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1、10申请公布号CN104160964A43申请公布日20141126CN104160964A21申请号201410463059422申请日20140912A01H4/0020060171申请人南京通泽农业科技有限公司地址210046江苏省南京市栖霞区尧化街道甘家边108号1幢701室72发明人杨存54发明名称一种露兜树悬浮细胞的快速繁殖方法57摘要本发明研究了一种露兜树悬浮细胞培养的快速繁殖方法，包括酶解法组织破碎、愈伤组织诱导、愈伤组织继代、悬浮细胞培养等步骤。本发明方法利用了酶技术缩短了细胞培养周期，生产能耗低且无污染，工艺流程简单，有利于建立露兜树悬浮细胞的大规模工厂化生产，为药用成分的。
2、提取提供新的途径。51INTCL权利要求书1页说明书2页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书2页10申请公布号CN104160964ACN104160964A1/1页21一种露兜树悬浮细胞的快速繁殖方法，其特征是露兜树的叶片经放入打浆机NT营养液中打浆，每2G加入20ML，打浆液加入50MG/L纤维素酶和果胶酶，静止5小时，用50微目微孔过滤器过滤，接入恒温震荡器中悬浮培养，培养基为6,7V0525MG/L2,4D011MG/LKT，7天继代一次，用120目不锈钢网过滤，洗涤，烘干。2根据权利要求1所述的一种露兜树悬浮细胞的快速繁殖方法，其特征是所述的消毒处理为。
3、选用露兜树幼嫩的叶片，洗去表面污渍，25的次氯酸钠中浸泡15MIN，无菌水冲洗至无残留。3根据权利要求1所述的一种露兜树悬浮细胞的快速繁殖方法，其特征是悬浮细胞的培养方法为处理过的露兜树叶片，接入250ML锥形瓶中，接种量为15G/L，细胞浓度1035细胞/ML，转速150200R/MIN，每七天换一次培养液。4根据权利要求1所述的一种露兜树悬浮细胞的快速繁殖方法，其特征是悬浮细胞的培养条件为蔗糖40G/L，PH58，生长培养基于121高压灭菌20MIN，温度23，光照12H/D。权利要求书CN104160964A1/2页3一种露兜树悬浮细胞的快速繁殖方法技术领域0001本发明涉及组培条件下露。
4、兜树悬浮细胞的培养，属于植物技术领域。背景技术0002露兜树，灌木或乔木，PANDANUSUTILIS，别名林茶、华露兜等，原产马达加斯加。喜光，喜高温、多湿气候，适生于海岸砂地，常生于海边沙地。产福建、台湾、广东、海南、广西、贵州和云南等省区。生于海边沙地或引种作绿篱。也分布于亚洲热带、澳大利亚南部。露兜树的根可治感冒发热、眼热疼痛；叶芽可治烂脚；果可补脾胃、固元气、解酒毒主治肝热虚火、肝硬化腹水、中暑等，并有降血糖功效；果核治睾丸炎及痔疮。药用性味甘、淡、凉。效用叶发汗解表，清热解毒，利尿。根治感冒发热，肾炎水肿，尿路感染、结合，肝炎，肝硬化腹水，眼结膜炎；果治痢疾；咳嗽；果核治睾丸炎，痔。
5、疮。孕妇忌服。露兜树全身是宝，有着很广阔的开发前景的。目前主要采用分株或播种繁殖。组培方法研究目前尚处于起步阶段，悬浮细胞培养还无人研究，悬浮细胞具有操作简单可控，生产成本低，繁殖率高等优点。发明内容0003本发明所要解决的技术问题是提供露兜树悬浮细胞培养的快速繁殖方法，通过酶技术缩短了组织培养的繁殖周期，工艺流程简单可控。0004为解决上述技术问题，本发明采用下列技术方案选用露兜树幼嫩的叶片，洗去表面污渍，25的次氯酸钠中浸泡15MIN，无菌水冲洗至无残留，消毒过的叶片经放入打浆机NT营养液中打浆，每2G加入20ML，打浆液加入50MG/L纤维素酶和果胶酶，静止5小时，用50微目微孔过滤器过。
6、滤，接入250ML锥形瓶中，接种量为15G/L，细胞浓度1035细胞/ML，恒温震荡器中悬浮培养，转速150200R/MIN，培养基为6,7V0525MG/L2,4D011MG/LKT，附加蔗糖40G/L，PH58，生长培养基于121高压灭菌20MIN，温度23，光照12H/D，7天继代一次，用120目不锈钢网过滤，洗涤，烘干。0005采用本发明制备的露兜树悬浮细胞，生长速度快，能耗小，污染小，次生代谢物含量高。0006下面将结合具体实施方式对本发明作进一步阐述，但本发明要求保护的范围并不局限于下列实施方式。具体实施方式0007实施例1选用露兜树幼嫩的叶片，洗去表面污渍，25的次氯酸钠中浸泡1。
7、5MIN，无菌水冲洗至无残留，消毒过的叶片经放入打浆机NT营养液中打浆，每2G加入20ML，打浆液加入50MG/L纤维素酶和果胶酶，静止5小时，用50微目微孔过滤器过滤，接入250ML锥形瓶中，接种量为15G/L，细胞浓度1035细胞/ML，恒温震荡器中悬浮培养，转速150200R/MIN，培养基说明书CN104160964A2/2页4为6,7V05MG/L2,4D01MG/LKT，附加蔗糖40G/L，PH58，生长培养基于121高压灭菌20MIN，温度23，光照12H/D7天继代一次，用120目不锈钢网过滤，洗涤，烘干，成活率89。0008实施例2选用露兜树幼嫩的叶片，洗去表面污渍，25的次。
8、氯酸钠中浸泡15MIN，无菌水冲洗至无残留，消毒过的叶片经放入打浆机NT营养液中打浆，每2G加入20ML，打浆液加入50MG/L纤维素酶和果胶酶，静止5小时，用50微目微孔过滤器过滤，接入250ML锥形瓶中，接种量为15G/L，细胞浓度1035细胞/ML，恒温震荡器中悬浮培养，转速150200R/MIN，培养基为6,7V20MG/L2,4D05MG/LKT，附加蔗糖40G/L，PH58，生长培养基于121高压灭菌20MIN，温度23，光照12H/D7天继代一次，用120目不锈钢网过滤，洗涤，烘干，成活率88。0009实施例3选用露兜树幼嫩的叶片，洗去表面污渍，25的次氯酸钠中浸泡15MIN，无菌水冲洗至无残留，消毒过的叶片经放入打浆机NT营养液中打浆，每2G加入20ML，打浆液加入50MG/L纤维素酶和果胶酶，静止5小时，用50微目微孔过滤器过滤，接入250ML锥形瓶中，接种量为15G/L，细胞浓度1035细胞/ML，恒温震荡器中悬浮培养，转速150200R/MIN，培养基为6,7V25MG/L2,4D1MG/LKT，附加蔗糖40G/L，PH58，生长培养基于121高压灭菌20MIN，温度23，光照12H/D7天继代一次，用120目不锈钢网过滤，洗涤，烘干，成活率87。说明书CN104160964A。