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1、10申请公布号CN104086643A43申请公布日20141008CN104086643A21申请号201410294514222申请日20140625C07K14/555200601C12N15/20200601C12N15/70200601A61K38/21200601A61P35/00200601A61P37/04200601A23K1/1620060171申请人中国科学院海洋研究所地址266071山东省青岛市南海路7号72发明人宋林生张冉王玲玲张峘刘瑞74专利代理机构沈阳科苑专利商标代理有限公司21002代理人周秀梅李颖54发明名称一种长牡蛎类干扰素（CGIFNLIKE）基因重组蛋白。
2、及其制备和应用57摘要本发明属于分子生物学研究领域，涉及长牡蛎CGIFNLIKE基因体外重组表达技术及其功能鉴定。本发明利用体外重组表达技术获得了长牡蛎类干扰素重组蛋白，发现长牡蛎CGIFNLIKE基因体外重组蛋白可以激活牡蛎的免疫系统，引起细胞凋亡，同时也可以促进细胞对灿烂弧菌的吞噬功能，以及抑制人肺癌细胞A549增殖的功能。利用本发明获得的重组蛋白可用于新型免疫增强剂的开发，以及海洋天然抗癌药物的开发和利用。51INTCL权利要求书1页说明书4页序列表2页附图2页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书4页序列表2页附图2页10申请公布号CN104086643A。
3、CN104086643A1/1页21一种长牡蛎类干扰素CGIFNLIKE基因重组蛋白，其特征在于CGIFNLIKE基因重组蛋白为序列表SEQIDNO1中氨基酸序列所示。2一种根据权利要求1所述的长牡蛎类干扰素CGIFNLIKE基因重组蛋白的制备方法，其特征在于1以长牡蛎CGIFNLIKE编码区为模板，采用P1和P2引物进行PCR扩增，待用；2PCR扩增产物与将PET30A载体通过T4连接酶连接，转化，测序鉴定重组子；3将上述构建重组子转入大肠杆菌TRANSETTADE3表达菌株中进行诱导培养，然后利用亲和层析化蛋白，即得到具有序列表SEQIDNO1中氨基酸序列的重组蛋白RCGIFNLIKE；所。
4、述引物P1和P2分别为P15CGGGATCCATGGAGAGGAAAAAGGAT3P25CCCAAGCTTCTAAGTCATTAATTTTCTTTC3。3一种按权利要求1所述的长牡蛎类干扰素CGIFNLIKE基因重组蛋白的应用，其特征在于所述序列表SEQIDNO1中氨基酸序列编码CGIFNLIKE体外重组的蛋白可用于制备免疫增强剂。4一种按权利要求1所述的长牡蛎类干扰素CGIFNLIKE基因重组蛋白的应用，其特征在于所述序列表SEQIDNO1中氨基酸序列编码CGIFNLIKE体外重组的蛋白可用于制备抗癌的药物。权利要求书CN104086643A1/4页3一种长牡蛎类干扰素CGIFNLIKE基因。
5、重组蛋白及其制备和应用技术领域0001本发明属于分子生物学技术领域，具体的说是一种长牡蛎类干扰素CGIFNLIKE基因重组蛋白及其制备和应用。背景技术0002干扰素IFN是机体细胞在病毒感染，或者受核酸、细菌内毒素、促细胞分裂素等的作用下，由受体细胞分泌的一种具有高度生物学活性的糖蛋白，具有抗病毒、抗肿瘤、免疫调节等生物学功能。干扰素系统是先天性免疫系统抵抗病毒感染的主要构成者，包括分泌合成干扰素的细胞系统以及接受干扰素作用的细胞系统，即指所有经病毒感染等外部刺激后能激活干扰素合成的细胞以及对干扰素的作用发生反应并建立抗病毒状态的细胞，是机体对抗病毒感染的一道重要防御系统，它与细胞免疫、体液免。
6、疫及其他非特异性免疫协同作用抵抗病毒的侵染。干扰素自发现以来引起了人们极大的兴趣，一直是病毒学、细胞学、免疫学、分子生物学、临床医学、肿瘤学等相关学科的研究热点。但由于来源限制，无法得到广泛应用，直到1986年，基因工程干扰素的出现，才使得干扰素能够大量应用于临床，干扰素的产生可以激活细胞的免疫防御系统从而清除病原体或者肿瘤。0003牡蛎是一种含有较高活性物质的海洋经济贝类，含有丰富的氨基酸、多糖、蛋白质、牛磺酸、微量元素等生物活性物质，具有很高的药用价值，而且作为低等无脊椎动物的代表，特殊的进化地位，值得人们对其进行研究开发。0004目前，干扰素系统在哺乳动物及鱼类中已经得到了较深入的研究，。
7、但是在软体动物中干扰素系统研究较少，因此对长牡蛎干扰素的研究有利于软体动物中干扰素的开发和利用。发明内容0005本发明的在于提供一种长牡蛎类干扰素CGIFNLIKE基因重组蛋白及其制备和应用。为实现上述目的，本发明采用的技术方案是0006一种长牡蛎类干扰素CGIFNLIKE基因重组蛋白，CGIFNLIKE基因重组蛋白为序列表SEQIDNO1中氨基酸序列所示。0007所述的长牡蛎类干扰素CGIFNLIKE基因重组蛋白的制备方法00081以长牡蛎CGIFNLIKE编码区为模板，采用P1和P2引物进行PCR扩增，待用；00092PCR扩增产物与将PET30A载体通过T4连接酶连接，转化，测序鉴定重组。
8、子；00103将上述构建重组子转入大肠杆菌TRANSETTADE3表达菌株中进行诱导培养，然后利用亲和层析化蛋白，即得到具有序列表SEQIDNO1中氨基酸序列的重组蛋白RCGIFNLIKE；0011所述引物P1和P2分别为说明书CN104086643A2/4页40012P15CGGGATCCATGGAGAGGAAAAAGGAT30013P25CCCAAGCTTCTAAGTCATTAATTTTCTTTC3。0014所述序列表SEQIDNO1中氨基酸序列编码CGIFNLIKE体外重组的蛋白可用于制备免疫增强剂。0015所述序列表SEQIDNO1中氨基酸序列编码CGIFNLIKE体外重组的蛋白可用于。
9、制备抗癌的药物。本发明所具有的优点0016本发明利用体外重组表达技术获得了长牡蛎类干扰素蛋白，该重组蛋白可以激活长牡蛎的细胞免疫系统引起细胞凋亡，同时也可以促进血细胞对灿烂弧菌的吞噬能力，并能抑制人肺癌细胞A549的增殖，作为一种有效的细胞免疫调节剂和增强剂，在开发广谱抗菌类药物、新型免疫制剂和饲料添加剂以及新型的海洋抗肿瘤天然活性产物等方面具有潜在应用价值。附图说明0017图1为本发明实施例提供的长牡蛎类干扰素CGIFNLIKE基因重组蛋白促进细胞凋亡的作用图。0018图2为本发明实施例提供的长牡蛎类干扰素CGIFNLIKE基因重组蛋白增强血细胞对灿烂弧菌的吞噬功能图。0019图3为本发明实。
10、施例提供的长牡蛎类干扰素CGIFNLIKE基因重组蛋白抑制小鼠成纤维细胞L929A和人肺癌细胞A549B的增殖作用图。0020其中，图3A中，RCGIFN牡蛎重组蛋白；HIFN商品化人重组干扰素蛋白；L929小鼠成纤维细胞，在RCGIFN和HIFN处理12，24，48，72H后，L929细胞的活力；0021图3B中RCGIFN牡蛎重组蛋白；HIFN商品化人重组干扰素蛋；A549人肺癌细胞，在RCGIFN和HIFN处理12，24，36，48，72H后，A549细胞的活力。具体实施方式0022下面的实验例中将对本发明作进一步的阐述，但本发明不限于此。0023实施例1长牡蛎类干扰素CGIFNLIKE。
11、基因编码区的体外原核重组表达，包括下列步骤00241重组载体的构建0025本发明中采用的重组载体为PET30A原核表达载体。通过PCR技术，使用基因特异性引物0026P15CGGGATCCATGGAGAGGAAAAAGGAT3；0027P25CCCAAGCTTCTAAGTCATTAATTTTCTTTC3，0028反应条件为首先94预变性5分钟，然后进入下列循环94变性30秒，52退火30秒，72延伸30秒，共进行35个循环，最后72延伸10分钟。将PCR产物纯化回收，双酶切后与PET30A载体连接。转化，菌落PCR筛选并测序，提取阳性克隆质粒，完成载体的构建。00292重组蛋白的表达0030以。
12、大肠杆菌TRANSETTADE3为重组表达菌株，将上述构建的重组载体转化到表说明书CN104086643A3/4页5达宿主菌中，挑取单克隆，提取质粒，测序验证读码框正确。挑取单克隆，接种于5MLLB液体卡那培养基中，37震荡摇床中培养1216小时，然后以1100的比例接种200MLLB液体卡那培养基中，37,220转，培养至OD6000507。加入IPTG，使终浓度达到1MMML1，25，150转，培养2024H。4，12000RCF，离心10MIN，收集菌体，于20冻存备用。取1ML菌液离心，弃去上清后，加入80L水和20L5蛋白上样缓冲液，100沸水煮沸10分钟，稍离心，SDSPAGE检测。
13、表达产物。00313重组蛋白的纯化0032将上述所得蛋白采用镍琼脂糖凝胶FF纯化获得了可溶性重组蛋白，具体操作步骤如下0033镍琼脂糖凝胶FF色谱分离带HIS标签的重组蛋白00341镍琼脂糖凝胶FF装柱，1620CM，柱床体积为10ML；00352用缓冲液11482GL1NAH2PO4，145GL1NA2HPO4，17532GL1NACL，平衡25个床体积，流速为2MLMIN1；00363将20ML细胞破碎液50MMPBS，PH74，03MNACL045M滤膜过滤，上样，流速为1MLMIN1；00374用缓冲液1再洗25个床体积，流速为2MLMIN1；00385用20MM咪唑的缓冲液3进行洗脱。
14、，洗去杂蛋白，流速为2MLMIN1；00396用400MM咪唑的缓冲液3进行洗脱，流速为1MLMIN1，收集洗脱峰，用SDSPAGE检测融合蛋白的表达；00407用纯水流洗5个柱床体积，再用20的乙醇流洗3个柱床体积，流速为2MLMIN1，柱子置于4环境中保存。通过亲和层系纯化的蛋白用水透析，每次在4透析12H，即得到SEQIDNO1所示的长牡蛎CGINFLIKE基因重组蛋白。0041SEQIDNO10042MERKKDKKVLKSKTLPPRKTYPAEFDDFDFFSSTDSSTDWEDVLEKKIEDLSRQLTNEKQQHRKEKQQVAKLQRELARAKSDSQKFLTVSVNLE。
15、RKLMT0043长度100个氨基酸0044类型氨基酸0045链型单链0046特性分子量为113KDA，等电点为949，0047来源长牡蛎0048实施例2长牡蛎类干扰素CGIFNLIKE原核重组蛋白促进细胞凋亡和细胞吞噬的功能分析00491将上述重组蛋白用海水稀释不同的浓度10UG/ML，1UG/ML，100NG/ML，用海水作为对照组，每只牡蛎注射10UL00502分别在0H，3H，6H，12H，取血细胞，离心后，用L15GIBCO培养基冲悬，为了维持渗透压的平衡，在培养基中加入终浓度KCL054G/L，NACL202G/L，CACL206G/L，MACL239G/L，MASO41G/L，G。
16、LUCOSE208G/L，根据碧云天ANNEXINVFITC检测试剂盒，用流式细胞仪检测重组蛋白激活的免疫系统相关指标。00513实验结果如图1和图2所示。说明书CN104086643A4/4页60052凋亡作用由图1所示0053高浓度的CGIFNLIKE处理后，血细胞在3H时凋亡率升高到最高，然后随着时间的延长，凋亡率下降；中浓度的CGIFNLIKE处理后，血细胞在6H时凋亡率最高，之后下降，而且中浓度组的凋亡率高于高浓度组；低浓度的CGIFNLIKE处理后，血细胞在12H凋亡率最高。0054因为细胞表面的受体有限，干扰素浓度过高时，细胞表面的受体已经饱和，升高浓度并不能引起凋亡率升高，所以。
17、中浓度组的凋亡率高于高浓度组，存在浓度和时间的剂量效应关系。0055吞噬作用在长牡蛎注射重组蛋白RCGIFNLIKE后0H，3H，6H，12H，收集血细胞，将上述收集的血细胞和FITC标记的灿烂弧菌孵育1H后，用流式细胞仪检测。由图2可知0056高浓度的CGIFNLIKE孵育后，长牡蛎血细胞吞噬灿烂弧菌的吞噬率在3H时开始升高，随着时间的延长，吞噬率开始下降；中浓度的CGIFNLIKE孵育后，长牡蛎血细胞在3H，6H，12H吞噬率上升，在12H达到最高，且中浓度组的吞噬率高于高浓度组；低浓度的CGIFNLIKE孵育后，长牡蛎血细胞在6H，12H吞噬率升高；CGIFNLIKE可以激活长牡蛎的免疫。
18、系统，促进机体对病原菌的清除。0057实施例3长牡蛎类干扰素CGIFNLIKE原核重组蛋白对L929和A549细胞增殖抑制功能的分析00581人肺癌细胞A549培养于含10体积比胎牛血清的1640培养基，小鼠成纤维细胞L929培养于含10体积比胎牛血清的DMEM培养基中，培养条件为置37，5CO2的培养箱内培养，取对数期细胞用于试验。00592将上述细胞分别以51031104/孔的密度接种于96孔细胞培养板，100UL/孔，置5CO2培养箱内培养1224H，待细胞贴壁后，更换各自的培养基。00603向上述细胞的培养孔中加入重组干扰素RCGIFNLIKE重组蛋白与细胞孵育，干扰素RCGIFNLI。
19、KE重组蛋白设置的剂量浓度为100NG/ML，10NG/ML，1NG/ML，每个剂量组设6个复孔，空白对照只加各自的培养基，对照组不加CGIFNLIKE重组蛋白。00614同时用商品化的人的重组干扰素IFN2A作为比较，设同样的三个浓度100NG/ML，10NG/ML，1NG/ML，每个剂量组设6个复孔，空白对照只加培养基，对照组不加人的重组干扰素IFN2A重组蛋白。00625在孵育12H，24H，36H，48H，72H后。用CCK8试剂盒检测细胞的增殖情况。0063L929细胞为小鼠成纤维细胞，是正常细胞系，用作对照组，因为向培养的细胞中加入任何非细胞成分，都可能抑制细胞的增殖，所以用正常细。
20、胞作为对照，来说明牡蛎类干扰素抑制癌细胞增殖的药效和特异性，同时用人的重组干扰素商品化的作为对照，进一步说明牡蛎干扰素的抗癌疗效参见图3。0064由图3可知L929图3A细胞系牡蛎类干扰素对其抑制率为7，人的重组干扰素为11；A549图3B细胞系人的肺癌细胞系，实验组，在36H和48H，牡蛎类干扰素对其抑制率最大达到31，而商品化的人的重组干扰素的最大抑制率为43。本实验通过L929和人的干扰素作为对照，说明了牡蛎的干扰素具有抑制癌细胞增殖的功能。说明书CN104086643A1/2页700010002序列表CN104086643A2/2页8序列表CN104086643A1/2页9图1图2说明书附图CN104086643A2/2页10图3A图3B说明书附图CN104086643A10。