因此，本发明打算提供多价的疫苗制剂，所述制剂可以确保接种猪
能抵抗特别是涉及呼吸疾病和/或生殖疾病的多种致病因子。
本发明的另一目的是提供包含有不同效价并满足彼此相容性和效
价稳定性所需的所有标准的疫苗制剂。
本发明的另一目的是提供可以在相同载体中含有不同效价的疫苗
制剂。
本发明的另一目的是提供使用简单且便宜的疫苗制剂。
本发明的另一目的是提供这样一种疫苗制剂和接种猪的方法，所述
疫苗和接种可以得到高效、长期以及安全性良好又不留后患的保护作
用，包括多价保护作用。
因此，本发明的目的是特别地针对猪生殖和/或呼吸疾病的疫苗制
剂，所述制剂含有至少3种效价的多核苷酸疫苗，每种含有一个整合质
粒，其可在宿主细胞中体内表达一种猪病原体效价的基因，这些效价选
自Aujeszkey病病毒(PRV或假狂犬病病毒)，猪流感病毒(SIV)，猪神
秘病病毒(PRRS病毒)，细小病毒病病毒(PPV病毒)，典型猪瘟病毒
(HCV病毒)和引起放线杆菌病的细菌(大叶性肺炎放线杆菌)，对于每种
效价而言，质粒含有一种或多种基因，该基因对于Aujeszkey病病毒选
自gB和gD，对于猪流感病毒选自HA、NP和N，对于PRRS病毒
选自ORF5(E),ORF3,ORF6(M)，对于细小病毒病病毒选自VP2，
对于典型猪瘟病毒选自E1、E2，对于大叶性肺炎放线杆菌选自apxⅠ、
apxⅡ和apxⅢ。
本发明中的效价应理解成至少一种可提供抗所研究病原体病毒的
保护作用的抗原，效价可含有得自一株或多株所研究病原体的一个或多
个经修饰的天然基因作为亚效价。
病原性因子的基因应理解成不仅指完整的基因，也指不同的多种核
苷酸序列，包括保持了诱导保护性反应之能力的片段。基因的概念覆盖
了等价于实施例中详细描述的序列的核苷酸序列，也就是说，有所不同
但编码相同蛋白质的序列。此概念也覆盖了被研究的其它株病原体的核
苷酸序列，它可以提供交叉保护作用或特异于株或株群的保护作用。此
概念也覆盖了已被修饰以便于由宿主动物在体内表达，但编码相同蛋白
质的核苷酸序列。
优选本发明的疫苗制剂含有Aujeszkey和猪流感效价，在其中可加
入优选选自PRRS和大叶性肺炎放线杆菌(放线杆菌病)效价的其它效
价，任选在其中进入选自细小病毒病和典型猪瘟效价的其它效价。
当然，效价的所有联合都是可以的，然而，在本发明的范围内，
Auijeszkey和猪流感，接下来是PRRS和大叶性肺炎放线杆菌的效价被
认为是优选的。
从更特异地针对猪呼吸疾病的接种角度看，优选效价选自
Aujeszkey、猪流感、PRRS和放线杆菌病。
从特异地针对猪生殖疾病的接种角度看，优选效价选自PRRS、细
小病毒病、典型猪瘟和Aujeszkey病。
至于Aujeszkey效价，可使用gB或gD基因，优选使用这两种基
因，此时所述基因位于不同质粒或一个相同质粒上。
至于猪流感效价，优选使用HA和NP基因，可以使用这两个基因
中的一个，也可以同时使用这两个基因，此时所述基因位于不同质粒或
一个相同质粒上。优选在同一疫苗中联合得自一种以上流感病毒株，尤
其是得自在自然界发现的不同株的HA序列。另一方面，NP提供了交
叉保护作用，因此得自单个病毒株的序列能令人满意。
至于PRSS效价，优选使用E和ORF3或M基因，可以单独或联
合使用这些基因；联合使用时，基因可位于分离的质粒上，或位于联合
有2或3个这种基因的质粒中。得自至少两株，尤其是得自欧洲株和美
洲株的基因利于在同一疫苗中联合。
至于典型猪瘟效价，可使用E1和E2基因中的任一种或E1和E2
基因，后情形下它们可在两个不同质粒或任选在一个相同质粒中联合。
至于放线杆菌病效价，可使用上述3种基因中的一个或位于不同质
粒或混合质粒上的这些基因中2个或3个基因的联合以提供针对不同血
清型大叶性肺炎放线杆菌的保护作用。对于apxⅠ,Ⅱ和Ⅲ而言，可
以设想修饰编码序列以得到解毒的抗原，具体方法见实施例。
特别对于经肌内途径接种而言，本发明疫苗制剂一般以0.1-10ml，
特别是1-5ml的剂量体积形式提供。
剂量一般为每种质粒类型10ng-1mg，优选为100ng-50μg，优选
为1μg-250μg。
优选使用简单地置于接种载体，一般为生理盐水(0.9％NaCl)，超
纯水，TE缓冲液等中的裸质粒。当然也可以使用现有技术中已描述的
任何多核苷酸疫苗形式。
每个质粒都含有启动子，在其控制下可确保插入基因在宿主细胞中
的表达。所述启动子一般是强的真核生物启动子，尤其是来源于人或
鼠，或任选来源于其它动物如大鼠、猪和豚鼠的巨细胞病毒早期
CMV-IE启动子。
启动子更一般地讲是来源于病毒或细胞。至于病毒启动子，可提到
SV40病毒早期或晚期启动子或Rous肉瘤病毒LTR启动子。也可以是
基因来源病毒的启动子，例如基因自身的启动子。
至于细胞启动子，可提到细胞骨架基因的启动子，例如结蛋白启动
子(Bolmont等，亚显微镜细胞学和病理学(Journal ofSubmicroscopic
Cytology and Pathology),1990,22,117-122；和Zhenlin等，
基因(Gene),1989,78,243-254)或者肌动蛋白启动子。
当相同质粒中存在几个基因时，它们会存在于相同的转录单位或两
个不同的单位中。
优选通过混合表达各种效价之抗原的多核苷酸质粒来达到本发明
不同疫苗效价的联合，但也可以设想使几种效价的抗原由相同质粒表
达。
本发明的目的还在于单价疫苗制剂，所述制剂含有一个或多个编码
得自选自PRV,PRRS,PPV,HCV的病毒之一和大叶性肺炎放线
杆菌的一个或多个基因的质粒，所述基因为上述的那些。除了它们的单
价特征外，这些制剂可具有上述有关基因选择，基因联合，质粒组成，
剂量体积，剂量等方面的特征。
单价疫苗制剂也可用于(ⅰ)制备上述的多价疫苗制剂，(ⅱ)各对抗自
己的疾病，(ⅲ)与针对另一种疾病的另一类型(活的或灭活的完整的，重
组的，亚单位)的疫苗联合，或(ⅳ)按下述作为疫苗的加强剂。
实际上本发明另一个目的是使用一种或多种本发明的质粒以制备
用于接种猪的疫苗，该猪首先已用第一种已知类型的常规疫苗接种，所
述第一种疫苗特别选自活的完整疫苗，灭活的完整疫苗，亚单位疫苗和
重组疫苗，所述第一种疫苗(单价或多价)具有(也就是说含有或能表达)
由所述质粒编码的抗原或提供交叉保护作用的抗原。值得注意的是，该
多核苷酸疫苗具有强有力的加强效果，可导致免疫应答的增强并可获得
长期的免疫力。
一般讲，第一接种疫苗可选自可从不同的兽用疫苗生产商处购得的
疫苗。
本发明的另一目的是接种试剂盒，所述试剂盒将上述第一接种疫苗
和用于加强免疫的本发明的疫苗制剂组配在一起。本发明还涉及附带有
说明书的本发明疫苗制剂，所述说明书指明该制剂可作为上述第一次接
种的加强剂来使用。
本发明的另一目的是接种猪以抵抗猪生殖疾病和/或呼吸疾病的方
法，所述方法包括施用有效量的上述疫苗制剂。此接种方法包括施用一
剂或更多剂疫苗制剂，这些剂量可以在短时间内连续施用和/或以较长
的间隔期连续施用。
在这种接种方法中，通过现有技术中建议的用于多核苷酸接种的不
同施用途径并利用已知的施用技术施用本发明的疫苗制剂。特别可借助
于液体注射器经液体喷射优选多个液体喷射经由皮内途径进行接种，尤
其是使用具有几个孔或喷嘴，特别是具有5或6个孔或喷嘴的注射头的
注射器，如法国里昂Endoscoptic公司制造并销售的Pigjet装置。
对于这种装置而言，优选剂量体积降低为0.1-0.9ml，特别是0.2-
0.6ml，更优选为0.4-0.5ml，可以1次或几次，优选为2次施用该剂
量体积。
本发明的另一目的是一种接种方法，所述方法包括按上述进行第一
次接种，并用本发明的疫苗制剂加强接种。在本发明方法的优选实施方
案中，首先给动物施用有效剂量的常规疫苗，尤其是灭活的、活的、减
毒的或重组的、或亚单位的疫苗以提供第一次接种，一段时间后，优选
为2至6周后，施用本发明的多价或单价疫苗。
本发明也涉及一种制备疫苗制剂的方法，即制备不同效价及其混合
物的方法，如从此说明书中看到的方法。
下面参照附图，借助于本发明的实施方案更详细地描述本发明。
实施例
实施例1：病毒的培养
在适当的细胞系统中培养病毒直至得到细胞病变效应。本领域技术
人员熟知每种病毒所用的细胞系统。简单地说，用感染复数为1的被研
究的病毒株接种对所用病毒敏感的细胞，所述细胞在Eagle最低基本培
养基(MEM培养基)或另一种适当的培养基中培养。然后于37℃保温被
感染的细胞直至出现完全的细胞病变效应(平均为36小时)。
实施例2：细菌的培养和细菌DNA的提取
按A.Rycroft等人(普通微生物学杂志(J.Gen.Microbiol.),
1991,137,561-568)所述培养大叶性肺炎放线杆菌菌株。根据J.
Sambrook等人(分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉港实验室，冷泉
港，纽约，1989)所述的标准技术制备高分子量的DNA(染色体DNA)。
实施例3：提取病毒基因组DNA
培养后，收获上清液和被裂解的细胞，于4℃,1000g将全部的病
毒悬浮液离心10分钟以除去细胞碎片，然后通过于4℃,400,000g超
速离心1小时以收获病毒颗粒。将沉淀物溶解于最少量的缓冲液(10mM
Tris,1mM EDTA；pH8.0)中，于37℃，在十二烷基硫酸钠(SDS)
的存在下(终浓度为0.5％)，用蛋白酶K(终浓度为100μg/ml)将上述浓
缩的病毒悬浮液处理2小时。然后用苯酚/氯仿混合物提取病毒DNA，
再用2倍体积的无水乙醇沉淀之。于-20℃放置过夜后，于4℃,10,000g
将DNA离心15分钟，干燥DNA沉淀物，然后将它溶于最少量的无菌
超纯水中，接着可以用限制性酶消化所述DNA。
实施例4：分离病毒基因组RNA
根据本领域技术人员熟知的技术纯化RNA病毒，然后使用P-
Chromczynski和N.Sacchi所述的“硫氰酸胍/苯酚-氯仿”提取技术(分
析生物化学，1987,162,156-159)分离各个病毒的基因组病毒
RNA。
实施例5：分子生物学技术
使用J.Sambrook等人(分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉港
实验室，冷泉港，纽约，1989)所述的标准分子生物学技术进行所有的
质粒构建。使用“Geneclean”试剂盒(BIO 101 Inc.La Jolla,CA)
分离用于本发明的所有限制性片段。
实施例6:RT-PCR技术
合成多个特异性的寡核苷酸(在其5’末端含有限制性位点以便于克
隆经扩增的片段)以使其完全覆盖欲被扩增的基因的编码区(见具体的
实施例)。根据标准技术(J.Sambrook等人，分子克隆：实验室手册，
第2版，冷泉港实验室，冷泉港，纽约，1989)进行逆转录(RT)反应和
聚合酶链反应(PCR)。用一对特异性的扩增引物进行一种RT-PCR反
应，所述反应的模板是提取出的病毒基因组RNA。用苯酚/氯仿/异戊
醇(25∶24∶1)提取经扩增的互补DNA，然后用限制性酶消化。
实施例7：质粒pVR1012
质粒pVR1012(图1)得自Vical Inc.,San Diego,CA,USA。其构建
描述于J.Hartikka等人(人类基因疗法(Human Gene Therapy),
1996,7,1205-1217)。
实施例8：构建质粒pAB090(PRV gB基因)
用ApaⅠ和NaeⅠ消化质粒pPR2.15(M.Riviere等，病毒学杂志
(J.Virol),1992,66,3424-3434),以释放出含有编码Aujeszky
病病毒(NIA3株)gB糖蛋白之基因(图2和SEQ ID NO:1)的2665 bp的
ApaⅠ-NaeⅠ片段(片段A)。
通过下列2个寡核苷酸的杂交：
AB166(33聚体)(SEQ ID NO:2)
5’GATGCCCGCTGGTGGCGGTCTTTGGCGCGGGCC3’
AB167(33聚体)(SEQ ID NO:3)
5’ACGTCTACGGGCGACCACCGCCAGAAACCGCGC3’
重新构建含有gD基因序列，始于起始的ATG密码子直至ApaⅠ位点的
33bp的片段(片段B)，该片段在5’端产生了PstⅠ位点。
通过下列2个寡核苷酸的杂交：
AB168(45聚体)(SEQ ID NO:4)
5’
GGCACTACCAGCGCCTCGAGAGCGAGGACCCCGACGCCCTG
TAGG 3’
AB169(49聚体)(SEQ ID NO:5)
5’
GATCCCTACAGGGCGTCGGGGTCCTCGCTCTCGAGGCGCTG
GTAGTGCC 3’
重新构建含有gD基因序列，始于NaeⅠ位点直至TAG终止密码子的45
bp的片段(片段C)，该片段在3’端产生了BamHⅠ位点。
将片断A,B和C一起连接到预先经PstⅠ和BamHⅠ消化的载体
pVR1012(实施例7)中，得到质粒pAB090(7603 bp)(图3)。
实施例9：构建质粒pPB098(PRV gD基因)
用SalⅠ和BglⅡ消化质粒pPR29(M.Riviere等，病毒学杂志，
1992,66,3424-3434)，以释放出含有编码Aujeszky病病毒(NIA3
株)gD糖蛋白之基因的3’部分(图4和SEQ ID NO:6)的711bp的SalⅠ-
BglⅡ片段(片段A)。
用Eco47Ⅲ和SalⅠ消化质粒pPR29以释放出含有编码Aujeszky
病病毒(NIA3株)gD糖蛋白之基因的5’部分的498 bp的Eco47Ⅲ-SalⅠ
片段(片段B)。
通过下列2个寡核苷酸的杂交：
PB101(15聚体)(SEQ ID NO:7)
5’GATGCTGCTCGCAGC3’
PB102(19聚体)(SEQ ID NO:8)
5’GCTGCGAGCAGCATCTGCA 3’
重新构建含有gD基因5’序列，始于起始的ATG密码子直至Eco47Ⅲ
位点的15bp的片段(片段C)，该片段在5’端产生了PstⅠ位点。
纯化之后，将片段A,B和C一起连接到预先经PstⅠ和BgⅢ消
化的载体pVR1012(实施例7)中，得到质粒pPB098(6076bp)(图5)。
实施例10：构建质粒pPB143(猪流感HA基因，H1N1株)
用根据实施例4所述技术制备的猪流感病毒(SIV H1N1“SW”株)
基因组RNA，和下列寡核苷酸：
PB107(32聚体)(SEQ ID NO:9)
5’GTTCTGCAGCACCCGGGAGCAAAAGCAGGGGA 3’
PB108(33聚体)(SEQ ID NO:10)
5’ATTGCGGCCGCTAGTAGAAACAAGGGTGTTTTT3’
根据实施例6所述技术进行RT-PCR反应以从SIV H1N1中精确地分
离1803bp PCR片段形式的编码HA蛋白的基因(图6和SEQ ID
NO:11)。纯化之后，将此片段与载体PCRⅡ-direct(Invitrogen Reference
K2000-01)连接，得到载体pPB137(5755bp)。用EcoRⅤ和NotⅠ消化
载体pPB137以释放1820bp的含有HA基因的EcoRⅤ-NotⅠ片段。将
此片段与预先经EcoRⅤ和NotⅠ消化的载体pVR1012(实施例7)连接，
得到质粒pPB143(6726bp)(图7)。
实施例11：构建质粒pPB142(猪流感NP基因，H1N1株)
用根据实施例4所述技术制备的猪流感病毒(SIV H1N1“SW”株)
基因组RNA，和下列寡核苷酸：
PB097(36聚体)(SEQ ID NO:12)
5’CCGGTCGACCGGGATAATCACTCACTGAGTGACATC3’
PB098(33聚体)(SEQ ID NO:13)
5’TTGCGGCCGCTGTAGAAACAAGGGTATTTTTCT3’
根据实施例6所述技术进行RT-PCR反应以从SIV H1N1中精确地分
离SalⅠ-NotⅠ片段形式的编码NP蛋白的基因(图8和SEQ ID NO:14)。
纯化之后，将1566 bp的RT-PCR产物与载体PCRⅡ-direct(Invitrogen
Reference K2000-01)连接，得到载体pPB127(5519bp)。
用SalⅠ和NotⅠ消化载体pPB127以释放1560 bp的含有NP基因
的SalⅠ-NotⅠ片段。将此片段与预先经SalⅠ和NotⅠ消化的载体pVR1012
(实施例7)连接，得到质粒pPB142(6451 bp)(图9)。
实施例12：构建质粒pPB144(猪流感HA基因，H3N2株)
用根据实施例4所述技术制备的猪流感病毒(SIV H3N2株，Cotes
du Nord 1987)基因组RNA，和下列寡核苷酸：
PB095(31聚体)(SEQ ID NO:15)
5’GTTCTGCAGGCAGGGGATAATTCTATCAACC3’
PB096(36聚体)(SEQ ID NO:16)
5’TTGCGGCCGCAAGGGTGTTTTTAATTACTAATATAC 3’
根据实施例6所述技术进行RT-PCR反应以从SIV H3N2中精确地分
离PstⅠ-NotⅠ片断形式的编码HA蛋白的基因(图10和SEQ ID
NO:17)。纯化之后，将1765 bp的RT-PCR产物与载体PCRⅡ-
direct(Invitrogen Reference K2000-01)连接，得到载体pPB120(5716
bp)。
用NotⅠ消化载体pPB120以释放1797 bp的含有HA基因的NotⅠ
-NotⅠ片段。将此片段与预先经NotⅠ消化的载体pVR1012(实施例7)连
接，得到质粒pPB144(6712bp)，该质粒在相对于启动子正确的方向上
含有H3N2 HA基因(图11)。
实施例13：构建质粒pPB132(猪流感NP基因，H3N2株)
用根据实施例4所述技术制备的猪流感病毒(SIV H3N2株，Cotes
du Nord 1987)基因组RNA，和下列寡核苷酸：
PB097(36聚体)(SEQ ID NO:12)
5’CCGGTCGACCGGGATAATCACTCACTGAGTGACATC3’
PB098(33聚体)(SEQ ID NO:13)
5’TTGCGGCCGCTGTAGAAACAAGGGTATTTTTCT3’
根据实施例6所述技术进行RT-PCR反应以从SIV H3N2中精确地分
离SalⅠ-NotⅠ片段形式的编码NP蛋白的基因(图12和SEQ ID NO:18)。
纯化之后，将1564bp的RT-PCR产物与载体PCRⅡ-direct(Invitrogen
Reference K2000-01)连接，得到载体pPB123(5485bp)。
用SalⅠ和NotⅠ消化载体pPB123以释放1558 bp的含有NP基因
的SalⅠ-NotⅠ片段。将此片段与预先经SalⅠ和NotⅠ消化的载体
pVR1012(实施例7)连接，得到质粒pPB132(6449bp)(图13)。
实施例14：构建质粒pAB025(PRRSV ORF5基因，Lelystad株)
用根据实施例4所述技术制备的PRRSV病毒(Lelystad株)基因组
RNA(J.Meulenberg等，病毒学(Virology),1993,19,62-72)，
和下列寡核苷酸：
AB055(34聚体)(SEQ ID NO:19)
5’ACGCGTCGACAATATGAGATGTTCTCACAAATTG3’
AB056(33聚体)(SEQ ID NO:20)
5’CGCGGATCCCGTCTAGGCCTCCCATTGCTCAGC3’
根据实施例6所述技术进行RT-PCR反应以从PRRS病毒Lelystad株
中精确地分离编码包膜糖蛋白E(gp25)的“ORF5”基因。纯化之后，
用SalⅠ和BamHⅠ消化630bp的RT-PCR产物以分离617 bp的SalⅠ-
BamHⅠ片段。将此片段与预先经SalⅠ和BamHⅠ消化的载体pVR1012
(实施例7)连接，得到质粒pAB025(5486bp)(图14)。
实施例15：构建质粒pAB001(PRRSV ORF5基因，USA株)
用根据实施例4所述技术制备的PRRSV病毒(ATCC VR2332株)
基因组RNA(M.Murtaugh等，Arch Virol,1995,140,1451-
1460)，和下列寡核苷酸：
AB001(30聚体)(SEQ ID NO:21)
5’AACTGCAGATGTTGGAGAAATGCTTGACCG3’
AB002(30聚体)(SEQ ID NO:22)
5’CGGGATCCCTAAGGACGACCCCATTGTTCC3’
根据实施例6所述技术进行RT-PCR反应以从PRRS病毒ATCC-
VR2332株中精确地分离编码包膜糖蛋白E(gp25)的基因。纯化之后，
用PstⅠ和BamHⅠ消化620bp的RT-PCR产物以分离606bp的PstⅠ-
BamHⅠ片断。将此片段与预先经PstⅠ和BamHⅠ消化的载体pVR1012
(实施例7)连接，得到质粒pAB001(5463bp)(图15)。
实施例16：构建质粒pAB091(PRRSV ORF3基因，Lelystad株)
用根据实施例4所述技术制备的PRRSV病毒(Lelystad株)基因组
RNA(J.Meulenberg等，病毒学，1993,19,62-72)，和下列寡核苷
酸：
AB170(32聚体)(SEQ ID NO:23)
5’AAACTGCAGCAATGGCTCATCAGTGTGCACGC3’
AB171(30聚体)(SEQ ID NO:24)
5’CGCGGATCCTTATCGTGATGTACTGGGGAG3’
根据实施例6所述技术进行RT-PCR反应以从PRRS病毒Lelystad株
中精确地分离编码包膜糖蛋白“gp45”的“ORF3”基因。纯化之后，
用PstⅠ和BamHⅠ消化818bp的RT-PCR产物以分离802bp的PstⅠ-
BamHⅠ片断。将此片段与预先经PstⅠ和BamHⅠ消化的载体pVR1012
(实施例7)连接，得到质粒pAB091(5660bp)(图16)。
实施例17：构建质粒pAB092(PRRSV ORF3基因，USA株)
用根据实施例4所述技术制备的PRRSV病毒(ATCC VR2332株)
基因组RNA(M.Murtaugh等，Arch Virol,1995,140,1451-
1460)，和下列寡核苷酸：
AN172(32聚体)(SEQ ID NO:25)
5’AAACTGCAGCAATGGTTAATAGCTGTACATTC3’
AB173(32聚体)(SEQ ID NO:26)
5’CGCGGATCCCTATCGCCGTACGGCACTGAGGG3’
根据实施例6所述技术进行RT-PCR反应以从PRRS病毒ATCC-
VR2332株中精确地分离编码包膜糖蛋白“gp45”的“ORF3”基因。
纯化之后，用PstⅠ和BamHⅠ消化785 bp的RT-PCR产物以分离769bp
的PstⅠ-BamHⅠ片段。将此片段与预先经PstⅠ和BamHⅠ消化的载体
pVR1012(实施例7)连接，得到质粒pAB092(5627bp)(图17)。
实施例18：构建质粒pAB004(猪细小病毒VP2基因)
用根据实施例4所述技术制备的猪细小病毒(NADL2株)基因组
RNA(J.Vasudevacharya等，病毒学，1990,178,611-616)，和下
列寡核苷酸：
AB007(33聚体)(SEQ ID NO:27)
5’AAAACTGCAGAATGAGTGAAAATGTGGAACAAC3’
AB010(33聚体)(SEQ ID NO:28)
5’CGCGGATCCCTAGTATAATTTTCTTGGTATAAG3’
根据实施例6所述技术进行RT-PCR反应以扩增含有编码猪细小病毒
VP2蛋白之基因的1757bp的片段。纯化之后，用PstⅠ和BamHⅠ消化
RT-PCR产物，得到1740bp的PstⅠ-BamHⅠ片段。将此片段与预先经
PstⅠ和BamHⅠ消化的载体pVR1012(实施例7)连接，得到质粒pAB004
(6601bp)(图18)。
实施例19：构建质粒pAB069(猪瘟HCV E1基因)
用根据实施例4所述技术制备的猪瘟病毒(HCV)(Alfort株)基因组
RNA(G.Meyers等，病毒学，1989,171,18-27)，和下列寡核苷酸：
AB126(36聚体)(SEQ ID NO:29)
5’ACGCGTCGACATGAAACTAGAAAAAGCCCTGTTGGC3’
AB127(34聚体)(SEQ ID NO:30)
5’CGCGGATCCTCATAGCCGCCCTlGTGCCCCGGTC3’
根据实施例6所述技术进行RT-PCR反应以从HCV病毒中分离1363
bp的RT-PCR片段形式的编码E1蛋白的序列。纯化之后，用SalⅠ和
BamHⅠ消化此片段，得到1349bp的SalⅠ-BamHⅠ片段。将此片段与
预先经SalⅠ和BamHⅠ消化的载体pVR1012(实施例7)连接，得到质
粒pAB069(6218 bp)(图19)。
实施例20：构建质粒pAB061(猪瘟HCV E2基因)
用根据实施例4所述技术制备的猪瘟病毒(HCV)(Alfort株)基因组
RNA(G.Meyers等，病毒学，1989,171,18-27)，和下列寡核苷酸：
AB118(36聚体)(SEQ ID NO:31)
5’ACGCGTCGACATGTCAACTACTGCGTTTCTCATTTG3’
AB119(33聚体)(SEQ ID NO:32)
5’CGCGGATCCTCACTGTAGACCAGCAGCGAGCTG3’
根据实施例6所述技术进行RT-PCR反应以从HCV病毒中分离1246bp
的RT-PCR片段形式的编码E2蛋白的序列。纯化之后，用SalⅠ和
BamHⅠ消化此片段，得到1232bp的SalⅠ-BamHⅠ片段。将此片段与
预先经SalⅠ和BamHⅠ消化的载体pVR1012(实施例7)连接，得到质
粒pAB061(6101bp)(图20)。
实施例21：构建质粒pPB162(缺失的大叶性肺炎放线杆菌apxⅠ基因)
克隆大叶性肺炎放线杆菌apxⅠ基因以缺失氨基酸719-846之间富
含甘氨酸的氨基酸区域(涉及钙离子的结合)。
用根据实施例2和3所述技术制备的大叶性肺炎放线杆菌(血清型
1)的基因组DNA(J.Frey等，感染和免疫(Infect.Immun.),1991,
59,3026-3032)，和下列寡核苷酸：
PB174(32聚体)(SEQ ID NO:33)
5’TTGTCGACGTAAATAGCTAAGGAGACAACATG3’
PB189(29聚体)(SEQ ID NO:34)
5’TTGAATTCTTCTTCAACAGAATGTAATTC3’
进行PCR反应以扩增SalⅠ-EcoRⅠ片段形式的编码大叶性肺炎放线杆菌
溶血素Ⅰ蛋白之apxⅠ基因的5’部分。纯化之后，用SalⅠ和EcoRⅠ消化
2193 bp的PCR产物以分离2183 bp的SalⅠ-EcoRⅠ片段(片段A)。
用大叶性肺炎放线杆菌(血清型1)的基因组DNA(J.Frey等，
Infect.Immun.,1991,59,3026-3032)，和下列寡核苷酸：
PB190(32聚体)(SEQ ID NO:35)
5’TTGAATTCTATCGCTACAGTAAGGAGTACGG3’
PB175(31聚体)(SEQ ID NO:36)
5’TTGGATCCGCTATTTATCATCTAAAAATAAC3’
进行PCR反应以扩增EcoRⅠ-BamHⅠ片段形式的编码大叶性肺炎放线
杆菌溶血素Ⅰ蛋白之apxⅠ基因的3’部分。纯化之后，用EcoRⅠ和BamHⅠ
消化576bp的PCR产物以分离566bp的EcoRⅠ-BamHⅠ片段(片段
B)。将片段A和B与预先经SalⅠ和BamHⅠ消化的载体pVR1012(实
施例7)连接，得到质粒pPB162(7619bp)(图21)。
实施例22：构建质粒pPB163(缺失的大叶性肺炎放线杆菌apxⅡ基因)
克隆大叶性肺炎放线杆菌apxⅡ基因以缺失氨基酸716-813之间富
含甘氨酸的氨基酸区域(涉及钙离子的结合)。
用根据实施例2和3所述技术制备的大叶性肺炎放线杆菌(血清型
9)的基因组DNA(M.Smits等，感染和免疫(Infection and
Immunity),1991,59,4497-4504)，和下列寡核苷酸：
PB176(31聚体)(SEQ ID NO:37)
5’TTGTCGACGATCAATTATATAAAGGAGACTC3’
PB191(30聚体)(SEQ ID NO:38)
5’TTGAATTCCTCTTCAACTGATTTGAGTGAG3’
进行PCR反应以扩增SalⅠ-EcoRⅠ片段形式的编码大叶性肺炎放线杆菌
溶血素Ⅱ蛋白之apxⅡ基因的5’部分。纯化之后，用SalⅠ和EcoRⅠ消
化2190bp的PCR产物以分离2180bp的SalⅠ-EcoRⅠ片段(片段A)。
用大叶性肺炎放线杆菌(血清型9)的基因组DNA(M.Smits等，感
染和免疫，1991,59,4497-4504)，和下列寡核苷酸：
PB192(29聚体)(SEQ ID NO:39)
5’TTGAATTCGTAAATCTTAAAGACCTCACC3’
PB177(30聚体)(SEQ ID NO:40)
5’TTGGATCCACCATAGGATTGCTATGATTTG3’
进行PCR反应以扩增EcoRⅠ-BamHⅠ片段形式的编码大叶性肺炎放线
杆菌溶血素Ⅱ蛋白之apxⅡ基因的3’部分。纯化之后，用EcoRⅠ和
BamHⅠ消化473bp的PCR产物以分离463bp的EcoRⅠ-BamHⅠ片段
(片段B)。
将片段A和B与预先经SalⅠ和BamHⅠ消化的载体pVR1012(实
施例7)连接，得到质粒pPB163(7513 bp)(图22)。
实施例23：构建质粒pPB174’,pPB189和pPB190(缺失的大叶性肺
炎放线杆菌apxⅢ基因)
apxⅢ缺失的第一个实施例(质粒pPB174’)
克隆大叶性肺炎放线杆菌apxⅢ基因以缺失氨基酸733-860之间
富含甘氨酸的氨基酸区域(涉及钙离子的结合)。
用根据实施例2和3所述技术制备的大叶性肺炎放线杆菌(血清型
8)的基因组DNA(M.Smits,1992,Genbank序列登记号为
X68815)，和下列寡核苷酸：
PB278(30聚体)(SEQ ID NO:41)
5’TTTGTCGACATGAGTACTTGGTCAAGCATG3’
PB279(28聚体)(SEQ ID NO:42)
5’TTTATCGATTCTTCTACTGAATGTAATTC3’
进行PCR反应以扩增SalⅠ-ClaⅠ片段形式的apxⅢ基因(编码大叶性肺
炎放线杆菌溶血素Ⅲ蛋白)的5’部分。纯化之后，用SalⅠ和ClaⅠ消化
2216bp的PCR产物以分离2205bp的SalⅠ-ClaⅠ片段(片段A)。
用大叶性肺炎放线杆菌(血清型8)的基因组DNA(M.Smits,
1992,Genbank序列登记号为X68815)，和下列寡核苷酸：
PB280(33聚体)(SEQ ID NO:43)
5’TTTATCGATTTATGTTTATCGTTCCACTTCAGG3’
PB307(32聚体)(SEQ ID NO:44)
5’TTGGATCCTTAAGCTGCTCTAGCTAGGTTACC3’
进行PCR反应以扩增ClaⅠ-BamHⅠ片段形式的apxⅢ基因(编码大叶性
肺炎放线杆菌溶血素Ⅲ蛋白)的3’部分。纯化之后，用ClaⅠ和BamHⅠ
消化596bp的PCR产物以分离583bp的ClaⅠ-BamHⅠ片段(片段B)。
将片段A和B与预先经SalⅠ和BamHⅠ消化的载体pVR1012(实施例
7)连接，得到质粒pPB174’(7658 bp)(图23)。
apxⅢ缺失的第二个实施例(质粒pPB189)
克隆大叶性肺炎放线杆菌apxⅢ基因以缺失氨基酸705-886之间
富含甘氨酸的氨基酸区域(涉及钙离子的结合)。
用根据实施例2和3所述技术制备的大叶性肺炎放线杆菌(血清型
8)的基因组DNA(M.Smits,1992,Genbank序列登记号为
X68815)，和下列寡核苷酸：
PB278(30聚体)(SEQ ID NO:41)
5’TTTGTCGACATGAGTACTTGGTCAAGCATG3’
PB303(32聚体)(SEQ ID NO:45)
5’TTTATCGATTTCTTCACGTTTACCAACAGCAG3’
进行PCR反应以扩增SalⅠ-ClaⅠ片段形式的apxⅢ基因(编码大叶性肺
炎放线杆菌溶血素Ⅲ蛋白)的5’部分。纯化之后，用SalⅠ和ClaⅠ消化
2133bp的PCR产物以分离2122bp的SalⅠ-ClaⅠ片段(片段A)。
用大叶性肺炎放线杆菌(血清型8)的基因组DNA(M.Smits,
1992,Genbank序列登记号为X68815)，和下列寡核苷酸：
PB306(31聚体)(SEQ ID NO:46)
5’TTTATCGATTCTGATTTTTCCTTCGATCGTC3’
PB307(32聚体)(SEQ ID NO:44)
5’TTGGATCCTTAAGCTGCTCTAGCTAGGTTACC3’
进行PCR反应以扩增ClaⅠ-BamHⅠ片段形式的apxⅢ基因(编码大叶性
肺炎放线杆菌溶血素Ⅲ蛋白)的3’部分。纯化之后，用ClaⅠ和BamHⅠ
消化518bp的PCR产物以分离506bp的ClaⅠ-BamHⅠ片段(片段B)。
将片段A和B与预先经SalⅠ和BamHⅠ消化的载体pVR1012(实施例
7)连接，得到质粒pPB189(7496bp)(图24)。
apxⅢ缺失的第三个实施例(质粒pPB190)
克隆大叶性肺炎放线杆菌apxⅢ基因以缺失氨基酸718-876之间
富含甘氨酸的氨基酸区域(涉及钙离子的结合)。
用根据实施例2和3所述技术制备的大叶性肺炎放线杆菌(血清型
8)的基因组DNA(M.Smits,1992,Genbank序列登记号为
X68815)，和下列寡核苷酸：
PB278(30聚体)(SEQ ID NO:41)
5’TTTGTCGACATGAGTACTTGGTCAAGCATG3’
PB304(33聚体)(SEQ ID NO:47)
5’TTTATCGATACCTGATTGCGTTAATTCATAATC3’
进行PCR反应以扩增SalⅠ-ClaⅠ片段形式的apxⅢ基因(编码大叶性肺
炎放线杆菌溶血素Ⅲ蛋白)的5’部分。纯化之后，用SalⅠ和ClaⅠ消化
2172bp的PCR产物以分离2161bp的SalⅠ-ClaⅠ片段(片段A)。
用大叶性肺炎放线杆菌(血清型8)的基因组DNA(M.Smits,
1992,Genbank序列登记号为X68815)，和下列寡核苷酸：
PB305(31聚体)(SEQ ID NO:48)
5’TTTATCGATAAATCTAGTGATTTAGATAAAC3’
PB307(32聚体)(SEQ ID NO:44)
5’TTGGATCCTTAAGCTGCTCTAGCTAGGTTACC3’
进行PCR反应以扩增ClaⅠ-BamHⅠ片段形式的apxⅢ基因(编码大叶性
肺炎放线杆菌溶血素Ⅲ蛋白)的3’部分。纯化之后，用ClaⅠ和BamHⅠ
消化548bp的PCR产物以分离536bp的ClaⅠ-BamHⅠ片段(片段B)。
将片段A和B与预先经SalⅠ和BamHⅠ消化的载体pVR1012 (实施例
7)连接，得到质粒pPB190(7565 bp)(图25)。
实施例24：制备和纯化质粒
为了制备欲接种动物的质粒，可使用能得到超螺旋形式占优势的纯
化质粒悬浮液的任何技术，这些技术是本领域技术人员所熟知的。这里
可特别提到J.Sambrook等人(分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉
港实验室，冷泉港，纽约，1989)所述的碱裂解技术，接着再在溴化乙
锭的存在下，在氯化铯梯度中进行2次连续的超速离心。也可参照专利
申请PCT WO 95/21250和PCT WO 96/02658，它们描述了工业化规
模生产可用于接种之质粒的方法。为了制备疫苗(见实施例17)，可重新
悬浮纯化的质粒以得到适于储存的高浓度溶液(＞2mg/m1)。为此，将质
粒重新悬浮于超纯水或TE缓冲液(10mM Tris-HCl；1mM EDTA,
pH8.0)中。
实施例25：制备联合疫苗
从其浓缩溶液(实施例16)开始混合制备联合疫苗所需的多种质
粒。制备混合物以使各个质粒的终浓度相当于各个质粒的有效剂量。可
被用于调节疫苗终浓度的溶液可以是0.9％的NaCl溶液，也可以是PBS
缓冲液。
也可以将特殊的制剂，如脂质体，阳离子脂质用于制备疫苗。
实施例26：对猪的接种
以每种质粒100,250或500μg的剂量接种猪。
通过肌内途径用针头进行注射。此时，以2ml的体积施用疫苗剂
量。
也可使用在5个点分送0.2ml剂量(每个注射点0.04ml)的液体喷射
注射器装置(不带针头)(如“PIGJET”装置)，经由皮内途径进行注射。
此时，施用的疫苗剂量体积为0.2或0.4ml，这分别相应于注射1次或
2次。当利用PIGJET装置进行2次连续的注射时，应将注射区间隔开
以使2个注射区彼此间隔约1-2cm的距离。