准公式计算溶血溶血上清液HB1HCT/总HB100参见KAMEL等人,BLOODTRANSFUS2010；82606。0069为研究储存对于RBC形态的影响，将FRBC或SRBC涂片并用HEMA3手工染色系统FISHERDIAGNOSTICS,MIDDLETOWN,VA染色，利用配PLANFLUOR60X干物镜的NIKONEDIPSE80I立式显微镜NIKONINSTRUMENTSINC,MELVILLE,NY获得图像。0070用HEMOX分析仪TCSSCIENTICCORP,NEWHOPE,PA确定FRB。
44、C和SRBC的氧解离曲线ODC向5ML含有20L添加剂AADDITIVEA和10L消泡剂的HEMOX溶液中添加20L的RBC。P50，定义为HB为50时的氧分压，由ODC计算。FRBC和SRBC中的2,3DPG水平利用2,3DPG试剂盒ROCHEDIAGNOSTICS,MANNHEIM,GERMANY测定。0071测定鼠RBC存活率0072GILSON等人GILSON等人,TRANSFUSION2009；49154653报道的GFP标记的RBC法，用于测定经输血的鼠RBC存活率。简要地说，通过心脏穿刺由UBCGFP和WT小鼠收集血液到含CPDA1的1ML注射器中，制备含40来自UBCGFP小鼠。
45、的RBC和60来自WT小鼠的RBC的血液混合物，减少白细胞，离心，于4下储存24小时FRBC，和2周SRBC。用含有GFP标记的RBC的100LFRBC或SRBC，通过尾静脉，向WT小鼠输血。在输血10MIN,30MIN,1小时，24小时，和8天后,从后眼窝获取血样，收集到肝素化的玻璃毛细管中。GFP阳性RBC的百分比通过正向散射/侧向散射FSC/SSC在5LASERLSRFORTESSABDBIOSCIENCES,SANJOSE,CA上确定。在不同的获取天数通过SPHERO彩虹荧光颗粒SPHEROTECHINC,LAKEFOREST,IL将流式细胞仪校准到相同的设置。用输血24小时后测定的G。
46、FP阳性RBC的百分数除以0时刻GFP阳性RBC的百分数，计算输血24小时后的RBC存活率。根据第10分钟，第30分钟和1小时的数据，由线性回归外推0时刻的荧光。0073输血2小时后的生化分析0074FRBC或SRBC输血后，在第2小时腹膜内注射戊巴比妥200MG/KG。通过心脏穿刺由每只小鼠收集约1ML血液到肝素化的注射器中，在4下，4000RPM离心8分钟。获得肝素化的血浆，以进行血液化学、白介素6IL6、触珠蛋白HP,和血红素结合蛋白HX水平的测定。获取血清以测定铁水平。肝脏样品在液氮中速冻，用于接下来确定血红素加氧酶1HO1。0075为比较FRBC或SRBC输血的急性生化影响，在输血后。
47、10分钟，腹膜内注射戊巴比妥200MG/KG，将12只WT和12只DB/DB小鼠处死。通过心脏穿刺获得全血，以进行血液化学测定。0076血清铁水平测定0077利用IRON/UNSATURATEDIRONBINDINGCAPACITYASSAYTHERMOFISHERSCIENTIC,MIDDLETOWN,VA确定血清铁水平。0078血浆IL6，HP,和HX水平的测定0079利用DUOSET小鼠IL6ELISA试剂盒RDSYSTEMS,MINNEAPOLIS,MN确定血说明书CN104159591A119/18页12浆IL6水平。分别利用小鼠HP和HXELISA试剂盒LIFEDIAGNOSTIC。
48、S,INC,WESTCHESTER,PA测定血浆HP和HX水平。0080组织MRNA水平的定量0081利用TRIZOL试剂INVITROGENLIFETECHNOLOGIES,CARLSBAD,CA从鼠肝脏提取总MRNA。通过反转录酶反应MMLVRT,INVITROGENLIFETECHNOLOGIES,CARLSBAD,CA合成CDNA。转录物的实时扩增，以SYBR法利用EPPENDORFMASTERCYCLERREALPLEXEPPENDORF,HAMBURG,GERMANY进行。靶转录物的相对表达归一化至18SRRNA的水平，并利用相对CT方法进行分析。0082FRBC或SBRC输血后在。
49、清醒的WT,给予HFD的WT，和DB/DB小鼠中进行非侵入性血压测定0083FRBC,SRBC，洗过的FRBC和SRBC,来自FRBC和SRBC的上清液，和经氧化的来自SRBC的上清液，经尾静脉输入TRANSFUSED到总输入体积是预估血容量的10WT,给予HFD的WT,或DB/DB小鼠。利用非侵入性血压系统XBP1000,KENTSCIENTIFIC,TORRINGTON,CTYU等人,CIRCULATION2008；117198290；YU等人,ANESTHESIOLOGY2010；11258694测定收缩压。全部的尾静脉注射在1分多钟OVERONEMINUTE的时间内进行。一组DB/DB小鼠接受了SRBC，并且从输血前10分钟到输血后2小时，利用YU等人,CIRCULATION2008；117198290中所描述的方法，呼吸空气中的80PPM氧化氮MEDICALTECHNICALGASES,INC,MEDFORD,MA。0084在经麻醉的小鼠中侵入性的血流动力测定0085侵入性的血流动力测定，如YU等人,ANESTHESIOLOGY2010；11258694。