分泌表达型心肌基因治疗质粒载体 【技术领域】
本发明涉及一种基因治疗质粒及其构建方法，具体地说，本发明涉及一种分泌表达型心肌基因治疗质粒载体及其构建方法。
背景技术
心肌基因治疗是一种治疗遗传性和先天性心脏病的新型方法。将外源基因转入心肌细胞内，通过基因表达，从而达到纠正或增强心肌细胞功能的目的。
根据基因治疗所用载体不同可将基因转移法分为四类：病毒载体法、非病毒性生物载体法、非生物性载体法和非载体法。质粒DNA注射属于非载体法，质粒DNA直接肌肉注射，简单易行，且注入的DNA往往不能整合入染色体中而游离于染色体之外，不会引起突变和肿瘤的发生，因此是一种较为安全的基因治疗手段。
目前进行的心肌基因治疗主要包括心肌缺血区血管发生、逆转心肌细胞肥厚和降低心肌细胞凋亡等方面。由于一般的真核表达质粒没有心肌细胞特异性启动子，不能控制在心肌细胞中特异地表达目的基因，因而大大降低了基因治疗的特异性和有效性。
【发明内容】
本发明的目的就是为了解决心脏基因治疗的靶向性问题，提供一种心脏基因治疗靶向性较好的载体，本发明的另一个目的是提供一种用于心脏基因治疗的可分泌表达目的基因的基因治疗载体及其构建方法。
本发明的目的通过下述方法得以实现。
质粒pSec-Tag2A，pSec-Tag2B，pSec-Tag2C是美国lnvitrogen公司的产品，货号为V900-20，http：//www.invitrogen.com上有登载序列和结构。
本发明的质粒的构建采用了人心肌肌球蛋白轻链(MLC-2V)启动子，取代原质粒pSec-Tag2A或pSec-Tag2B或pSec-Tag2C的CMV启动子，使之具有在心肌细胞内表达地特异性。
进一步说明是，先制备MLC-2V片段及CMV增强子片段序列，用PCR扩增连接法制备CMV增强子-MLC-2V连接片段，使其5′、3′端分别引入Mlu I和Nhe I识别序列，根据pSec-Tag2A或2B或2C多克隆位点上游CMV增强子和启动子两侧单一的MluI和NheI识别位点，以定向克隆法将CMV增强子-MLC-2V片段替换CMV增强子和启动子。构建了：
PSec-mlc-Tag2A，序列为：SEQ ID NO：1
PSec-mlc-Tag2B，序列为：SEQ ID NO：2
PSec-mlc-Tag2C，序列为：SEQ ID NO：3
本发明的载体包含以下四个特点：1、包含鼠Ig轻链V-J2-C信号肽的编码序列，V-J2-C信号肽可引导目的基因的表达产物分泌到细胞膜外，并与之分离，使得目的基因的表达产物更好地发挥生物学功能。2、该载体的多克隆位点上游采用人心肌肌球蛋白轻链(MLC-2V)启动子，MLC-2V启动子是心肌细胞的特异性表达的启动子，因此可使载体携带的目的基因特异性地在心肌细胞内表达。3、A，B，C载体分别包含3个移码读框，可以满足表达不同读框的目的基因的要求。4、能在表达目的蛋白的C-末端添加6His和C-myc表位标签，便于检测目的基因的表达效果。
本发明的质粒的碱基序列在人心肌肌球蛋白轻链2启动子区与多克隆位点间(即209～1041位碱基)不能变动，其余部分的碱基序列可以在1％范围内变异，即99％以上相同，而不影响本发明的效果。
本发明的质粒载体的构建也可以不采用上述商业质粒，而采用直接改建其它真核表达质粒的多克隆位点上游的增强子和启动子序列的方式获得。
本发明的质粒可以制成注射剂。
本发明的质粒可用于基因治疗心脏疾病。并可与其它心血管疾病药物联合应用，包括制成复方制剂。
【附图说明】
图1为本发明的pSec-MLC-Tag2A的结构图谱
pSec-MLC-Tag2A质粒构件：(5230bp)
1、人心肌肌球蛋白轻链2启动子区：209-966
2、鼠Ig轻链V-J2-C信号肽：977-1039
3、多克隆位点：1042-1153
4、C-myc表位：1154-1186
5、多组氨酸区：1199-1216
6、BGH多腺苷酸序列：1238-1452
7、f1起始区：1515-1928
8、SV40启动子和起始区：1996-2317
9、Zeocin抗性基因：2400-2774
10、SV40多腺苷酸序列：2904-3033
11、Col E1起始区：3417-4090
12、氨苄抗性基因：4235-5095
图2为本发明的pSec-MLC-Tag2B的结构图谱
pSec-MLC-Tag2B质粒构件：(5234bp)
1、人心肌肌球蛋白轻链2启动子区：209-966
2、鼠Ig轻链V-J2-C信号肽：977-1039
3、多克隆位点：1042-1157
4、C-myc表位：1158-1190
5、多组氨酸区：1203-1220
6、BGH多腺苷酸序列：1242-1456
7、f1起始区：1519-1932
8、SV40启动子和起始区：2000-2321
9、Zeocin抗性基因：2404-2778
10、SV40多腺苷酸序列：2908-3037
11、Col E1起始区：3421-4094
12、氨苄抗性基因：4239-5099
图3为本发明的pSec-MLC-Tag2C的结构图谱
pSec-MLC-Tag2C质粒构件：(5238bp)
1、人心肌肌球蛋白轻链2启动子区：209-966
2、鼠Ig轻链V-J2-C信号肽：977-1039
3、多克隆位点：1042-1161
4、C-myc表位：1162-1194
5、多组氨酸区：1207-1224
6、BGH多腺苷酸序列：1246-1460
7、f1起始区：1523-1936
8、SV40启动子和起始区：2004-2325
9、Zeocin抗性基因：2408-2782
10、SV40多腺苷酸序列：2912-3041
11、Col E1起始区：3425-4098
12、氨苄抗性基因：4243-5103
【具体实施方式】
实施例1 PSec-MLC-Tag2A质粒的构建
根据已知的人MLC-2V启动子序列，设计合成PCR引物：上游引物，5′-AATGGGAGTTTGTTTTGGACCCAGAGCACAGAG-3′，-下游引物，5′-TAATAGCTAGCGGCCGGCCCCTGCTGT-3′(Nhe I)，以人基因组DNA为模板，扩增获得MLC-2V片段(250 bp)。序列SEQ ID NO：4如下：
GACCCAGAGCACAGAGCATCGTTCCCAGGCCAGGCCCCAGCCACTGTCTCTTTAACCTTGAAGGCATTTTTGGGTCTCAC
GTGTCCACCCAGGCGGGTGTCGGACTTTGAACGGCTCTTACTTCAGAAGAACGGCATGGGGTGGGGGGGCTTAGGTGGCC
TCTGCCTCACCTACAACTGCCAAAAGCGGTCATGGGGTTATTTTTAACCCCAGGGAAGAGGTATTTATTGTTCCACAGCA
GGGGCCGGCC
根据pSec-Tag2A载体的CMV增强子序列(CMV enhancer)，设计合成PCR引物：上游引物，5′-GCCAGATATACGCGTT-3′(Mlu I)，下游引物，5′-CTCTGTGCTCTGGGTCCAAAACAAACTCCCATT-3′，以pSec-Tag2A载体为模板，扩增获得CMV enhancer片段(497bp)。序列SEQ ID NO：5如下：
GCCAGATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATA
TATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAA
TAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCC
CACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCA
TTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGA
TGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTC
AATGGGAGTTTGTTTTG
由于CMV enhancer的下游引物和MLC-2V的上游引物是完全互补序列，因此，用CMV enhancer的上游引物和MLC-2V的下游引物，以PCR扩增连接法制备CMV enhancer-MLC-2V连接片段，并使其5′，3′端分别引入Mlu I和Nhe I识别序列。根据pSec-Tag2A多克隆位点上游CMV增强子和启动子两侧单一的Mlu I和Nhe I识别位点，以定向克隆法将CMV增强子和MLC-2V片段替换CMV增强子和启动子，构建成pSec-MLC-Tag2A。
DNA测序结果表明，MLC-2V已整合到重组质粒pSec-MLC-Tag2A中。
技术路线如下：
技术路线如图4。
实施例2 pSec-MLC-Tag2B质粒的构建。
将实施例1 pSec-Tag2A质粒改为pSec-Tag2B质粒，其余同实施例1。
实施例3 pSec-MLC-Tag2C质粒的构建。
将实施例1 pSec-mlc-Tag2A质粒改为pSec-Tag2C质粒，其余同实施例1。
实施例4 质粒扩增、提取与纯化
以原生生物大肠杆菌为宿主细胞，用常规分子生物学方法在大肠杆菌中扩增、提取和纯化实施例1、2、3中的质粒，具体操作见文献《分子克隆实验指南》([美]J.萨姆布鲁克，E.F.弗里奇，T.曼尼阿蒂斯，第二版)。
实施例5
以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因，用脂质体法将同量的pSec-Tag2A-GFP和pSec-MLC-Tag2A-GFP转染培养的Hela(人子宫癌细胞株)、Ea.hy926(人胚脐静脉内皮细胞)、IMA(人肠系膜下动脉中层平滑肌细胞株)和Hep2(人肝癌细胞株)，转染后24hr，观察各组细胞中的GFP表达情况。结果发现：pSec-Tag2A-GFP在以上细胞中都可表达，而pSec-MLC-Tag2A-GFP均不表达。
用脂质体法将同量的pSec-Tag2A-GFP和pSec-MLC-Tag2A-GFP转染分离培养的乳鼠心肌细胞，转染后24 hr，观察各组细胞中的GFP表达情况。结果发现：pSec-Tag2A-GFP和pSec-MLC-Tag2A-GFP有表达。
实验表明，本发明的pSec-MLC-Tag2(A，B，C)质粒只能特异地在心肌细胞中表达。
实施例6 整体动物实验
以促血管生成的VEGF基因为目的基因，用脂质体法将同量的pSec-Tag2A-VEGF和pSec-MLC-Tag2A-VEGF注射新西兰兔心脏壁，1周后，取注射区心肌标本做组织切片观察。结果发现，注射pSec-MLC-Tag2A-VEGF的心肌组织中新生血管数量明显多于注射pSec-Tag2A-VEGF组(观察计数)。
实验表明，本发明的pSec-MLC-Tag2(A，B，C)质粒只能特异地在心肌组织中表达。
实施例5的细胞学实验结果与实验例6的整体动物实验结果一致。本发明的上述实施例是用来说明本发明的可实施的效果，而绝非对本发明的任何限制。
<110>广东省人民医院
<120>分泌表达型心肌基因治疗质粒载体
<160>5
<210>1
<211>5230
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<221>misc-feature
<400>
GACGGATCGG GAGATCTCCC GATCCCCTAT GGTCGACTCT CAGTACAATC TGCTCTGATG 60
CCGCATAGTT AAGCCAGTAT CTGCTCCCTG CTTGTGTGTT GGAGGTCGCT GAGTAGTGCG 120
CGAGCAAAAT TTAAGCTACA ACAAGGCAAG GCTTGACCGA CAATTGCATG AAGAATCTGC 180
TTAGGGTTAG GCGTTTTGCG CTGCTTCGCG ATGTACGGGC CAGATATACG CGTTGACATT 240
GATTATTGAC TAGTTATTAA TAGTAATCAA TTACGGGGTC ATTAGTTCAT AGCCCATATA 300
TGGAGTTCCG CGTTACATAA CTTACGGTAA ATGGCCCGCC TGGCTGACCG CCCAACGACC 360
CCCGCCCATT GACGTCAATA ATGACGTATG TTCCCATAGT AACGCCAATA GGGACTTTCC 420
ATTGACGTCA ATGGGTGGAC TATTTACGGT AAACTGCCCA CTTGGCAGTA CATCAAGTGT 480
ATCATATGCC AAGTACGCCC CCTATTGACG TCAATGACGG TAAATGGCCC GCCTGGCATT 540
ATGCCCAGTA CATGACCTTA TGGGACTTTC CTACTTGGCA GTACATCTAC GTATTAGTCA 600
TCGCTATTAC CATGGTGATG CGGTTTTGGC AGTACATCAA TGGGCGTGGA TAGCGGTTTG 660
ACTCACGGGG ATTTCCAAGT CTCCACCCCA TTGACGTCAA TGGGAGTTTG TTTTGGACCC 720
AGAGCACAGA GCATCGTTCC CAGGCCAGGC CCCAGCCACT GTCTCTTTAA CCTTGAAGGC 780
ATTTTTGGGT CTCACGTGTC CACCCAGGCG GGTGTCGGAC TTTGAACGGC TCTTACTTCA 840
GAAGAACGGC ATGGGGTGGG GGGGCTTAGG TGGCCTCTGC CTCACCTACA ACTGCCAAAA 900
GCGGTCATGG GGTTATTTTT AACCCCAGGG AAGAGGTATT TATTGTTCCA CAGCAGGGGC 960
CGGCCGCTAG CCACCATGGA GACAGACACA CTCCTGCTAT GGGTACTGCT GCTCTGGGTT 1020
CCAGGTTCCA CTGGTGACGC GGCCCAGCCG GCCAGGCGCG CCGTACGAAG CTTGGTACCG 1080
AGCTCGGATC CACTCCAGTG TGGTGGAATT CTGCAGATAT CCAGCACAGT GGCGGCCGCT 1140
CGAGGAGGGC CCGAACAAAA ACTCATCTCA GAAGAGGATC TGAATAGCGC CGTCGACCAT 1200
CATCATCATC ATCATTGAGT TTAAACCCGC TGATCAGCCT CGACTGTGCC TTCTAGTTGC 1260
CAGCCATCTG TTGTTTGCCC CTCCCCCGTG CCTTCCTTGA CCCTGGAAGG TGCCACTCCC 1320
ACTGTCCTTT CCTAATAAAA TGAGGAAATT GCATCGCATT GTCTGAGTAG GTGTCATTCT 1380
ATTCTGGGGG GTGGGGTGGG GCAGGACAGC AAGGGGGAGG ATTGGGAAGA CAATAGCAGG 1440
CATGCTGGGG ATGCGGTGGG CTCTATGGCT TCTGAGGCGG AAAGAACCAG CTGGGGCTCT 1500
AGGGGGTATC CCCACGCGCC CTGTAGCGGC GCATTAAGCG CGGCGGGTGT GGTGGTTACG 1560
CGCAGCGTGA CCGCTACACT TGCCAGCGCC CTAGCGCCCG CTCCTTTCGC TTTCTTCCCT 1620
TCCTTTCTCG CCACGTTCGC CGGCTTTCCC CGTCAAGCTC TAAATCGGGG CATCCCTTTA 1680
GGGTTCCGAT TTAGTGCTTT ACGGCACCTC GACCCCAAAA AACTTGATTA GGGTGATGGT 1740
TCACGTAGTG GGCCATCGCC CTGATAGACG GTTTTTCGCC CTTTGACGTT GGAGTCCACG 1800
TTCTTTAATA GTGGACTCTT GTTCCAAACT GGAACAACAC TCAACCCTAT CTCGGTCTAT 1860
TCTTTTGATT TATAAGGGAT TTTGGGGATT TCGGCCTATT GGTTAAAAAA TGAGCTGATT 1920
TAACAAAAAT TTAACGCGAA TTAATTCTGT GGAATGTGTG TCAGTTAGGG TGTGGAAAGT 1980
CCCCAGGCTC CCCAGCAGGC AGAAGTATGC AAAGCATGCA TCTCAATTAG TCAGCAACCA 2040
GGTGTGGAAA GTCCCCAGGC TCCCCAGCAG GCAGAAGTAT GCAAAGCATG CATCTCAATT 2100
AGTCAGCAAC CATAGTCCCG CCCCTAACTC CGCCCATCCC GCCCCTAACT CCGCCCAGTT 2160
CCGCCCATTC TCCGCCCCAT GGCTGACTAA TTTTTTTTAT TTATGCAGAG GCCGAGGCCG 2220
CCTCTGCCTC TGAGCTATTC CAGAAGTAGT GAGGAGGCTT TTTTGGAGGC CTAGGCTTTT 2280
GCAAAAAGCT CCCGGGAGCT TGTATATCCA TTTTCGGATC TGATCAGCAC GTGTTGACAA 2340
TTAATCATCG GCATAGTATA TCGGCATAGT ATAATACGAC AAGGTGAGGA ACTAAACCAT 2400
GGCCAAGTTG ACCAGTGCCG TTCCGGTGCT CACCGCGCGC GACGTCGCCG GAGCGGTCGA 2460
GTTCTGGACC GACCGGCTCG GGTTCTCCCG GGACTTCGTG GAGGACGACT TCGCCGGTGT 2520
GGTCCGGGAC GACGTGACCC TGTTCATCAG CGCGGTCCAG GACCAGGTGG TGCCGGACAA 2580
CACCCTGGCC TGGGTGTGGG TGCGCGGCCT GGACGAGCTG TACGCCGAGT GGTCGGAGGT 2640
CGTGTCCACG AACTTCCGGG ACGCCTCCGG GCCGGCCATG ACCGAGATCG GCGAGCAGCC 2700
GTGGGGGCGG GAGTTCGCCC TGCGCGACCC GGCCGGCAAC TGCGTGCACT TCGTGGCCGA 2760
GGAGCAGGAC TGACACGTGC TACGAGATTT CGATTCCACC GCCGCCTTCT ATGAAAGGTT 2820
GGGCTTCGGA ATCGTTTTCC GGGACGCCGG CTGGATGATC CTCCAGCGCG GGGATCTCAT 2880
GCTGGAGTTC TTCGCCCACC CCAACTTGTT TATTGCAGCT TATAATGGTT ACAAATAAAG 2940
CAATAGCATC ACAAATTTCA CAAATAAAGC ATTTTTTTCA CTGCATTCTA GTTGTGGTTT 3000
GTCCAAACTC ATCAATGTAT CTTATCATGT CTGTATACCG TCGACCTCTA GCTAGAGCTT 3060
GGCGTAATCA TGGTCATAGC TGTTTCCTGT GTGAAATTGT TATCCGCTCA CAATTCCACA 3120
CAACATACGA GCCGGAAGCA TAAAGTGTAA AGCCTGGGGT GCCTAATGAG TGAGCTAACT 3180
CACATTAATT GCGTTGCGCT CACTGCCCGC TTTCCAGTCG GGAAACCTGT CGTGCCAGCT 3240
GCATTAATGA ATCGGCCAAC GCGCGGGGAG AGGCGGTTTG CGTATTGGGC GCTCTTCCGC 3300
TTCCTCGCTC ACTGACTCGC TGCGCTCGGT CGTTCGGCTG CGGCGAGCGG TATCAGCTCA 3360
CTCAAAGGCG GTAATACGGT TATCCACAGA ATCAGGGGAT AACGCAGGAA AGAACATGTG 3420
AGCAAAAGGC CAGCAAAAGG CCAGGAACCG TAAAAAGGCC GCGTTGCTGG CGTTTTTCCA 3480
TAGGCTCCGC CCCCCTGACG AGCATCACAA AAATCGACGC TCAAGTCAGA GGTGGCGAAA 3540
CCCGACAGGA CTATAAAGAT ACCAGGCGTT TCCCCCTGGA AGCTCCCTCG TGCGCTCTCC 3600
TGTTCCGACC CTGCCGCTTA CCGGATACCT GTCCGCCTTT CTCCCTTCGG GAAGCGTGGC 3660
GCTTTCTCAA TGCTCACGCT GTAGGTATCT CAGTTCCCTG TAGGTCGTTC GCTCCAAGCT 3720
GGGCTGTGTG CACGAACCCC CCGTTCAGCC CGACCCCTGC CCCTTATCCG CTAACTATCG 3780
TCTTGAGTCC AACCCGGTAA GACACGACTT ATCGCCACTG GCAGCACCCA CTGGTAACAG 3840
GATTAGCAGA GCGAGGTATG TAGGCGGTGC TACAGAGTTC TTGAAGTGGT CGCCTAACTA 3900
CGGCTACACT AGAAGGACAG TATTTGGTAT CTGCGCTCTG CTGAAGCCAG TTACCTTCGG 3960
AAAAAGAGTT GGTAGCTCTT GATCCGGCAA ACAAACCACC GCTGGTAGCG GTGGTTTTTT 4020
TGTTTGCAAG CAGCAGATTA CGCGCAGAAA AAAAGGATCT CAAGAAGATC CTTTGATCTT 4080
TTCTACGGGG TCTGACGCTC AGTGGAACGA AAACTCACGT TAAGGGATTT TGGTCATGAG 4140
ATTATCAAAA AGGATCTTCA CCTAGATCCT TTTAAATTAA AAATGAAGTT TTAAATCAAT 4200
CTAAAGTATA TATGAGTAAA CTTGGTCTGA CAGTTACCAA TGCTTAATCA GTGAGGCACC 4260
TATCTCAGCG ATCTGTCTAT TTCGTTCATC CATAGTTGCC TGACTCCCCG TCGTGTAGAT 4320
AACTACGATA CGGGAGGGCT TACCATCTGG CCCCAGTGCT GCAATGATAC CGCGAGACCC 4380
ACGCTCACCG GCTCCAGATT TATCAGCAAT AAACCAGCCA GCCGGAAGGG CCGAGCGCAG 4440
AAGTGGTCCT GCAACTTTAT CCGCCTCCAT CCAGTCTATT AATTGTTGCC GGGAAGCTAG 4500
AGTAAGTAGT TCGCCAGTTA ATAGTTTGCG CAACGTTGTT GCCATTGCTA CAGGCATCGT 4560
GGTGTCACGC TCGTCGTTTG GTATGGCTTC ATTCAGCTCC GGTTCCCAAC GATCAAGGCG 4620
AGTTACATGA TCCCCCATGT TGTGCAAAAA AGCGGTTAGC TCCTTCGGTC CTCCGATCGT 4680
TGTCAGAAGT AAGTTGGCCG CAGTGTTATC ACTCATGGTT ATGGCAGCAC TGCATAATTC 4740
TCTTACTGTC ATGCCATCCG TAAGATGCTT TTCTGTGACT GGTGAGTACT CAACCAAGTC 4800
ATTCTGAGAA TAGTGTATGC GGCGACCGAG TTGCTCTTGC CCGGCGTCAA TACGGGATAA 4860
TACCGCGCCA CATAGCAGAA CTTTAAAAGT GCTCATCATT GGAAAACGTT CTTCGGGGCG 4920
AAAACTCTCA AGGATCTTAC CGCTGTTGAG ATCCAGTTCG ATGTAACCCA CTCGTGCACC 4980
CAACTGATCT TCAGCATCTT TTACTTTCAC CAGCGTTTCT GGGTGAGCAA AAACAGGAAG 5040
GCAAAATGCC GCAAAAAAGG GAATAAGGGC GACACGGAAA TGTTGAATAC TCATACTCTT 5100
CCTTTTTCAA TATTATTGAA GCATTTATCA GGGTTATTGT CTCATGAGCG GATACATATT 5160
TGAATGTATT TAGAAAAATA AACAAATAGG GGTTCCGCGC ACATTTCCCC GAAAAGTGCC 5220
ACCTGACGTC 5230
<210>2
<211>5234
<212>DNA
<213>人工合成
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<221>misc-feature
<400>
GACGGATCGG GAGATCTCCC GATCCCCTAT GGTCGACTCT CAGTACAATC TGCTCTGATG 60
CCGCATAGTT AAGCCAGTAT CTGCTCCCTG CTTGTGTGTT GGAGGTCGCT GAGTAGTGCG 120
CGAGCAAAAT TTAAGCTACA ACAAGGCAAG GCTTGACCGA CAATTGCATG AAGAATCTGC 180
TTAGGGTTAG GCGTTTTGCG CTGCTTCGCG ATGTACGGGC CAGATATACG CGTTGACATT 240
GATTATTGAC TAGTTATTAA TAGTAATCAA TTACGGGGTC ATTAGTTCAT AGCCCATATA 300
TGGAGTTCCG CGTTACATAA CTTACGGTAA ATGGCCCGCC TGGCTGACCG CCCAACGACC 360
CCCGCCCATT GACGTCAATA ATGACGTATG TTCCCATAGT AACGCCAATA GGGACTTTCC 420
ATTGACGTCA ATGGGTGGAC TATTTACGGT AAACTGCCCA CTTGGCAGTA CATCAAGTGT 480
ATCATATGCC AAGTACGCCC CCTATTGACG TCAATGACGG TAAATGGCCC GCCTGGCATT 540
ATGCCCAGTA CATGACCTTA TGGGACTTTC CTACTTGGCA GTACATCTAC GTATTAGTCA 600
TCGCTATTAC CATGGTGATG CGGTTTTGGC AGTACATCAA TGGGCGTGGA TAGCGGTTTG 660
ACTCACGGGG ATTTCCAAGT CTCCACCCCA TTGACGTCAA TGGGAGTTTG TTTTGGACCC 720
AGAGCACAGA GCATCGTTCC CAGGCCAGGC CCCAGCCACT GTCTCTTTAA CCTTGAAGGC 780
ATTTTTGGGT CTCACGTGTC CACCCAGGCG GGTGTCGGAC TTTGAACGGC TCTTACTTCA 840
GAAGAACGGC ATGGGGTGGG GGGGCTTAGG TGGCCTCTGC CTCACCTACA ACTGCCAAAA 900
GCGGTCATGG GGTTATTTTT AACCCCAGGG AAGAGGTATT TATTGTTCCA CAGCAGGGGC 960
CGGCCGCTAG CCACCATGGA GACAGACACA CTCCTGCTAT GGGTACTGCT GCTCTGGGTT 1020
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ACCGAGCTCG GATCCACTCC AGTGTGGTGG AATTCTGCAG ATATCCAGCA CAGTGGCGGC 1140
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TACGCGCAGC GTGACCGCTA CACTTGCCAG CGCCCTAGCG CCCGCTCCTT TCGCTTTCTT 1620
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分泌.txt
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GTTTGTCCAA ACTCATCAAT GTATCTTATC ATGTCTGTAT ACCGTCGACC TCTAGCTAGA 3060
GCTTGGCGTA ATCATGGTCA TAGCTGTTTC CTGTGTGAAA TTGTTATCCG CTCACAATTC 3120
CACACAACAT ACGAGCCGGA AGCATAAAGT GTAAAGCCTG GGGTGCCTAA TGAGTGAGCT 3180
AACTCACATT AATTGCGTTG CGCTCACTGC CCGCTTTCCA GTCGGGAAAC CTGTCGTGCC 3240
AGCTGCATTA ATGAATCGGC CAACGCGCGG GGAGAGGCGG TTTGCGTATT GGGCGCTCTT 3300
CCGCTTCCTC GCTCACTGAC TCGCTGCGCT CGGTCGTTCG GCTGCGGCGA GCGGTATCAG 3360
CTCACTCAAA GGCGGTAATA CGGTTATCCA CAGAATCAGG GGATAACGCA GGAAAGAACA 3420
TGTGAGCAAA AGGCCAGCAA AAGGCCAGGA ACCGTAAAAA GGCCGCGTTG CTGGCGTTTT 3480
TCCATAGGCT CCGCCCCCCT GACGAGCATC ACAAAAATCG ACGCTCAAGT CAGAGGTGGC 3540
GAAACCCGAC AGGACTATAA AGATACCAGG CGTTTCCCCC TGGAAGCTCC CTCGTGCGCT 3600
CTCCTGTTCC GACCCTGCCG CTTACCGGAT ACCTGTCCGC CTTTCTCCCT TCGGGAAGCG 3660
TGGCGCTTTC TCAATGCTCA CGCTGTAGGT ATCTCAGTTC GGTGTAGGTC GTTCGCTCCA 3720
AGCTGGGCTG TGTGCACGAA CCCCCCGTTC AGCCCGACCG CTGCGCCTTA TCCGGTAACT 3780
ATCGTCTTGA GTCCAACCCG GTAAGACACG ACTTATCGCC ACTGGCAGCA GCCACTGGTA 3840
ACAGGATTAG CAGAGCGAGG TATGTAGGCG GTGCTACAGA GTTCTTGAAG TGGTGGCCTA 3900
ACTACGGCTA CACTAGAAGG ACAGTATTTG GTATCTGCGC TCTGCTGAAG CCAGTTACCT 3960
TCGGAAAAAG AGTTGGTAGC TCTTGATCCG GCAAACAAAC CACCGCTGGT AGCGGTGGTT 4020
TTTTTGTTTG CAAGCAGCAG ATTACGCGCA GAAAAAAAGG ATCTCAAGAA GATCCTTTGA 4080
TCTTTTCTAC GGGGTCTGAC GCTCAGTGGA ACGAAAACTC ACGTTAAGGG ATTTTGGTCA 4140
TGAGATTATC AAAAAGGATC TTCACCTAGA TCCTTTTAAA TTAAAAATGA AGTTTTAAAT 4200
CAATCTAAAG TATATATGAG TAAACTTGGT CTGACAGTTA CCAATGCTTA ATCAGTGAGG 4260
CACCTATCTC AGCGATCTGT CTATTTCGTT CATCCATAGT TGCCTGACTC CCCGTCGTGT 4320
AGATAACTAC GATACGGGAG GGCTTACCAT CTGGCCCCAG TGCTGCAATG ATACCGCGAG 4380
ACCCACGCTC ACCGGCTCCA GATTTATCAG CAATAAACCA GCCAGCCGGA AGGGCCGAGC 4440
GCAGAAGTGG TCCTGCAACT TTATCCGCCT CCATCCAGTC TATTAATTGT TGCCGGGAAG 4500
CTAGAGTAAG TAGTTCGCCA GTTAATAGTT TGCGCAACGT TGTTGCCATT GCTACAGGCA 4560
TCGTGGTGTC ACGCTCGTCG TTTGGTATGG CTTCATTCAG CTCCGGTTCC CAACGATCAA 4620
GGCGAGTTAC ATGATCCCCC ATGTTGTGCA AAAAAGCGGT TAGCTCCTTC GGTCCTCCGA 4680
TCGTTGTCAG AAGTAAGTTG GCCGCAGTGT TATCACTCAT GGTTATGGCA GCACTGCATA 4740
ATTCTCTTAC TGTCATGCCA TCCGTAAGAT GCTTTTCTGT GACTGGTGAG TACTCAACCA 4800
AGTCATTCTG AGAATAGTGT ATGCGGCGAC CGAGTTGCTC TTGCCCGGCG TCAATACGGG 4860
ATAATACCGC GCCACATAGC AGAACTTTAA AAGTGCTCAT CATTGGAAAA CGTTCTTCGG 4920
GGCGAAAACT CTCAAGGATC TTACCGCTGT TGAGATCCAG TTCGATGTAA CCCACTCGTG 4980
CACCCAACTG ATCTTCAGCA TCTTTTACTT TCACCAGCGT TTCTGGGTGA GCAAAAACAG 5040
GAAGGCAAAA TGCCGCAAAA AAGGGAATAA GGGCGACACG GAAATGTTGA ATACTCATAC 5100
TCTTCCTTTT TCAATATTAT TGAAGCATTT ATCAGGGTTA TTGTCTCATG AGCGGATACA 5160
TATTTGAATG TATTTAGAAA AATAAACAAA TAGGGGTTCC GCGCACATTT CCCCGAAAAG 5220
TGCCACCTGA CGTC 5234
<210>3
<211>5238
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<221>misc-feature
<400>
GACGGATCGG GAGATCTCCC GATCCCCTAT GGTCGACTCT CAGTACAATC TGCTCTGATG 60
CCGCATAGTT AAGCCAGTAT CTGCTCCCTG CTTGTGTGTT GGAGGTCGCT GAGTAGTGCG 120
CGAGCAAAAT TTAAGCTACA ACAAGGCAAG GCTTGACCGA CAATTGCATG AAGAATCTGC 180
TTAGGGTTAG GCGTTTTGCG CTGCTTCGCG ATGTACGGGC CAGATATACG CGTTGACATT 240
GATTATTGAC TAGTTATTAA TAGTAATCAA TTACGGGGTC ATTAGTTCAT AGCCCATATA 300
TGGAGTTCCG CGTTACATAA CTTACGGTAA ATGGCCCGCC TGGCTGACCG CCCAACGACC 360
CCCGCCCATT GACGTCAATA ATGACGTATG TTCCCATAGT AACGCCAATA GGGACTTTCC 420
ATTGACGTCA ATGGGTGGAC TATTTACGGT AAACTGCCCA CTTGGCAGTA CATCAAGTGT 480
ATCATATGCC AAGTACGCCC CCTATTGACG TCAATGACGG TAAATGGCCC GCCTGGCATT 540
ATGCCCAGTA CATGACCTTA TGGGACTTTC CTACTTGGCA GTACATCTAC GTATTAGTCA 600
TCGCTATTAC CATGGTGATG CGGTTTTGGC AGTACATCAA TGGGCGTGGA TAGCGGTTTG 660
ACTCACGGGG ATTTCCAAGT CTCCACCCCA TTGACGTCAA TGGGAGTTTG TTTTGGACCC 720
AGAGCACAGA GCATCGTTCC CAGGCCAGGC CCCAGCCACT GTCTCTTTAA CCTTGAAGGC 780
ATTTTTGGGT CTCACGTGTC CACCCAGGCG GGTGTCGGAC TTTGAACGGC TCTTACTTCA 840
GAAGAACGGC ATGGGGTGGG GGGGCTTAGG TGGCCTCTGC CTCACCTACA ACTGCCAAAA 900
GCGGTCATGG GGTTATTTTT AACCCCAGGG AAGAGGTATT TATTGTTCCA CAGCAGGGGC 960
CGGCCGCTAG CCACCATGGA GACAGACACA CTCCTGCTAT GGGTACTGCT GCTCTGGGTT 1020
CCAGGTTCCA CTGGTGACGC GGCCCAGCCG GCCAGGCGCG CGCGCCGTAC GTACGAAGCT 1080
TGGTACCGAG CTCGGATCCA CTCCAGTGTG GTGGAATTCT GCAGATATCC AGCACAGTGG 1140
CGGCCGCTCG AGGAGGGCCC GAACAAAAAC TCATCTCAGA AGAGGATCTG AATAGCGCCG 1200
TCGACCATCA TCATCATCAT CATTGAGTTT AAACCCGCTG ATCAGCCTCG ACTGTGCCTT 1260
CTAGTTGCCA GCCATCTGTT GTTTGCCCCT CCCCCGTGCC TTCCTTGACC CTGGAAGGTG 1320
CCACTCCCAC TGTCCTTTCC TAATAAAATG AGGAAATTGC ATCGCATTGT CTGAGTAGGT 1380
GTCATTCTAT TCTGGGGGGT GGGGTGGGGC AGGACAGCAA GGGGGAGGAT TGGGAAGACA 1440
ATAGCAGGCA TGCTGGGGAT GCGGTGGGCT CTATGGCTTC TGAGGCGGAA AGAACCAGCT 1500
GGGGCTCTAG GGGGTATCCC CACGCGCCCT GTAGCGGCGC ATTAAGCGCG GCGGGTGTGG 1560
TGGTTACGCG CAGCGTGACC GCTACACTTG CCAGCGCCCT AGCGCCCGCT CCTTTCGCTT 1620
TCTTCCCTTC CTTTCTCGCC ACGTTCGCCG GCTTTCCCCG TCAAGCTCTA AATCGGGGCA 1680
TCCCTTTAGG GTTCCGATTT AGTGCTTTAC GGCACCTCGA CCCCAAAAAA CTTGATTAGG 1740
GTGATGGTTC ACGTAGTGGG CCATCGCCCT GATAGACGGT TTTTCGCCCT TTGACGTTGG 1800
AGTCCACGTT CTTTAATAGT GGACTCTTGT TCCAAACTGG AACAACACTC AACCCTATCT 1860
CGGTCTATTC TTTTGATTTA TAAGGGATTT TGGGGATTTC GGCCTATTGG TTAAAAAATG 1920
AGCTGATTTA ACAAAAATTT AACGCGAATT AATTCTGTGG AATGTGTGTC AGTTAGGGTG 1980
TGGAAAGTCC CCAGGCTCCC CAGCAGGCAG AAGTATGCAA AGCATGCATC TCAATTAGTC 2040
AGCAACCAGG TGTGGAAAGT CCCCAGGCTC CCCAGCAGGC AGAAGTATGC AAAGCATGCA 2100
TCTCAATTAG TCAGCAACCA TAGTCCCGCC CCTAACTCCG CCCATCCCGC CCCTAACTCC 2160
GCCCAGTTCC GCCCATTCTC CGCCCCATGG CTGACTAATT TTTTTTATTT ATGCAGAGGC 2220
CGAGGCCGCC TCTGCCTCTG AGCTATTCCA GAAGTAGTGA GGAGGCTTTT TTGGAGGCCT 2280
AGGCTTTTGC AAAAAGCTCC CGGGAGCTTG TATATCCATT TTCGGATCTG ATCAGCACGT 2340
GTTGACAATT AATCATCGGC ATAGTATATC GGCATAGTAT AATACGACAA GGTGAGGAAC 2400
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GCGGTCGAGT TCTGGACCGA CCGGCTCGGG TTCTCCCGGG ACTTCGTGGA GGACGACTTC 2520
GCCGGTGTGG TCCGGGACGA CGTGACCCTG TTCATCAGCG CGGTCCAGGA CCAGGTGGTG 2580
CCGGACAACA CCCTGGCCTG GGTGTGGGTG CGCGGCCTGG ACGAGCTGTA CGCCGAGTGG 2640
TCGGAGGTCG TGTCCACGAA CTTCCGGGAC GCCTCCGGGC CGGCCATGAC CGAGATCGGC 2700
GAGCAGCCGT GGGGGCGGGA GTTCGCCCTG CGCGACCCGG CCGGCAACTG CGTGCACTTC 2760
GTGGCCGAGG AGCAGGACTG ACACGTGCTA CGAGATTTCG ATTCCACCGC CGCCTTCTAT 2820
GAAAGGTTGG GCTTCGGAAT CGTTTTCCGG GACGCCGGCT GGATGATCCT CCAGCGCGGG 2880
GATCTCATGC TGGAGTTCTT CGCCCACCCC AACTTGTTTA TTGCAGCTTA TAATGGTTAC 2940
AAATAAAGCA ATAGCATCAC AAATTTCACA AATAAAGCAT TTTTTTCACT GCATTCTAGT 3000
TGTGGTTTGT CCAAACTCAT CAATGTATCT TATCATGTCT GTATACCGTC GACCTCTAGC 3060
TAGAGCTTGG CGTAATCATG GTCATAGCTG TTTCCTGTGT GAAATTGTTA TCCGCTCACA 3120
ATTCCACACA ACATACGAGC CGGAAGCATA AAGTGTAAAG CCTGGGGTGC CTAATGAGTG 3180
AGCTAACTCA CATTAATTGC GTTGCGCTCA CTGCCCGCTT TCCAGTCGGG AAACCTGTCG 3240
TGCCAGCTGC ATTAATGAAT CGGCCAACGC GCGGGGAGAG GCGGTTTGCG TATTGGGCGC 3300
TCTTCCGCTT CCTCGCTCAC TGACTCGCTG CGCTCGGTCG TTCGGCTGCG GCGAGCGGTA 3360
TCAGCTCACT CAAAGGCGGT AATACGGTTA TCCACAGAAT CAGGGGATAA CGCAGGAAAG 3420
AACATGTGAG CAAAAGGCCA GCAAAAGGCC AGGAACCGTA AAAAGGCCGC GTTGCTGGCG 3480
TTTTTCCATA GGCTCCGCCC CCCTGACGAG CATCACAAAA ATCGACGCTC AAGTCAGAGG 3540
TGGCGAAACC CGACAGGACT ATAAAGATAC CAGGCGTTTC CCCCTGGAAG CTCCCTCGTG 3600
CGCTCTCCTG TTCCGACCCT GCCGCTTACC GGATACCTGT CCGCCTTTCT CCCTTCGGGA 3660
AGCGTGGCGC TTTCTCAATG CTCACGCTGT AGGTATCTCA GTTCGGTGTA GGTCGTTCGC 3720
TCCAAGCTGG GCTGTGTGCA CGAACCCCCC GTTCAGCCCG ACCGCTGCGC CTTATCCGGT 3780
AACTATCGTC TTGAGTCCAA CCCGGTAAGA CACGACTTAT CGCCACTGGC AGCAGCCACT 3840
GGTAACAGGA TTAGCAGAGC GAGGTATGTA GGCGGTGCTA CAGAGTTCTT GAAGTGGTGG 3900
CCTAACTACG GCTACACTAG AAGGACAGTA TTTGGTATCT GCGCTCTGCT GAAGCCAGTT 3960
ACCTTCGGAA AAAGAGTTGG TAGCTCTTGA TCCGGCAAAC AAACCACCGC TGGTAGCGGT 4020
GGTTTTTTTG TTTGCAAGCA GCAGATTACG CGCAGAAAAA AAGGATCTCA AGAAGATCCT 4080
TTGATCTTTT CTACGGGGTC TGACGCTCAG TGGAACGAAA ACTCACGTTA AGGGATTTTG 4140
GTCATGAGAT TATCAAAAAG GATCTTCACC TAGATCCTTT TAAATTAAAA ATGAAGTTTT 4200
AAATCAATCT AAAGTATATA TGAGTAAACT TGGTCTGACA GTTACCAATG CTTAATCAGT 4260
GAGGCACCTA TCTCAGCGAT CTGTCTATTT CGTTCATCCA TAGTTGCCTG ACTCCCCGTC 4320
GTGTAGATAA CTACGATACG GGAGGGCTTA CCATCTGGCC CCAGTGCTGC AATGATACCG 4380
CGAGACCCAC GCTCACCGGC TCCAGATTTA TCAGCAATAA ACCAGCCAGC CGGAAGGGCC 4440
GAGCGCAGAA GTGGTCCTGC AACTTTATCC GCCTCCATCC AGTCTATTAA TTGTTGCCGG 4500
GAAGCTAGAG TAAGTAGTTC GCCAGTTAAT AGTTTGCGCA ACGTTGTTGC CATTGCTACA 4560
GGCATCGTGG TGTCACGCTC GTCGTTTGGT ATGGCTTCAT TCAGCTCCGG TTCCCAACGA 4620
TCAAGGCGAG TTACATGATC CCCCATGTTG TGCAAAAAAG CGGTTAGCTC CTTCGGTCCT 4680
CCGATCGTTG TCAGAAGTAA GTTGGCCGCA GTGTTATCAC TCATGGTTAT GGCAGCACTG 4740
CATAATTCTC TTACTGTCAT GCCATCCGTA AGATGCTTTT CTGTGACTGG TGAGTACTCA 4800
ACCAAGTCAT TCTGAGAATA GTGTATGCGG CGACCGAGTT GCTCTTGCCC GGCGTCAATA 4860
CGGGATAATA CCGCGCCACA TAGCAGAACT TTAAAAGTGC TCATCATTGG AAAACGTTCT 4920
TCGGGGCGAA AACTCTCAAG GATCTTACCG CTGTTGAGAT CCAGTTCGAT GTAACCCACT 4980
CGTGCACCCA ACTGATCTTC AGCATCTTTT ACTTTCACCA GCGTTTCTGG GTGAGCAAAA 5040
ACAGGAAGGC AAAATGCCGC AAAAAAGGGA ATAAGGGCGA CACGGAAATG TTGAATACTC 5100
ATACTCTTCC TTTTTCAATA TTATTGAAGC ATTTATCAGG GTTATTGTCT CATGAGCGGA 5160
TACATATTTG AATGTATTTA GAAAAATAAA CAAATAGGGG TTCCGCGCAC ATTTCCCCGA 5220
AAAGTGCCAC CTGACGTC 5238
<210>4
<211>250
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>Promoter
<400>
GACCCAGAGC ACAGAGCATC GTTCCCAGGC CAGGCCCCAG CCACTGTCTC TTTAACCTTG 60
AAGGCATTTT TGGGTCTCAC GTGTCCACCC AGGCGGGTGT CGGACTTTGA ACGGCTCTTA 120
CTTCAGAAGA ACGGCATGGG GTGGGGGGGC TTAGGTGGCC TCTGCCTCAC CTACAACTGC 180
CAAAAGCGGT CATGGGGTTA TTTTTAACCC CAGGGAAGAG GTATTTATTG TTCCACAGCA 240
GGGGCCGGCC 250
<210>5
<211>497
<212>DNA
<213>巨细胞病毒(Human Cytomegalovirus)
<220>
<221>Enhancer
<400>
GCCAGATATA CGCGTTGACA TTGATTATTG ACTAGTTATT AATAGTAATC AATTACGGGG 60
TCATTAGTTC ATAGCCCATA TATGGAGTTC CGCGTTACAT AACTTACGGT AAATGGCCCG 120
CCTGGCTGAC CGCCCAACGA CCCCCGCCCA TTGACGTCAA TAATGACGTA TGTTCCCATA 180
GTAACGCCAA TAGGGACTTT CCATTGACGT CAATGGGTGG ACTATTTACG GTAAACTGCC 240
CACTTGGCAG TACATCAAGT GTATCATATG CCAAGTACGC CCCCTATTGA CGTCAATGAC 300
GGTAAATGGC CCGCCTGGCA TTATGCCCAG TACATGACCT TATGGGACTT TCCTACTTGG 360
CAGTACATCT ACGTATTAGT CATCGCTATT ACCATGGTGA TGCGGTTTTG GCAGTACATC 420
AATGGGCGTG GATAGCGGTT TGACTCACGG GGATTTCCAA GTCTCCACCC CATTGACGTC 480
AATGGGAGTT TGTTTTG 497