棕矢车菊素、高车前素及泽兰黄酮的合成方法 【技术领域】
本发明涉及新疆雪莲的活性提取物棕矢车菊素、高车前素及泽兰黄酮的人工合成方法。
背景技术
棕矢车菊素，英文名称为Jaceosidin，化学名称为4’，5，7-三羟基-3’，6-二甲氧基黄酮；高车前素，英文名称为Hispidulin，化学名称为4’，5，7-三羟基-6-甲氧基黄酮；泽兰黄酮，英文名称为Eupafolin，化学名称为3’，4’，5，7-四羟基-6-甲氧基黄酮，它们是新疆雪莲(Saussurea involucrata(Kar.et Kir.)Sch.Bip.)乙醇提取物中黄酮类化合物的三个主要成分，其中棕矢车菊素和高车前素已有报道可能通过DNA模板损伤型机制对腹水型肝癌细胞的DNA合成有显著抑制作用。
由于新疆雪莲生长环境特异、天然生长缓慢、人工栽培困难，且天然资源近年遭到盲目采挖，致使目前雪莲资源日益匮乏。进行雪莲活性成分的人工制取，既可以解决天然资源匮乏的问题，又可以满足临床上日益增长的需求。
目前所能见到的文献中，对于雪莲中活性成分的人工制取，主要集中于细胞培养方面。但细胞培养成本较高，周期较长，如中国专利CN1337467中描述的大规模培养新疆雪莲并提取新疆雪莲总黄酮的方法，生产周期近两个月，需经色谱柱分离方可得到总黄酮晶体，若要得到单纯的棕矢车菊素等化合物还需进一步分离。
在化学合成方面，现有两种合成棕矢车菊素、高车前素和泽兰黄酮的方法。
一种是由2-甲氧基间苯三酚出发，通过多步反应合成，如Kenji Fukui等(Bull.Chem.Soc.Jap.，43(5)，1524(1970))报道的五步反应合成棕矢车菊素，K.Fukui等(Experientia，25(4)，355(1969))报道的五步反应合成了泽兰黄酮，这些方法所用起始原料2-甲氧基间苯三酚不易制备，价格昂贵；路线中有两步反应需120-140℃的高反应温度，能耗高，并不适宜大规模生产。
另一种是由三羟基苯乙酮出发，通过甲基或异丙基等选择性保护酚羟基，经多步反应合成，但路线较长，效率不高，酰化和酸催化关环两步反应需120-140℃的高反应温度，能耗高，且常需使用BCl3、AlBr3等毒性或腐蚀性试剂，不适宜大规模生产。如D.Kavvadias等(British Journal ofPharmacology，142，811(2004))通过九步反应合成了高车前素，但涉及反复的烷基化、去烷基化，路线长，且需使用剧毒的BCl3和腐蚀性很强的AlCl3等。M.Iinuma等(Yakugaku Zasshi，104(6)，691(1984))通过异丙基保护的方法合成了泽兰黄酮，但脱除异丙基时容易破坏产物中的甲基醚，且同样需要使用剧毒的BCl3。T.Horia等(Bull.Chem.Soc.Jap.，56(12)，3773(1983))通过对多甲基取代的黄酮选择性脱甲基合成了高车前素和泽兰黄酮，但选择性不易控制，且使用了腐蚀性很强的AlBr3。
【发明内容】
为解决上述现有技术中存在的缺陷，本发明旨在提供一种新的操作简单、反应条件温和、步骤较少、适合大规模制备棕矢车菊素、高车前素及泽兰黄酮的方法。
为此目的，本发明提供了一种从2，4，6-三羟基苯乙酮(II)出发合成化合物(I)的方法，
其中，R为-OCH3、-OH或H，所述方法包括如下过程：
(1)2，4，6-三羟基苯乙酮(II)与酚羟基的保护基试剂进行羟基保护反应，生成2-位和4-位羟基被保护的化合物(III)，所述保护基试剂为苄基类化合物，P为与所述保护基试剂相应的苄基类酚羟基保护基团。
(2)化合物(III)与氧化剂进行氧化反应，生成化合物(IV)。
(3)化合物(IV)与甲基化试剂进行甲基化反应，生成化合物(V)。
(4)化合物(V)与芳基酰氯化合物(VI)进行酰化反应，生成化合物(VII)，其中，当R为-OCH3时，R’亦为-OCH3；当R为-OH时，R’为-OP”；当R为H时，R’亦为H；P’和P”各为苄基类酚羟基保护基团；且所述酰化反应在溶剂中及有碱存在的条件下进行，反应温度为0～100℃。
(5)化合物(VII)进行关环反应，生成化合物(VIII)，其中，所述关环反应在溶剂中及有酸存在的条件下进行，反应温度为0～80℃。
(6)化合物(VIII)经氢化反应，脱去其上的全部所述酚羟基保护基团生成化合物(I)。
上述各反应由下述反应式表示：
在本发明的实施方式中，所述保护基试剂选自下组物质中的一种：苄基、对甲氧基苄基、对硝基苄基、2，4-二甲氧基苄基、二苯甲基的氯化物或溴化物或磺酸酯，P则与所述保护基试剂相对应地为苄基、对甲氧基苄基、对硝基苄基、2，4-二甲氧基苄基或二苯甲基。
在本发明的实施方式中，所述P’和P”各选自下组之一：苄基、对甲氧基苄基、对硝基苄基、2，4-二甲氧基苄基、和二苯甲基
在本发明一优选实施方式中，所述酰化反应的反应温度为60～90℃。
在本发明一优选实施方式中，所述关环反应中的所述溶剂选自：醋酸、乙腈、和水；所述酸选自：硫酸、盐酸、和醋酸；且反应温度为40-60℃。
在本发明一优选实施方式中，所述氢化反应在溶剂中且有催化剂存在和氢气压力下进行，其中，所述催化剂选自：钯碳、钯碳酸钙、钯硫酸钡、醋酸钯和氯化钯；所述溶剂选自：甲醇、乙醇、异丙醇、正丁醇、乙酸乙酯、乙酸甲酯、乙酸异丙酯及它们的混合物；所述氢气压力为1～5个大气压；反应温度为20～50℃。
与现有制备棕矢车菊素、高车前素或泽兰黄酮方法相比，本发明的优点在于：1、本发明避免了细胞培养法中生产周期长、成本高的缺点；2、本发明避免了现有的以2-甲氧基间苯三酚作为起始原料的合成方法，所用原料2，4，6-三羟基苯乙酮成本低廉，降低了生产成本；3、本发明通过苄基或其衍生物的作为酚羟基保护基团，避免了反复更换烷基保护基的方法，不但减少了反应步骤，而且在脱保护基只需进行温和的氢化反应，无需使用剧毒或腐蚀性的BCl3或AlCl3等试剂，从而更有利于大规模制备、安全生产以及降低生产成本；4、本发明避免了文献报道的合成方法在酰化和关环两步反应中120～140℃的高反应温度，反应在较低温度下进行，降低能耗的同时提高了生产安全性。另外，本发明所提供的合成方法所得到的产物的收率与文献报道的合成方法相当。
【具体实施方式】
下面对本发明作详细说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解和实施本发明。
本发明提供了一种从2，4，6-三羟基苯乙酮(II)出发合成化合物(I)的方法。
其中，当R为甲氧基-OCH3时，目标化合物(I)为棕矢车菊素，即4’，5，7-三羟基-3’，6-二甲氧基黄酮，记为化合物(Ia)；
当R为羟基-OH时，则化合物(I)为泽兰黄酮，即3’，4’，5，7-四羟基-6-甲氧基黄酮，记为化合物(Ib)；
当R为H时，化合物(I)为高车前素，即4’，5，7-三羟基-6-甲氧基黄酮，记为化合物(Ic)。
下面对本发明从化合物(II)制备化合物(I)的过程作具体描述。
(1)由化合物(II)制备化合物(III)。
将化合物(II)与酚羟基保护基试剂进行羟基保护反应，生成2-位和4-位羟基被保护地化合物(III)。
所述羟基保护反应在适当碱的作用下进行的，所用碱为选自碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钠、碳酸氢钾、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化锂、氢氧化钙、氧化钙等的无机碱。首选的碱为碳酸钠、碳酸钾、氢氧化钠、氢氧化钾。碱的用量为底物的0.5～5当量。
一般地，所述羟基保护反应在有机溶剂中进行的，所用溶剂为：选自苯、甲苯、二甲苯的芳香烃；选自二氯甲烷、氯仿、二氯乙烷的卤代烃；选自四氢呋喃、乙醚、2-甲基四氢呋喃、二氧六环、乙二醇二甲醚、二乙二醇二甲醚、二乙二醇二乙醚的醚；N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺、六甲基磷酰三胺；丙酮；或乙腈。首选的溶剂为甲苯、二氯甲烷、四氢呋喃、二氧六环、N，N-二甲基甲酰胺、六甲基磷酰三胺、丙酮、乙腈。底物的浓度为0.1～10摩尔/升。
可用于保护所述2-位和4-位羟基的苄基类化合物均可作为羟基保护基试剂用于本发明的羟基保护反应，所述苄基类化合物的例子可包括：苄基、对甲氧基苄基、对硝基苄基、2，4-二甲氧基苄基、二苯甲基的氯化物或溴化物或磺酸酯。更具体地，所用保护基试剂的具体例子包括：溴化苄、氯化苄、对硝基氯苄、对硝基溴苄、对甲氧基氯苄、对甲氧基溴苄。化合物(III)中的P则为与所用保护基试剂所含苄基化合物相对应的苄基类酚羟基保护基团。
一般地，所述羟基保护反应可在常温下进行，但也可在更宽的反应温度范围，如0～100℃下进行。
本发明从化合物(II)制备化合物(III)的具体操作过程大致如下：
在三口瓶中加入化合物(II)、保护基试剂、碱以及溶剂，然后搅拌16～24小时，过滤，所得滤液倒入冰水中，酸化，析出的固体过滤收集，加入甲醇和丙酮，加热搅拌溶解，冷却，析出的固体过滤，氯饼用少量丙酮洗涤，即得化合物(III)。
(2)由化合物(III)制备化合物(IV)。
化合物(III)与氧化剂进行氧化反应生成化合物(IV)。
该氧化反应是在适当的溶剂中进行的，所用溶剂为下组中的一种或几种的组合：选自苯、甲苯、二甲苯的芳香烃；选自二氯甲烷、氯仿、二氯乙烷的卤代烃；选自四氢呋喃、乙醚、2-甲基四氢呋喃、二氧六环、乙二醇二甲醚、二乙二醇二甲醚、二乙二醇二乙醚的醚；丙酮；吡啶；乙腈或水。首选的溶剂为甲苯、二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃、丙酮、吡啶、水。反应的浓度为0.1～10摩尔/升。
所述氧化剂为以下的一种：过硫酸钾、过硫酸钠、过硫酸铵、过硫酸氢钾复盐(oxone)、双氧水、过氧乙酸、间氯过氧苯甲酸、三氟过氧乙酸等。氧化剂用量为底物的0.5～10当量。该氧化反应温度为0～100℃。
本发明从化合物(III)制备化合物(IV)的具体操作过程大致如下：
在三口瓶中加入化合物(III)、氧化剂以及溶剂，搅拌反应24～36小时，加入亚硫酸钠淬灭，加入乙酸乙酯提取，干燥浓缩，浓缩后残留物经柱层析分离得到化合物(IV)。
(3)由化合物(IV)制备化合物(V)。
化合物(IV)与甲基化试剂进行甲基化反应，生成化合物(V)
本发明的甲基化反应是在适当的溶剂中进行的，所用溶剂可以是：选自二氯甲烷、氯仿、二氯乙烷的卤代烃；选自四氢呋喃、乙醚、2-甲基四氢呋喃、二氧六环、乙二醇二甲醚、二乙二醇二甲醚、二乙二醇二乙醚的醚；丙酮；或乙腈。首选的溶剂为二氯甲烷、四氢呋喃、丙酮或乙腈。反应的浓度为0.1～10摩尔/升。
所述甲基化反应是在适当的碱的作用下进行的，所用碱可以是选自碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钠、碳酸氢钾、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化锂、氢氧化钙、氧化钙、氢化钠等的无机碱。首选的碱为：碳酸钾、氢氧化钠、氢化钠。碱的用量为底物的0.5～5当量。
所述甲基化反应中，所用的甲基化试剂可以是以下的一种：碘甲烷、硫酸二甲酯、碳酸二甲酯。
本发明从化合物(IV)制备化合物(V)的具体操作过程大致如下：
在三口瓶中加入化合物(IV)、甲基化试剂、碱以及溶剂，加热搅拌2～6小时，冷却，加入乙酸乙酯提取，干燥浓缩，浓缩后残留物经柱层析分离得到化合物(V)。
(4)由化合物(V)制备化合物(VII)。
化合物(V)与芳基酰氯化合物(VI)进行酰化反应，生成化合物(VII)。
其中，当本发明的目标产物为化合物(Ia)时，即R为-OCH3时，该芳基酰氯化合物中的R’为-OCH3；当本发明的目标产物为化合物(Ib)时，即R为-OH时，R’为-OP”；当本发明的目标产物为化合物(Ic)时，即R为H时，R”亦为H。还有，P’和P”各为苄基类酚羟基保护基团。
本发明的酰化反应是在适当的溶剂中进行的，所用溶剂可以是：选自苯、甲苯、二甲苯的芳香烃；选自二氯甲烷、氯仿、二氯乙烷的卤代烃；选自四氢呋喃、乙醚、2-甲基四氢呋喃、二氧六环、乙二醇二甲醚、二乙二醇二甲醚、二乙二醇二乙醚的醚；丙酮；吡啶；乙腈或水。首选的溶剂为甲苯、二氯甲烷、四氢呋喃、吡啶。反应的浓度为0.1～10摩尔/升。
所述酰化反应是在适当的碱的作用下进行的，所用的碱为：选自碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钠、碳酸氢钾、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化锂、氢氧化钙、氧化钙、氢化钠等的无机碱，或选自三乙胺、二异丙基乙基胺、吡啶、4-N，N-二甲基氨基吡啶的有机碱。首选的碱为：碳酸钾、氢氧化钠、氢氧化钾、吡啶。碱的用量为底物的0.5～10当量。
在现有的三羟基苯乙酮出发制备化合物(I)的酰化反应中，反应温度为120～140℃。而本发明所述酰化反应可以在较低的温度下进行，而得到与现有技术中相近的反应收率。具体地，本发明酰化反应可以在0～100℃下进行，较佳的反应温度为60～90℃，最好是50～80℃。采用本发明的酰化反应温度可以降低反应能耗，并降低设备要求。
与前述羟基保护基团P一样，芳基酰氯化合物中的P’和P”(如果有的话)均为苄基类酚羟基保护基团，具体的例子为：苄基、对甲氧基苄基、对硝基苄基、2，4-二甲氧基苄基、二苯甲基等。P、P’和P”可以是相同或不同的苄基类基团。这些苄基类基团在本发明方法最后的脱保护基反应中易于脱除。与使用烷基类保护基团相比，使用苄基类保护基团，在脱除过程中只需温和的氢化反应，而无需使用腐蚀性很强的AlCl3或剧毒的BCl3。
本发明从化合物(V)制备化合物(VII)的具体操作过程大致如下：
在三口瓶中加入化合物(V)、芳基酰氯(VI)、碱以及溶剂，加热搅拌2小时，冷却，加入乙酸乙酯提取，干燥浓缩，浓缩后残留物用适当溶剂溶解，加入碱，加热搅拌2～3小时，冷却，加入乙酸乙酯提取，干燥浓缩，浓缩后残留物经柱层析分离得到化合物(VII)。
(5)由化合物(VII)制备化合物(VIII)。
化合物(VII)进行关环反应，生成化合物(VIII)，其中，所述关环反应在溶剂中及有酸存在的条件下进行。
本发明的关环反应是在适当的溶剂中进行的，所用溶剂为：选自苯、甲苯、二甲苯的芳香烃；选自二氯甲烷、氯仿、二氯乙烷的卤代烃；醋酸；乙腈或水。首选的溶剂为：醋酸、乙腈、水。反应的浓度为0.1～10摩尔/升。
所述关环反应是在适当的酸的作用下进行的，所用的酸的例子有：硫酸、盐酸或醋酸。
所述关环反应的反应温度为0～80℃，优选为40-60℃。已知的从三羟基苯乙酮出发制备化合物(I)的关环反应在120～140℃的高温下进行。而本发明所用的关环反应温度远低于该温度，而得到与现有技术中相近的反应收率。因此，采用本发明的关环反应温度可以降低反应能耗，并降低对设备的要求。
本发明从化合物(VII)制备化合物(VIII)的具体操作过程大致如下：
在三口瓶中加入化合物(VII)、酸以及溶剂，加热搅拌2～6小时，冷却，加入乙酸乙酯提取，干燥浓缩，浓缩后残留物直接用于下一步。
(6)由化合物(VIII)制备化合物(I)。
化合物(VIII)经氢化反应，脱去其上的全部所述酚羟基保护基团P、P’和P”(如果有的话)生成目标化合物(I)。
本发明的氢化反应是在适当的溶剂中进行的，所用溶剂为醇或酯，具体地，可以是以下一种或几种的混合物：甲醇、乙醇、异丙醇、正丁醇、乙酸乙酯、乙酸甲酯、及乙酸异丙酯。
所述氢化反应是在适当的催化剂作用下进行的，所用氢化催化剂的例子包括：钯碳、钯碳酸钙、钯硫酸钡、醋酸钯、氯化钯等，优选为钯碳。
所述氢化反应的反应温度为20～50℃，氢气压力为1～5大气压。
由于本发明的氢化反应需脱去的羟基保护基团P、P’和P”为苄基类，因此无需使用腐蚀性很强的AlCl3或剧毒的BCl3。
本发明从化合物(VIII)制备化合物(I)的具体操作过程大致如下：
在三口瓶中加入化合物(VIII)、催化剂以及溶剂，在合适压力下氢化，反应完毕后过滤，滤液浓缩，残留物经柱层析分离得到化合物(I)。
实施例
下面通过实施例进一步详细说明本发明的技术方案，但本发明的保护范围不限于此。
实施例一
将33.6克化合物(II)、350毫升N，N-二甲基甲酰胺、83克碳酸钾依次加入1000毫升三口反应瓶中，冷却至0℃，电磁搅拌下滴加49.9毫升溴化苄的50毫升N，N-二甲基甲酰胺溶液，25℃下搅拌16小时，过滤，滤液倒入500毫升冰水中，以浓盐酸酸化至pH＝4，搅拌1小时，过滤，滤饼以甲醇和丙酮重结晶得49.2克化合物(III)，收率71％。
将1.74克化合物(III)、10毫升丙酮、10毫升二氯甲烷、20毫升磷酸缓冲液(pH＝7.7)依次加入100毫升三口反应瓶中，电磁搅拌下滴加9.3克过硫酸氢钾复盐(oxone)的30毫升水溶液，并同时滴加10％氢氧化钠水溶液以保持体系pH＝7.5～8，25℃下搅拌24小时，加入亚硫酸钠淬灭，加入乙酸乙酯提取，依次以水和饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，残留物经快速柱层析分离得270毫克化合物(IV)，收率15％。
将182毫克化合物(IV)、5毫升丙酮、138毫克碳酸钾和89毫克硫酸二甲酯依次加入10毫升反应瓶中，电磁搅拌下回流反应2小时，冷却，加入乙酸乙酯提取，依次以水和饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，残留物经快速柱层析分离得130毫克化合物(V)，收率69％。
将120毫克化合物(V)、2毫升吡啶和184毫克3-甲氧基-4-苄氧基苯甲酰氯(即化合物(VI)，其中P’为苄基，R’为-OCH3)依次加入10毫升反应瓶中，电磁搅拌下70℃℃进行酰化反应2小时，冷却，加入乙酸乙酯提取，依次以水和饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，向所得残留物中加入10毫升吡啶和500毫克氢氧化钾，电磁搅拌下70℃反应2小时，冷却，加入乙酸乙酯提取，依次以水和饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，所得残留物经快速柱层析分离得148毫克化合物(VII)，收率75％。
将62毫克化合物(VII)、5毫升醋酸和1滴浓硫酸依次加入10毫升反应瓶中，电磁搅拌下80℃反应2小时，冷却，加入乙酸乙酯提取，依次以水、饱和碳酸氢钠水溶液和饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，所得残留物(VIII)直接用于下步反应。
将上步反应所得残留物溶于5毫升甲醇，加入5毫克钯碳，电磁搅拌，在1大气压氢气压力下25℃反应6小时，过滤，滤液减压浓缩，经柱层析分离得到化合物(Ia)，即为棕矢车菊素(Jaceosidin)，18毫克，收率65％，。
实施例二
将实施例一的酰化反应中的3-甲氧基-4-苄氧基苯甲酰氯换为3，4-二苄氧基苯甲酰氯(即化合物(VI)，其中P’为苄基，R’为苄氧基)，通过类似反应，得到化合物(Ib)，即泽兰黄酮(Eupafolin)。
实施例三
将实施例一的酰化反应中的3-甲氧基-4-苄氧基苯甲酰氯换为4-苄氧基苯甲酰氯(即化合物(VI)，其中P’为苄基，R’为H)，通过类似反应，得到化合物(Ic)，即高车前素(Hsipidulin)。