一种体外血型血清学实验检定方法 【技术领域】
本发明涉及体外血型血清学检定方法，特别是提供一种以木瓜凝乳蛋白酶试剂溶液、酶抑制剂-64试剂溶液为介质的体外血型血清学实验检定方法。
背景技术
在常规体外血型血清学—蛋白酶实验检定方法中，由于使用的巯基蛋白酶试剂缺乏完整的质量检定标准，以及传统的木瓜酶、菠萝酶一步法、二步法实验技术，存在对红细胞的过度水解、对血型抗体的水解—降解作用，是造成蛋白酶检定实验出现“假阳性”、“假阴性”实验检定结果的本质性原因。
【发明内容】
本发明的目的是提供一种准确的体外血型血清学检定方法。
本发明所提供的检测体外血型血清学的方法，包括如下步骤：
1)将木瓜凝乳蛋白酶试剂溶液与红细胞悬液混合均匀，在水浴场、微波场、或自动温控振荡仪中孵育；所述木瓜凝乳蛋白酶制剂含有木瓜凝乳蛋白酶，L-半胱氨酸和普鲁兰；
2)加入酶抑制剂-64试剂溶液，分别加入受检物，阳性对照物和阴性对照物，混合均匀，在水浴箱、微波场或自动温控振荡仪中孵育；所述酶抑制剂-64含有反式-环氧琥珀酰-L-亮氨酰氨基(4-胍基)丁烷、甘露醇、海藻糖和普鲁兰；
3)120×g离心1分钟，记录检测结果。
为了使检测的效果更好，所述木瓜凝乳蛋白酶制剂中还含有甘露醇、海藻糖和维生素C盐；所述木瓜凝乳蛋白酶制剂中每200000PU单位的木瓜凝乳蛋白酶中甘露醇、海藻糖和维生素C盐的含量分别为0.2-0.3mol、0.01-0.02mol和0.01-0.02mol；所述酶抑制剂-64中每40000TU单位的反式-环氧琥珀酰-L-亮氨酰氨基(4-胍基)丁烷中甘露醇、海藻糖和普鲁兰的含量分别为0.2-0.3mol、0.01-0.02mol和0.05-0.1mol。木瓜凝乳蛋白酶试剂溶液具有的活力效价为：1/10分钟10-16PU/50μl、或者是10分钟100-160PU/50μl；酶抑制剂-64试剂溶液具有的活性效价为：1/10分钟20-32TU/50μl、或者是10分钟200-320TU/50μ1。
所述地水浴孵育为在37-39℃水浴孵育5-10分钟；所述的微波孵育为在设定功率300-360W、输出功率30％的微波场中孵育200-300秒钟；所述的自动温控振荡仪孵育为在37-39℃、300-500r/min、1-3Level自动温控振荡仪孵育5-10分种。通过热效应，完成木瓜凝乳蛋白酶对红细胞膜的水解修饰作用，形成血型抗原对血型抗体的吸附—凝集条件。
检定实验使用的红细胞试剂是：ABO以外血型抗体筛检红细胞悬液，红细胞ABO以外血型谱细胞悬液，A型红细胞悬液，B型红细胞悬液，受血者红细胞悬液，供血者红细胞悬液，患者红细胞悬液。上述红细胞试剂的红细胞浓度为2-4％。
检定实验使用的标本物是：患者(或受血者)血清样本，供血者血清样本，患者、供血者IgG抗-A、抗-B实验检定用血清样本溶液，红细胞放散液；以及人源型ABO-IgG-抗-A、抗-B，Rh-抗-D、抗-C、抗-E、抗-c、抗-e、Kell-抗-K、抗-k、kiad-抗-JKa、抗-JKb、Lewis-抗-Lea、抗-Leb、抗-Lea+b、P-抗-P1抗体血清。
在检定实验中，如采用U型多孔板为实验容器，可以采用扫描酶标仪—血型判读系统自动读取、记录实验结果；用试管为实验容器，采用人工读取、记录实验结果。
本发明所提供的实验检定方法，用于人类血样本的ABO-IgG-抗-A、抗-B，Rh-抗-D、抗-C、抗-E、抗-c、抗-e、Kell-抗-K、抗-k、kiad-抗-JKa、抗-JKb、Lewis-抗-Lea、抗-Leb、抗-Lea+b、P-抗-P1等血型抗体与相应红细胞血型抗原的检定，如临床血样本的抗体筛检，抗体特异性鉴定，抗体效价滴定，IgG抗A、抗-B检定，输血相容性试验等。
本发明克服了传统的蛋白酶实验检定的技术缺限，提高了实验检定的安全性与灵敏度，具体表现在：
1、使用专用型活力效价为10-16PU/50μl或100-160PU/50μl的木瓜凝乳蛋白酶试剂溶液，在规定的实验温度-时间条件下，对红细胞膜进行有效的水解修饰，裸露血型抗原受体，使之具备与相应的血型抗体直接形成可视性免疫凝集的能力。
2、在木瓜凝乳蛋白酶完成对红细胞膜的水解修饰作用后，使用专用型活性效价为20-32TU/50μl或200-320TU/50μl的酶抑制剂-64试剂溶液，快速抑制木瓜凝乳蛋白酶活力。防止活性酶对红细胞的过度性水解效应—产生“假阳性”实验结果，以及活性酶对血型抗体的水解效应—产生“假阴性”实验结果。显著提高检定实验的安全性与灵敏度，从根本上消除蛋白酶试剂在体外血型血清学中“试剂型”实验检定事故的发生。
3、所使用的木瓜凝乳蛋白酶试剂溶液、酶抑制剂-64试剂溶液，不含有蛋白质沉淀剂，红细胞凝集素。杜绝“试剂性——假阳性”检定实验结果的产生。
4、微波是一种超短波，在微波的热效应、化学效应、生物学效应的作用下，木瓜凝乳蛋白酶对红细胞水解修饰速率加快，酶抑制剂-64与生物巯基形成复合物的速率加快，是显著降低实验耗时，保持实验检定安全性与灵敏度的重要实验方法。
5、本发明的核心技术是：利用木瓜凝乳蛋白酶对红细胞进行有效地水解修饰，酶抑制剂-64使完成对红细胞水解修饰作用后的木瓜凝乳蛋白酶快速失去活力效价，可近一步拓展为对红细胞试剂的酶化预处理，制备3％酶化A型、B型红细胞试剂，3％酶化ABO以外血型抗体筛检红细胞悬液，以适应血液中心批量化开展非盐水介质血型抗体的筛检、鉴定实验。
【具体实施方式】
实验材料
1、细胞材料
3％受检红细胞悬液，3％受血者红细胞悬液，3％供血者红细胞悬液，3％Rho(D)阳性红细胞悬液，3％Rho(D)阴性红细胞悬液，3％A型红细胞悬液，3％B型红细胞悬液，3％筛检红细胞悬液，3％血型谱细胞悬液。
上述细胞材料中3％受检红细胞悬液，3％受血者红细胞悬液，3％供血者红细胞悬液取自医院血库血样本。其它细胞试剂产自Immucor。
2、血清材料
患者、供血者血清标本，红细胞放散液，患者、供血者IgG抗-A、抗-B实验检定用血清样本溶液；人源型ABO-IgG-抗-A、抗-B，Rh-抗-D、抗-C、抗-E、抗-c、抗-e、Kell-抗-K、抗-k、kiad-抗-JKa、抗-JKb、Lewis-抗-Lea、抗-Leb、抗-Lea+b、P-抗-P1等抗体血清标本，以及AB血清标本。
上述血清材料中患者血清样本，供血者血清样本，患者、受血者IgG抗-A、抗-B实验检定用血清样本溶液，红细胞放散液等，取自医院血库血样本。其它血清材料产自Immucor。
实施例1、木瓜凝乳蛋白酶的提取与制备
取1000g的番木瓜果浆冰冻物，用微波加热融化，加入1000ml 0.02mol/L磷酸盐缓冲液(pH5.5)，在匀浆器中匀浆。
加入1％壳聚糖溶液100ml，匀浆搅拌，室温静置2小时后过滤，去除沉淀，保留滤液。
向滤液中加入硫酸铵至35％饱和度，室温静置60分钟，在2-8℃、10000×g离心20分钟，去除沉淀；向离心上清液中加入硫酸铵至50％饱和度，室温静置60分钟，在2-8℃、10000×g离心20分钟，去除沉淀；在上清液中加入过量酒石酸溶液，调节pH至＜2.5，室温静置60分钟。10000×g离心20分钟，弃去沉淀物；最后再向上清液中加入硫酸铵至70％饱和度，室温静置60分钟，10000×g离心20分钟，收集沉淀物。
将沉淀物用200ml纯水溶解，然后用截留分子量为1万的聚砜中空纤维超滤膜超滤，在超滤过程中分次加入2-8℃水，在0.1兆帕的条件下循环超滤1h，得到超滤浓缩液。
向上述溶液中加入100ml 0.2mol/L磷酸钠缓冲液(pH5.5)，混匀。用该磷酸钾缓冲液预先平衡纤维素CM-C92色谱柱，然后以5ml/min的速度，将溶液上柱，以0.7mol/L磷酸钠缓冲液(pH5.5)为洗脱液，收集木瓜凝乳蛋白酶洗脱液，用截留分子量为1万的聚砜中空纤维超滤膜浓缩洗脱液。
向浓缩液加入普鲁兰0.1mmol、L-半胱氨酸0.025mol，冷冻干燥得到木瓜凝乳蛋白酶干燥物20g。
实施例2、木瓜凝乳蛋白酶试剂盒的制备
1、木瓜凝乳蛋白酶制剂
普鲁兰 0.05mmol
甘露醇 0.3mol
海藻糖 0.02mol
抗坏血酸钠 0.02mol
L-半胱氨酸 0.05mol
木瓜凝乳蛋白酶 200000PU
定量称取上述溶质，溶解于纯水中，稀释至1000ml定容，用0.2μm微孔滤膜过滤除菌，然后按每瓶2000PU规格分装至洁净西林瓶。用冷冻干燥机迅速降温至-40℃，维持4小时；然后启动干燥程序，以每小时升温5℃速率减压干燥，将被冻结产品升温33℃维持3小时，停止减压，对成品进行密封包装，得到成品木瓜凝乳蛋白酶制剂。
2、木瓜凝乳蛋白酶溶剂
磷酸二氢钾 0.064mol
磷酸氢二钠 0.003mol
用纯水溶解上述溶质，调解pH至5.5，稀释至1000ml定容，用0.2μm微孔滤膜过滤除菌，然后按每瓶10ml规格分装至至聚乙烯瓶内，密封。
使用前用木瓜凝乳蛋白酶溶剂溶解木瓜凝乳蛋白酶制剂，形成木瓜凝乳蛋白酶试剂溶液，用2％偶蛋化白蛋白—磷酸盐溶液检测木瓜凝乳蛋白酶试剂溶液的活力效价。
依照体外血型血清学实验检定灵敏度的评价标准，每50μl的木瓜凝乳蛋白酶试剂溶液应具有的活力效价按照下述的标识方法I为10-16PU；按照下述的标识方法II为100-160PU。
活力效价标识方法I：PU＝每50μl试剂溶液1/10分钟所具有的活力效价。
活力效价标识方法II：PU＝每50μl试剂溶液10分钟所具有的活力效价。
3、酶抑制剂-64制剂
反式-环氧琥珀酰-L-亮氨酰氨基(4-胍基)丁烷 400000TU
普鲁兰 0.05mmol
甘露醇 0.3mol
海藻糖 0.02mol
定量称取上述溶质，溶解于纯水中，稀释至1000ml定容，用0.2μm微孔滤膜过滤除菌。然后按每瓶4000TU规格分装至洁净西林瓶。用冷冻干燥机迅速降温至-40℃，维持4小时；然后启动干燥干燥程序，以每小时升温5℃速率减压干燥，将被冻结产品升温33℃维持3小时，停止减压，对成品进行密封包装，得到酶抑制剂-64制剂。
4、酶抑制剂-64溶剂
磷酸二氢钾 0.027mol
磷酸氢二钠 0.040mol
用纯水溶解上述溶质，调解pH至7.0，稀释至1000ml定容，用0.2μm微孔滤膜过滤除菌，然后按每瓶10ml规格分装至聚乙烯瓶内，密封。
使用前用酶抑制剂-64溶剂溶解酶抑制剂-64制剂，形成酶抑制剂-64试剂溶液。
用2％偶蛋化白蛋白—磷酸盐溶液、30PU/150μl/min或300PU/150μl活力效价的木瓜凝乳蛋白酶试剂，检测酶抑制剂-64试剂溶液活性效价。
依照体外血型血清学实验检定安全性的评价标准，每50μl的酶抑制剂-64试剂溶液应具有的活性效价按照标识方法I为20-32TU；按照标识方法II为200-320TU。
活性效价标识方法I：TU＝每50μl试剂溶液1/10分钟所具有的活性效价。
活性效价标识方法II：TU＝每50μl试剂溶液10分钟所具有的活性效价。
实施例3制备酶化试剂红细胞
1)将3％红细胞悬液、木瓜凝乳蛋白酶试剂溶液置水浴预热至37±0.5℃。
2)将等体积的3％试剂红细胞悬液，木瓜凝乳蛋白酶试剂溶液，混合均匀，形成实验体系，移入37±0.5℃水浴孵育5分钟。
3)向实验体系加入0.5体积的酶抑制剂-64试剂溶液，混合均匀，室温放置3分钟。
4)将实验系统移入离心机，120×g离心1分钟；1000×g离心30秒钟，用生理盐水洗涤、制备压积红细胞。
5)取压积红细胞，用生理盐水制备3％红细胞悬液。
6)上述试剂红细胞可以是A型、B型、O型红细胞，筛检红细胞，红细胞血型谱细胞。
用上述方法制备的酶化红细胞，可常规用于非盐水介质血型抗体检定实验，显著提高工作效率。
实施例4对被抗体包被的红细胞的清洗
在特殊的病理条件下，患者自身抗体与其红细胞具有较常的亲合力，用常规放散法无法解离被吸附的抗体，从而影响红细胞血型的鉴定。采用下述方法可以使患者的红达到理想的清洗效果，顺利进行红细胞血型的鉴定。
1)将被处理的1体积红细胞用生理盐水制备3％红细胞悬液，与1体积的木瓜凝乳蛋白酶试剂溶液分别预热至37±0.5℃。
2)将上述红细胞悬液、木瓜凝乳蛋白酶试剂溶液混合均匀，移入37±0.5℃水浴孵育5分钟。
3)加入1体积的酶抑制剂-64试剂溶液，混合均匀，室温放置3分钟。
4)将实验系统移入离心机，120×g离心1分钟；1000×g离心30秒钟。用生理盐水洗涤3次，制备3％红细胞悬液，进行红细胞血型鉴定。
用上述方法，与常规放散法为对比实验，对100例自身免疫性溶血性贫血患者的红细胞进行清洗试验。成功率为100％，未出现“假阳性”结果。
实施例5 血型抗体筛检
一、试管—水浴方法
1、取5支试管，标记阳性对照、阴性对照、受检1、受检2、受检3。
2、向阳性对照加入3％Rho(D)阳性红细胞悬液50μl；向阴性对照加入3％Rho(D)阳性红细胞悬液50μl；向受检1加入3％I号筛检红细胞悬液50μl，向受检2加入3％II号筛检红细胞悬液50μl，向受检3加入3％III号筛检红细胞悬液50μl；向全部试管各加入木瓜凝乳蛋白酶试剂溶液50μl，混合均匀。
3、将试管移入37±0.5℃水浴孵育5分钟。向全部试管各加入酶抑制剂-64试剂溶液50μl；向阳性对照管加入IgG抗-D血清50μl；向阴性对照管加入AB血清50μl；向受检管1-受检管3各加入血清标本50μl，或红细胞放散液100μl，混合均匀。
4、将试管移入37±0.5℃水浴场孵育7分钟。
5、将试管移入离心机，120×g离心1分钟。
6、轻轻摇动试管，悬浮红细胞，肉眼观察实验检定结果。
7、阳性对照产生红细胞凝集，阴性对照不产生红细胞凝集，实验结果成立。受检管出现红细胞凝集为实验检定阳性结果，受检管未出现红细胞凝集为实检定阴性结果。
采用间接抗人球蛋白血型抗体筛检实验方法与本发明的实验方法为平行试验，在对2000例献血者的血清样本中一致筛检出4例阳性血样，无“假阴性”、“假阳性”实验结果。
对4例阳性血样，采用室温盐水、37℃盐水、间接抗人球蛋白等血型抗体特异性鉴定实验方法，以及实施例6所述的血型抗体特异性鉴定实验方法，进行抗体特异性鉴定。鉴定结果一致证实，3例为IgG抗-D、1例为抗-Lea。
二、试管—微波方法
1、同水浴方法中的第1步。
2、同水浴方法中的第2步。
3、将试管移入微波场，在功率强度360W，功率输出率30％的条件下，辐射孵育200秒钟。
4、同水浴方法中的第4步。
5、将试管移入微波场，在功率强度360W，功率输出率30％的条件下，辐射孵育300秒钟。
6、同水浴方法中的第6步。
7、同水浴方法中的第7步。
采用上述的试管—水浴抗体筛检实验方法、间接抗人球蛋白血型抗体筛检实验方法与本发明的实验方法为平行试验，在对2000例献血者的血清样本中一致筛检出出4例阳性血样，无“假阴性”、“假阳性”实验结果。
对4例阳性血样，采用室温盐水、37℃盐水、间接抗人球蛋白等血型抗体特异性鉴定实验方法，以及实施例6所述的血型抗体特异性鉴定实验方法，进行抗体特异性鉴定。鉴定结果一致证实，3例为IgG抗-D、1例为抗-Lea。
三、U型多孔板—自动温控震荡仪器方法
1、取U型多孔板，标记阳性对照孔、阴性对照孔、受检孔1、受检孔2、受检孔3。
2、向阳性对照孔加入3％Rho(D)阳性红细胞悬液50μl；向阴性对照孔加入3％Rho(D)阳性红细胞悬液50μl；向受检孔1加入3％I号筛检红细胞悬液50μl，向受检孔2加入3％II号筛检红细胞悬液50μl，向受检3孔加入3％III号筛检红细胞悬液50μl；向各实验孔加入木瓜凝乳蛋白酶试剂溶液50μl，混合均匀。
3、将实验多孔板移入自动温控振荡仪内，在37℃、300r/min、1Level条件下孵育7分钟。
4、向每一实验孔加入酶抑制剂-64试剂溶液50μl，向阳性对照孔加入IgG抗-D血清50μl；向阴性对照孔加入AB血清50μl；向受检孔1-受检孔3各加入受检血清50μl，或红细胞放散液100μl，混合均匀。
5、将实验多孔板移入自动温控振荡仪内，在37℃、300r/min、1Level条件下孵育7分钟。
6、将实验系统移入离心机，120×g离心1分钟。
7、将实验系统移入自动温控振荡仪内，在1000r/min、2Level、1分钟工作条件下悬浮红细胞。
8、用扫描酶标仪—自动血型判读系统读取、记录实验结果。
9、阳性对照孔产生红细胞凝集，阴性对照孔不产生红细胞凝集，实验结果成立。受检孔出现红细胞凝集为实验检定阳性结果，受检孔未出现红细胞凝集为实检定阴性结果。
采用间接抗人球蛋白血型抗体筛检实验方法与本发明的U型多孔板—自动温控震荡仪器血型抗体筛检实验方法为平行试验，在对2000例献血者的血清样本中一致筛检出4例阳性血样，无“假阴性”、“假阳性”实验结果。
对4例阳性血样，采用室温盐水、37℃盐水、间接抗人球蛋白等血型抗体特异性鉴定实验方法，以及实施例6所述的血型抗体特异性鉴定实验方法，进行抗体特异性鉴定。鉴定结果一致证实，3例为IgG抗-D、1例为抗-Lea。
四、U型多孔板—微波—自动温控震荡仪器方法
1、同U型多孔板—自动温控震荡仪器方法中的第1步。
2、同U型多孔板—自动温控震荡仪器方法中的第2步。
3、将实验U型多孔板移入微波场，在功率强度360W，功率输出率30％的条件下，辐射孵育200秒钟。
4、同U型多孔板—自动温控震荡仪器方法中的第4步。
5、将实验U型多孔板移入微波场，在功率强度360W，功率输出率30％的条件下，辐射孵育200秒钟。
6、同U型多孔板—自动温控震荡仪器方法中的第6步。。
7、同U型多孔板—自动温控震荡仪器方法中的第7步。。
8、同U型多孔板—自动温控震荡仪器方法中的第8步。
9、同U型多孔板—自动温控震荡仪器方法中的第9步。
采用上述的U型多孔板—自动温控震荡仪器血型抗体筛检实验方法、间接抗人球蛋白血型抗体筛检实验方法与本发明的实验方法为平行试验，在对2000例献血者的血清样本中一致筛检出出4例阳性血样，无“假阴性”、“假阳性”实验结果。
对4例阳性血样，采用室温盐水、37℃盐水、间接抗人球蛋白等血型抗体特异性鉴定实验方法，以及实施例6所述的血型抗体特异性鉴定实验方法，进行抗体特异性鉴定。鉴定结果一致证实，3例为IgG抗-D、1例为抗-Lea。
实施例6 血型抗体特异性鉴定实验(试管—水浴方法)
1、取试管，标记I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI，依次置试管架排列。
2、向上述试管加入与其标记相符合的3％血型谱细胞悬液50μl，木瓜凝乳蛋白酶试剂溶液50μl，混合均匀。
3、将试管移入37±0.5℃水浴孵育5分钟。
4、向全部试管各加入酶抑制剂-64试剂溶液50μl；向全部试管各加入血清标本50μl，或红细胞放散液100μl，混合均匀。
5、将试管移入37±0.5℃水浴孵育7分钟。
6、将试管移入离心机，120×g离心1分钟。
7、轻轻摇动试管，悬浮红细胞，肉眼观察实验鉴定结果。依据受检血清在不同血型谱细胞产生的凝集与否，判定受检血清的血型抗体特异性。
经采用室温盐水实验、37盐水实验、间接抗人球蛋白实验等血型抗体特异性鉴定实验方法与本发明的实验方法作为平行试验，对产自Immucor的人源型Rh-抗-D、抗-C、抗-E、抗-c、抗-e、Kell-抗-K、抗-k、kiad-抗-JKa、抗-JKb、Lewis-抗-Lea、抗-Leb、抗-Lea+b、P-抗-P1等血型抗体血清，以及临床样本血清进行抗体特异性鉴定。实验结果表明，本实验方法对上述血型抗体的实验鉴定准确率为100％。
实施例7血型抗体效价滴定实验(试管—水浴方法)
1、取10支试管，标记1/1、1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64、1/128、1/256、1/512；向1/2-1/512各加入生理盐水100μl；向1/1加入被滴定的血型抗体血清200μl。
2、用加样器自1/1吸取血清100μl，注入1/2，用加样器反复吸注，混合均匀。如此所示方法制备血型抗体血清倍比稀释液。
3、取11支试管，标记1/1、1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64、1/128、1/256、1/512、阴性对照。向上述试管各加入与被滴定的血型抗体相匹配的纯合子血型抗原阳性3％红细胞悬液50μl，木瓜凝乳蛋白酶试剂溶液50μl，混合均匀。
4、将试管移入37±0.5℃水浴孵育5分钟。
5、向全部试管各加入酶抑制剂-64试剂溶液50μl；向血型抗体效价滴定试管加入与其标记相符合的血型抗体血清倍比稀释液100μl；向阴性对照加入AB血清50μl，混合均匀。
6、将试管移入37±0.5℃水浴孵育7分钟。
7、将试管移入离心机，120×g离心1分钟。
8、轻轻摇动试管，悬浮红细胞，肉眼观察滴定实验结果。阴性对照无红细胞凝集，实验结果成立。以最高稀释倍数的血型抗体血清对红细胞产生的最小凝集强度(1+)的倒数为为被滴定的抗体的效价。
经采用间接抗人球蛋白血型抗体效价滴定实验方法与本发明的实验方法作为平行试验，对产自Immucor的人源型Rh-抗-D、抗-C、抗-E、抗-c、抗-e，Kell-抗-K、抗-k，kiad-抗-JKa、抗-JKb，Lewis-抗-Lea、抗-Leb、抗-Lea+b，P-抗-P1等血型抗体血清以及临床血清样本进行抗体效价滴定。实验结果表明，本发明的实验方法与间接抗人球蛋白抗体效价滴定实验方法相比，平均灵敏度高出2-3个数量级。
实施例8 IgG抗-A、抗-B血型抗体检定实验
一、试管—水浴方法
1、取血清，加入等量PBS-2me溶液，37±0.5℃保温1小时，制备IgG抗-A、抗-B实验检定用血清样本溶液。
取IgG抗-A、抗-B实验检定用血清样本溶液、或红细胞放散液，用倍比稀释方法制备1/1、1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64、1/128、1/256、1/512倍比稀释液，作为受检标本倍比稀释液。
2、取24支试管，标记A1/1、A1/2、A1/4、A1/8、A1/16、A1/32、A1/64、A1/128、A1/256、A1/512作为受检A，A阳性对照、A阴性对照；B1/1、B1/2、B1/4、B1/8、B1/16、B1/32、B1/64、B1/128、B256、B1/512作为受检B，B阳性对照、B阴性对照，依次置试管架排列。
3、向A1/1-A阴性对照加入3％A型红细胞悬液50μl；向B1/1-B阴性对照加入3％B型红细胞悬液50μl；向每支试管加入木瓜凝乳蛋白酶试剂溶液50μl，混合均匀。
4、将试管移入37±0.5℃水浴孵育5分钟。
5、向全部试管各加入酶抑制剂-64试剂溶液50μl；向A1/1-A1/512加入1/1-1/512加入与其标记数码相符合的受检标本倍比稀释液100μl，向A阳性对照加入IgG抗-A血清50μl，向A阴性对照加入AB血清50μl；向B1/1-B1/512加入加入与其标记数码相符合的1/1-1/512受检标本倍比稀释液100μl，向B阳性对照加入IgG抗-B血清50μl，向B阴性对照加入AB血清50μl，混合均匀。
6、将试管移入37±0.5℃水浴场孵育7分钟。
7、将试管移入离心机，120×g离心1分钟。
8、轻轻摇动试管，悬浮红细胞，肉眼观察实验检定结果。
9、阳性对照产生红细胞凝集，阴性对照不产生红细胞凝集，实验结果成立。受检A出现红细胞凝集为实验检定阳性结果，受检A未出现红细胞凝集为实检定阴性结果；受检B出现红细胞凝集为实验检定阳性结果，受检A未出现红细胞凝集为实检定阴性结果。以最高稀释倍数的受检标本对红细胞产生的最小凝集强度(1+)的倒数为被滴定的抗体的效价。
采用间接抗人球蛋白IgG抗-A、抗-B血型抗体检定实验方法与本发明的检定实验方法为平行试验，对2000例O型血献血者的血清样本中一致检定出612例IgG抗-A、1106例IgG抗-B，无“假阴性”、“假阳性”实验结果。
本发明的IgG抗-A、抗-B血型抗体检定实验的结果显示的612例抗-A、1106例IgG抗-B的效价较间接抗人球蛋白IgG抗-A、抗-B血型抗体检定实验的结果高出2-3个数量级。
二、试管—微波方法
1、同试管-水浴方法的步骤1。
2、同试管-水浴方法的步骤2。
3、同试管-水浴方法的步骤3。
4、将试管移入微波场，在功率强度360W，功率输出率30％的条件下，辐射孵育200秒钟。
5、同试管-水浴方法的步骤5。
6、将试管移入微波场，在功率强度360W，功率输出率30％的条件下，辐射孵育300秒钟。
7、同试管-水浴方法的步骤7。
8、同试管-水浴方法的步骤8。
9、同试管-水浴方法的步骤9。
采用上述的试管—水浴IgG抗-A、抗-B血型抗体检定实验方法、间接抗人球蛋白IgG抗-A、抗-B血型抗体检定实验方法、与本发明的IgG抗-A、抗-B血型抗体检定实验方法为平行试验，对2000例O型血献血者的血清样本中一致检定出612例IgG抗-A、1106例IgG抗-B，无“假阴性”、“假阳性”实验结果。
本发明的IgG抗-A、抗-B血型抗体检定实验的结果显示的612例抗-A、1106例IgG抗-B的效价较间接抗人球蛋白IgG抗-A、抗-B血型抗体检定实验的结果高出2-3个数量级。与上述的试管—水浴IgG抗-A、抗-B血型抗体检定实验的结果无明显差异。
三、U型多孔板—自动温控震荡仪方法
1、同试管-水浴方法的步骤1。
2、取多孔板，标记A1/1、A1/2、A1/4、A1/8、A1/16、A1/32、A1/64、A1/128、A1/256、A1/512作为受检A，A阳性对照、A阴性对照；B1/1、B1/2、B1/4、B1/8、B1/16、B1/32、B1/64、B1/128、B256、B1/512作为受检B，B阳性对照、B阴性对照。
3、向A1/1-A阴性对照各加入3％A型红细胞悬液50μl；向B1/1-B阴性对照加入3％B型红细胞悬液50μl；向每1实验孔加入木瓜凝乳蛋白酶试剂溶液50μl，混合均匀。
4、将实验多孔板移入自动温控振荡仪内，在37℃、300r/min、1Level条件下孵育7分钟。
5、向每1实验孔加入酶抑制剂-64试剂溶剂50μl，向A1/1-A1/512加入1/1-1/512加入与其标记数码相符合的受检标本倍比稀释液100μl，或红细胞放散液100μl，向A阳性对照加入IgG抗-A血清50μl，向A阴性对照加入AB血清50μl；向B1/1-B1/512加入与其标记数码相符合的受检标本倍比稀释液100μl，或红细胞放散液100μl，向B阳性对照加入IgG抗-B血清50μl，向B阴性对照加入AB血清50μl，混合均匀。
6、将实验多孔板移入自动温控振荡仪内，在37℃、300r/min、1Level条件下孵育7分钟。
7、将实验多孔板移入离心机，120×g离心1分钟。
8、用扫描酶标仪—自动血型判读系统读取、记录实验结果。
9、阳性对照产生红细胞凝集，阴性对照不产生红细胞凝集，实验结果成立。受检A出现红细胞凝集为实验检定阳性结果，受检A未出现红细胞凝集为阴性实验检定结果；受检B出现红细胞凝集为阳性实验检定结果，受检B未出现红细胞凝集为阴性实验检定结果。阳性实验检定结果，以最高稀释倍数的受检标本倍比稀释液对红细胞产生的最小凝集强度(1+)的倒数为抗体的效价。
采用间接抗人球蛋白IgG抗-A、抗-B血型抗体检定实验方法与本发明的IgG抗-A、抗-B血型抗体检定实验方法为平行试验，在对2000例O型血献血者的血清样本中一致检定出612例IgG抗-A、1106例IgG抗-B，无“假阴性”、“假阳性”实验结果。
本发明的IgG抗-A、抗-B血型抗体检定实验的结果显示的612例抗-A、1106例IgG抗-B的效价较间接抗人球蛋白IgG抗-A、抗-B血型抗体检定实验的结果高出2-3个数量级。
四、U型多孔板—微波—自动温控震荡仪方法
1、同U型多孔板—自动温控震荡仪方法中的步骤1。
2、同U型多孔板—自动温控震荡仪方法中的步骤2。
3、同U型多孔板—自动温控震荡仪方法中的步骤3。
4、将实验多孔板移入微波场，在功率强度360W，功率输出率30％的条件下，辐射孵育200秒钟。
5、同U型多孔板—自动温控震荡仪方法中的步骤5。
6、将实验多孔板移入微波场，在功率强度360W，功率输出率30％的条件下，辐射孵育300秒钟。
7、同U型多孔板—自动温控震荡仪方法中的步骤7。
8、同U型多孔板—自动温控震荡仪方法中的步骤8。
9、同U型多孔板—自动温控震荡仪方法中的步骤9。
采用上述的U型多孔板—自动温控震荡仪IgG抗-A、抗-B血型抗体检定实验方法、间接抗人球蛋白IgG抗-A、抗-B血型抗体检定实验方法、与本发明的IgG抗-A、抗-B血型抗体检定实验方法为平行试验，在对2000例O型血献血者的血清样本中一致检定出612例IgG抗-A、1106例IgG抗-B，无“假阴性”、“假阳性”实验结果。
本发明的IgG抗-A、抗-B血型抗体检定实验的结果显示的612例抗-A、1106例IgG抗-B的效价较间接抗人球蛋白IgG抗-A、抗-B血型抗体检定实验的结果高出2-3个数量级。与U型多孔板—微波—自动温控震荡仪方法IgG抗-A、抗-B血型抗体检定实验所得实验结果无明显差异。
实施例9 输血相容性实验
一、试管—水浴方法
1、取4支试管，标记主侧、次侧、阳性对照、阴性对照。向主侧加入3％供血者红细胞悬液50μl，向次侧加入3％受血者红细胞悬液50μl；阳性对照、阴性对照各加入3％Rho(D)阳性红细胞悬液50μl，向全部试管各加入木瓜凝乳蛋白酶试剂溶液50μl，混合均匀。
2、将试管移入37±0.5℃水浴孵育5分钟。
3、向全部试管各加入酶抑制剂-64试剂溶液50μl；向主侧加入受血者血清50μl；向次侧加入供血者血清50μl，向阳性对照加入IgG抗-D血清50μl；向阴性对照加入AB血清50μl混合均匀。
4、将试管移入37±0.5℃水浴孵育7分钟。
5、将试管移入离心机，120×g离心1分钟。
6、轻轻摇动试管，悬浮红细胞，肉眼观察实验结果。阳性对照产生红细胞凝集，阴性对照不产生红细胞凝集，实验结果成立。主侧、次侧无红细胞凝集与溶血为阴性实验结果，主侧、或次侧出现红细胞凝集与溶血为阳性实验结果。
采用间接抗人球蛋白输血相容性实验方法、与本发明的实验方法为平行试验，在对1150例输血相容性实验中一致检定出2例阳性标本，无“假阴性”、“假阳性”实验结果。
对上述阳性标本采用采用室温盐水、37℃盐水、间接抗人球蛋白等血型抗体特异性鉴定实验方法，以及实施例6所述的抗体特异性鉴定实验方法，进行抗体特异性鉴定。同类实验检定结果一致确认，其中1例为IgG抗-E，1例为抗-K。
二、试管—微波方法
1、同试管—水浴方法中的第1步。
2、将试管移入微波场，在功率强度360W，功率输出率30％的条件下，辐射孵育200秒钟。
3、同试管—水浴方法中的第3步。
4、将试管移入微波场，在功率强度360W，功率输出率30％的条件下，辐射孵育300秒钟。
5、同试管—水浴方法中的第5步。
6、同试管—水浴方法中的第6步。。
采用间接抗人球蛋白输血相容性实验方法、上述的试管—水浴输血相容性实验方法、与本发明实验方法为平行试验，在对1150例输血相容性实验中一致检定出2例阳性标本，无“假阴性”、“假阳性”实验结果。
对上述阳性标本采用采用室温盐水、37℃盐水、间接抗人球蛋白等血型抗体特异性鉴定实验方法，以及实施例6所述的抗体特异性鉴定实验方法，进行抗体特异性鉴定。同类实验检定结果一致确认，其中1例为IgG抗-E，1例为抗-K。
三、U型多孔板—自动温控震荡仪方法
1、取U多孔板，标记主侧孔、次侧孔、阳性对照孔、阴性对照孔。向主侧孔加入3％供血者红细胞悬液50μl，向次侧孔加入3％受血者红细胞悬液50μl；向阳性对照孔、阴性对照孔各加入3％Rho(D)阳性红细胞悬液50μl，向全部实验孔各加入木瓜凝乳蛋白酶试剂溶液50μl，混合均匀。
2、将U实验多孔板移入自动温控振荡仪内，在37℃、300r/min、1Level条件下孵育7分钟。
3、向全部实验孔各加入酶抑制剂-64试剂溶液50μl；向主侧孔加入受血者血清50μl；向次侧孔加入供血者血清50μl，向阳性对照孔加入IgG抗-D血清50μl；向阴性对照加孔入AB血清50μl混合均匀。
4、将U实验多孔板移入自动温控振荡仪内，在38±0.5℃、300r/min、1Level条件下孵育7分钟。
5、将实验多孔板移入离心机，120×g离心1分钟。
6、将实验多孔板入自动温控振荡仪内，在1000r/min、2Level、1分钟工作条件下悬浮红细胞。
7、用扫描酶标仪—自动血型判读系统读取、记录实验结果。
8、阳性对照孔产生红细胞凝集，阴性对照孔未产生红细胞凝集，实验结果成立。主侧孔、次侧孔出现红细胞凝集为阳性实验结果，主侧孔、次侧孔未出现红细胞凝集为阴性实验结果。
采用间接抗人球蛋白输血相容性实验方法、与本发明的输血相容性实验方法为平行试验，在对1150例输血相容性实验中一致检定出2例阳性标本，无“假阴性”、“假阳性”实验结果。
对上述阳性标本采用采用室温盐水、37℃盐水、间接抗人球蛋白等血型抗体特异性鉴定实验方法，以及实施例6所述的抗体特异性鉴定实验方法，进行抗体特异性鉴定。实验检定结果一致确认，其中1例为IgG抗-E，1例为抗-K。
四、U型多孔板—微波—自动温控震荡仪方法
1、U型多孔板—自动温控震荡仪方法中的第1步。
2、将U型实验多孔板移入微波场，在功率强度360W，功率输出率30％的条件下，辐射孵育200秒钟。
3、U型多孔板—自动温控震荡仪方法的第3步。
4、将U型实验多孔板移入微波场，在功率强度360W，功率输出率30％的条件下，辐射孵育300秒钟。
5、U型多孔板—自动温控震荡仪方法中的第5步。
6.U型多孔板—自动温控震荡仪方法中的第6步。
7、U型多孔板—自动温控震荡仪方法中的第7步。
8、U型多孔板—自动温控震荡仪方法中的第8步。
采用间接抗人球蛋白输血相容性实验方法、U型多孔板—自动温控震荡仪输血相容性实验方法、与本发明的实验方法为平行试验，在对1150例输血相容性实验中一致检定出2例阳性标本，无“假阴性”、“假阳性”实验结果。
对上述阳性标本采用采用室温盐水、37℃盐水、间接抗人球蛋白等血型抗体特异性鉴定实验方法，以及实施例6所述的抗体特异性鉴定实验方法，进行抗体特异性鉴定。实验检定结果一致确认，其中1例为IgG抗-E，1例为抗-K。
实施例10低pH免疫球蛋白注射液的IgG-抗-A、抗-B检定实验
本实验对由药品供应商提供的低pH免疫球蛋白注射液进行免疫性抗-A、抗-B进行检定，提供了一种快速、安全的药品检验方法。
1、受检物溶液制备：吸取10ml原液，用5％磷酸氢二钠溶液调节pH至7.0，用生理盐水溶液稀释至20ml，制成受检标本溶液。取受检标本溶液，用倍比稀释方法制备1/1、1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64、1/128、1/256、1/512受检标本溶液倍比稀释液。
2、取24支试管，标记A1/1、A1/2、A1/4、A1/8、A1/16、A1/32、A1/64、A1/128、A1/256、A1/512作为受检A，A阳性对照、A阴性对照；B1/1、B1/2、B1/4、B1/8、B1/16、B1/32、B1/64、B1/128、B256、B1/512作为受检B，B阳性对照、B阴性对照，依次置试管架排列。
3、向A1/1-A阴性对照加入3％A型红细胞悬液50μl；向B1/1-B阴性对照加入3％B型红细胞悬液50μl；向每支试管加入木瓜凝乳蛋白酶试剂溶液50μl，混合均匀。
4、将试管移入37±0.5℃水浴孵育5分钟。
5、向全部试管各加入酶抑制剂-64试剂溶液50μl，向A1/1-A1/512加入与其标记数码相符合的受检标本倍比稀释液200μl，向A阳性对照加入IgG-抗-A血清50μl，向A阴性对照加入AB血清50μl；向B1/1-B1/512加入与其标记数码相符合的1/1-1/512受检标本倍比稀释液100μl，向B阳性对照加入IgG-抗-B血清50μl，向B阴性对照加入AB血清50μl，混合均匀。
6、将试管移入37±0.5℃水浴场孵育7分钟。
7、将试管移入离心机，120×g离心1分钟。
8、轻轻摇动试管，悬浮红细胞，肉眼观察实验检定结果。
9、阳性对照产生红细胞凝集，阴性对照不产生红细胞凝集，实验结果成立。受检A出现红细胞凝集为实验检定阳性结果，受检A未出现红细胞凝集为实检定阴性结果；受检B出现红细胞凝集为实验检定阳性结果，受检B未出现红细胞凝集为实检定阴性结果。以最高稀释倍数的受检标本对红细胞产生的最小凝集强度(1+)的倒数为被滴定的抗体的效价。
经与间接抗人球蛋白检定实验结果相比较，本发明实验检定方法准确率为100％，实验检定灵敏度高于间接抗人球蛋白检定实验1-2个数量级。