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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201410857508.3(22)申请日 2013.12.23201310717092.0 2013.12.23C07K 14/47(2006.01)A61K 39/00(2006.01)A61P 35/00(2006.01)(71)申请人 南方医科大学地址 510000 广东省广州市海珠区工业大道中 253 号珠江医院血科实验室(72)发明人 李玉华 周炜均(74)专利代理机构 北京市盈科律师事务所 11344代理人 马丽丽(54) 发明名称EPS8 抗肿瘤 CTL 表位肽及其应用(57) 摘要一种EPS8来源的抗肿瘤CTL表位肽，为。
2、九肽，其 序 列 为 ：d-Leu-Ala-Glu-Ser-Val-Ala-Asn-Val，其中，d 为 Gln 或 Tyr。本发明还公开了该表位肽在药物中的应用。本发明诱导的特异性 CTL均能分泌一定的IFN-，并对HLA-A*0201和EPS8表达阳性的 MCF-7 细胞以及负载 EPS8 的 T2A2 细胞均表现出一定的抗原特异性杀伤效应，制成的EPS8 表达阳性肿瘤的治疗性多肽疫苗，在肿瘤特异性免疫治疗领域有着巨大的开发应用潜力。(62)分案原申请数据(51)Int.Cl.(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书1页 说明书7页 附图5页(10)申请公布号 C。
3、N 104497125 A(43)申请公布日 2015.04.08CN 104497125 A1/1 页21.一种 EPS8 抗肿瘤 CTL 表位肽，为九肽，其序列为 ：d-Leu-Ala-Glu-Ser-Val-Ala-Asn-Val，其中，d 为 Gln 或 Tyr。2.根据权利要求 1 所述的 EPS8 抗肿瘤 CTL 表位肽，其特征在于 ：在 d 为 Gln 时，其序列为 ：Gln-Leu-Ala-Glu-Ser-Val-Ala-Asn-Val。3.根据权利要求 1 所述的 EPS8 抗肿瘤 CTL 表位肽，其特征在于 ：在 d 为 Tyr 时，其序列为 ：Tyr-Leu-Ala-Gl。
4、u-Ser-Val-Ala-Asn-Val。4.根据权利要求 1 所述的 EPS8 抗肿瘤 CTL 表位肽，其特征在于 ：采用固相合成法制备CTL 表位肽。5.权利要求 1 3 任意一项权利要求所述的 EPS8 抗肿瘤 CTL 表位肽在制备治疗肿瘤药物中的应用。权 利 要 求 书CN 104497125 A1/7 页3EPS8 抗肿瘤 CTL 表位肽及其应用0001 本申请是申请日为 2013 年 12 月 23 日、申请号为 201310717092.0、发明名称为EPS8 抗肿瘤 CTL 表位肽及其应用的中国发明专利申请的分案申请。技术领域0002 本发明属于生物化学领域中的多肽技术领域，。
5、具体涉及一种 EPS8 来源的抗肿瘤CTL 表位肽及其在制备治疗肿瘤药物中的应用。背景技术0003 恶性肿瘤是新世纪人类的第一杀手。手术、放疗及化疗等传统治疗方法对某些肿瘤尤其是晚期恶性肿瘤的治疗效果尚不理想。近年来，细胞毒性 T 淋巴细胞 (Cytotoxic T Lymphocyte,CTL) 在抑制肿瘤中的作用受到极大重视，如何有效激发 CTL 介导的特异性细胞免疫应答，发挥抗肿瘤效能，已经成为当今肿瘤治疗性多肽疫苗研制领域的一个重要课题。0004 肿瘤抗原的发现及其 CTL 表位的鉴定是肿瘤特异性免疫治疗以及肿瘤治疗性多肽疫苗研制的重要前提。表皮生长因子受体通路底物 No.8(Epid。
6、ermal Growth Factor Receptor pathway substrate No.8，EPS8)是表皮生长因子受体(EGFR)重要的激酶活性底物之一。近年研究显示，EPS8 在多种实体瘤 ( 如宫颈癌、结直肠癌、垂体瘤、口腔鳞癌、胰腺导管癌、乳腺癌、甲状腺癌、食管癌及恶性胶质瘤等)及血液系统肿瘤(如多发性骨髓瘤、急性髓系白血病、混合系白血病等 ) 的组织及细胞中表达异常升高，而在正常组织表达很低或无表达。进一步的研究显示，EPS8 通过调控细胞周期促进肿瘤细胞的增殖，通过参与细胞伪足的形成及与肌动蛋白的相互作用促进肿瘤细胞的转移，通过影响肿瘤细胞对化疗药物的耐受性与患者的预后。
7、相关 (Li Y*,Xue T,He Y,Du J.A novel oncoprotein Eps8:new target for anti-cancer therapy.Future Oncology.2013(Accepted)。此外，本课题组在前期的实验研究中发现，重组小鼠rmHis-Eps8蛋白疫苗可有效诱导荷4T1乳腺癌小鼠产生特异性抗肿瘤免疫应答，抑制小鼠体内肿瘤细胞的增殖，延长其生存时间，而对小鼠脑、心、肝、肾、小肠、附睾组织无明显的毒性作用。(He YJ,Zhou J,Li Y*,et al.Eps8vaccine exerts prophylactic antitumor e。
8、ffects in a murine model:a novel vaccine for breast carcinoma.Mol Med Rep.2013Aug ；8(2):662-8)。因此，EPS8 是肿瘤诊断和抗肿瘤治疗的新靶点，在肿瘤免疫治疗中具有巨大潜力。0005 免疫原性弱和免疫耐受极大地限制了天然 CTL 表位在肿瘤治疗性多肽疫苗中的应用，因此，有效提高天然 CTL 表位的免疫原性并打破机体的免疫耐受成为肿瘤治疗性多肽疫苗发展的关键。在众多肿瘤治疗性多肽疫苗的增强策略中，对天然 CTL 表位进行分子改造被认为是最行之有效的方法之一。由于 CTL 表位与主要组织相容性复合体 (M。
9、HC)- 类分子的结合是诱导 CTL 免疫应答的关键因素，而 CTL 表位与 MHC- 类分子结合的重要基础是锚定残基，因此，可通过改变锚定残基或其相邻位置的氨基酸残基以达到增强免疫原性而不影响特异性的目的。研究发现，在九肽 CTL 表位中，第二位及第九位为 HLA-A2.1 分说 明 书CN 104497125 A2/7 页4子的主要锚定位点，二位为 Leu 或 Met，九位为 Leu、Val 或 Ile，能将表位与 MHC 结合的能力提高 10 100 倍，而在一位引入 Tyr 则可依靠其侧链苯环的疏水作用以及酚羟基的氢键作用增强表位肽与 HLA 分子的相互作用。0006 本申请主要采用理。
10、论和实验相结合的方法，修饰并初步鉴定出与 MHC- 类分子具有强结合力并有效诱导抗肿瘤免疫应答的 EPS8 来源的候选 CTL 表位肽及其类似物。发明内容0007 本发明所要解决的一个技术问题是针对上述的技术现状而提供一种肿瘤抗原EPS8来源的HLA-A*0201限制性CTL表位，该表位能够以高亲和力结合HLA-A*0201分子，所形成的复合物稳定，能够诱导肽特异性的CTL免疫应答，表现为刺激肽特异性CTL分泌高水平的 IFN- 并对肿瘤细胞产生特异性杀伤效应。0008 本发明所要解决的另一个技术问题是针对上述的技术现状而提供一种在肿瘤原EPS8 来源的 HLA-A*0201 限制性 CTL 。
11、表位肽在制备治疗肿瘤药物中的应用。0009 本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为 ：0010 EPS8 抗肿瘤 CTL 表位肽，为九肽，其序列为 ：Trp-a-Gln-Asp-Met-Ile-Leu-Gln-Val，其中，a 为 Thr 或 Leu ；b-Leu-Asp-Asp-Ile-Glu-Phe-Phe-c，其中，b 为 Ile 或 Tyr，c 为Ile 或 Val ；Phe-Leu-Phe-Thr-Pro-Leu-Asn-Met-Val ；d-Leu-Ala-Glu-Ser-Val-Ala-Asn-Val，其中，d 为 Gln 或 Tyr。0011 当a为Thr时，序列为Trp-T。
12、hr-Gln-Asp-Met-Ile-Leu-Gln-Val(即WTQDMILQV，记为 EPS8-101) ；0012 当 a 为 Leu 时，序列为 Trp-Leu-Gln-Asp-Met-Ile-Leu-Gln-Val(WLQDMILQV，记为EPS8-101-2L) ；0013 当 b 为 Ile，c 为 Ile 时，序 列 为 Ile-Leu-Asp-Asp-Ile-Glu-Phe-Phe-Ile( 即ILDDIEFFI，记为 EPS8-276) ；0014 当 b 为 Ile，c 为 Val 时，序 列 为 Ile-Leu-Asp-Asp-Ile-Glu-Phe-Phe-Val( 。
13、即ILDDIEFFV，记为 EPS8-276-9V) ；0015 当 b 为 Tyr，c 为 Val 时，序 列 为 Tyr-Leu-Asp-Asp-Ile-Glu-Phe-Phe-Val( 即YLDDIEFFV，记为 EPS8-276-1Y9V) ；0016 Phe-Leu-Phe-Thr-Pro-Leu-Asn-Met-Val( 即 FLFTPLNMV，记为 EPS8-360) ；0017 当d为Gln时，序列为Gln-Leu-Ala-Glu-Ser-Val-Ala-Asn-Val(即QLAESVANV，记为 EPS8-455) ；0018 当d为Tyr时，序列为Tyr-Leu-Ala-G。
14、lu-Ser-Val-Ala-Asn-Val(即YLAESVANV，记为 EPS8-455-1Y)。0019 此外，本发明涵盖经过修饰的肽，其中替代或添加了一个、两个或更多个氨基酸而得到的序列，只要经过修饰的肽保留原始的 CTL 诱导能力。0020 所述肿瘤抗原 EPS8 来源的 HLA-A*0201 限制性 CTL 表位在制备肿瘤治疗性多肽疫苗中的应用。0021 其中，所述 EPS8 阳性肿瘤包括宫颈癌、结直肠癌、垂体瘤、口腔鳞癌、胰腺导管癌、乳腺癌、甲状腺癌、食管癌、恶性胶质瘤、多发性骨髓瘤、急性髓系白血病、混合系白血病等。说 明 书CN 104497125 A3/7 页50022 本发明。
15、的有益效果在于 ：本发明公开了来源于肿瘤抗原EPS8的天然CTL表位肽及模拟表位肽，该CTL表位能够肽能够诱导肽特异性的CTL免疫应答，表现为可刺激肽特异性CTL 分泌高水平 IFN- 并对 EPS8 阳性肿瘤细胞产生特异性杀伤效应 ；由于肿瘤抗原 EPS8广泛表达于不同类型的肿瘤组织中，因此，本发明的 CTL 表位肽可作为活性成分，和药学上课接受的载体组成组合物，或者，与其它具有药理活性的提取物和 / 或合成药物和药学上课接受的载体组成组合物，再按照药学领域的常规方法制备基于抗原 EPS8 的肿瘤疫苗，用于治疗和 / 或预防 EPS8 表达阳性的肿瘤，和 / 或预防其手术后复发，在肿瘤免疫治。
16、疗领域具有很好的应用前景。附图说明0023 图 1 为本发明表位肽诱导的特异性 CTL 分泌 IFN- 能力的检测结果 ；0024 图 2 为本发明表位肽诱导的特异性 CTL 对肿瘤细胞特异性杀伤效应的检测结果 ；0025 图 3 为本发明表位肽 EPS8-101 诱导的特异性 CTL 对肿瘤细胞特异性杀伤效应的HLA-A*0201 限制性检测结果 ；0026 图 4 为本发明表位肽 EPS8-276 诱导的特异性 CTL 对肿瘤细胞特异性杀伤效应的HLA-A*0201 限制性检测结果 ；0027 图 5 为本发明表位肽 EPS8-360 诱导的特异性 CTL 对肿瘤细胞特异性杀伤效应的HLA。
17、-A*0201 限制性检测结果 ；0028 图 6 为本发明表位肽 EPS8-455 诱导的特异性 CTL 对肿瘤细胞特异性杀伤效应的HLA-A*0201 限制性检测结果 ；0029 图 7 为本发明表位肽 EPS8-101-1Y 诱导的特异性 CTL 对肿瘤细胞特异性杀伤效应的 HLA-A*0201 限制性检测结果 ；0030 图 8 本发明表位肽为 EPS8-276-9V 诱导的特异性 CTL 对肿瘤细胞特异性杀伤效应的 HLA-A*0201 限制性检测结果 ；0031 图 9 为本发明表位肽 EPS8-276-1Y9V 诱导的特异性 CTL 对肿瘤细胞特异性杀伤效应的 HLA-A*020。
18、1 限制性检测结果 ；0032 图 10 为本发明表位肽 EPS8-455-1Y 诱导的特异性 CTL 对肿瘤细胞特异性杀伤效应的 HLA-A*0201 限制性检测结果 ；具体实施方式0033 为以下将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。0034 一、EPS8HLA-A*0201 限制性 CTL 表位的预测0035 1、生物学软件预测 CTL 表位0036 本发明所述的 EPS8 来源的抗肿瘤 CTL 表位肽类似物，是根据抗原的一级结构，采用免疫信息学手段，运动在线生物学软件 SYFPEITHI、BIMAS 和 NetMHC 3.2 对 EPS8 抗原结构的 HLA-A*0201 限。
19、制性进行预测分析，筛选 WTQDMILQV( 记为 EPS8-101)、ILDDIEFFI( 记为 EPS8-276)、FLFTPLNMV( 记 为 EPS8-360) 及 QLAESVANV( 记 为 EPS8-455) 作 为 候 选CTL表位肽，并根据HLA-A*0201限制性表位基序及其它位置上不同氨基酸残基对表位与 HLA-A*0201 分子亲和力的影响，对上述天然 CTL 表位的主要锚定残基或其相邻位置说 明 书CN 104497125 A4/7 页6的氨基酸残基进行替换，使 CTL 表位不包含不利于结合的氨基酸残基或有利于结合的氨基酸残基多余不利于结合的氨基酸残基，由此设计出 4。
20、 个模拟 CTL 表位：WLQDMILQV( 记为 EPS8-101-2L)、ILDDIEFFV( 记 为 EPS8-276-9V)、YLDDIEFFV( 记 为 EPS8-276-1Y9V) 和QLAESVANV( 记为 EPS8-455)。0037 二、候选模拟 CTL 表位的合成0038 候选模拟CTL表位委托杭州中肽生化有限公司采用标准Fmoc方案进行合成，并采用反相高效液相色谱法进行纯化和纯度分析，质谱法进行鉴定和分子量测定。结果显示，各候选模拟 CTL 表位的纯度均高于 95，分子量与理论值相符。0039 所得候选CTL表位肽用二甲基亚砜(DMSO)溶解制成储备液，置温度-70保存。
21、，临时前用磷酸盐缓冲液 (PBS) 稀释。固相合成步骤可参考现有的技术。0040 三、上述制备的 CTL 表位肽，可用于制备肿瘤治疗性多肽疫苗，其应用实验如下 ：0041 3.1、候选 CTL 表位肽与 HLA-A*0201 分子亲和力试验0042 (1)800rpm 离心收集 HLA-A2.1 表达阳性且缺失内源性抗原加工处理能力的 T2 细胞 (ATCC 公司 )，PBS 洗涤 3 次，无血清 RPMI-1640 培养基重悬细胞至细胞密度为 1106/ml，接种于 24 孔板 ；0043 (2) 每孔加入 CTL 表位肽、阳性对照肽 ( 流感基质蛋白 IMP58-66：GILGFVFTL)。
22、 或阴性对照肽(Idiotype98-106：AHTKDGFNF)至终浓度为50g/ml(内含2微球蛋白3g/ml)，37，5 CO2、饱和湿度条件下孵育 18h ；0044 (3) 冰 PBS 洗涤 3 次后，加入 FITC 标记的 HLA-A2.1 抗体，4避光孵育 30min ；0045 (4) 冰 PBS 洗涤 3 次后，流式细胞仪于波长 488nm 处测定平均荧光强度，并计算荧光系数 FI ：FI ( 样品平均荧光强度 - 背景平均荧光强度 )/ 背景平均荧光强度检测。FI 1.5 为高亲和力，1.0 FI 1.5 为中等亲和力，FI 1.0 为低亲和力。0046 结果 ：如表 1 。
23、所示，EPS8-276、EPS8-360 及 EPS8-455 表位肽与 HLA-A2.1 分子具有高亲和力，EPS8-101 表位肽具中等亲和力 ；且改造肽与 HLA-A2.1 分子的结合力均高于母体肽。0047 3.2、候选 CTL 表位肽 /HLA-A2.1 分子复合物稳定性分析0048 (1)800rpm 离心收集 T2A2 细胞，用冰 PBS 洗涤 3 次，无血清 RPMI 1640 培养基 ( 含100ng/ml 人 2 微球蛋白 ) 重悬至细胞密度为 1.0106/ml，接种于 24 孔培养板 ；0049 (2) 每孔加入 CTL 表位肽至终浓度为 100mol/ml，37、5 。
24、CO2及饱和湿度条件下孵育 18h ；0050 (3) 冰 PBS 洗涤细胞 4 次，除去未结合的游离肽 ；0051 (4) 每孔加入 Brefeldin A(BFA，Sigma 公司 ) 至终浓度为 10g/ml，37、5 CO2及饱和湿度条件下孵育 1h ；0052 (5) 冰 PBS 洗涤细胞 1 次 ；0053 (6) 加入含 0.5g/ml BFA 的无血清 1640 培养基，于 37、5 CO2及饱和湿度条件下分别孵育 0h、2h、4h、6h、8h ；0054 (7) 孵育结束后，冰 PBS 洗涤 3 次，加入 FITC 标记的 HLA-A2.1 抗体，4避光反应30min ；00。
25、55 (8) 冰 PBS 洗涤 3 次后，流式细胞仪于波长 488nm 处测定平均荧光强度。结果用表说 明 书CN 104497125 A5/7 页7位肽 /HLA-A2.1 分子复合物的半衰期 DC50 表示。0056 结果 ：如表 1 所示，8 条表位肽 /HLA-A2.1 复合物的半衰期均大于 6h。0057 表 1 表位肽与 HLA-A2.1 分子结合力及稳定性试验结果0058 天然表位肽 FI DC50/h 模拟表位肽 FI DC50/hEPS8-101 1.03 68 EPS8-101-2L 2.51 8EPS8-276 2.10 8 EPS8-276-9V 4.95 8EPS8-。
26、360 1.99 8 EPS8-276-1Y9V 4.54 8EPS8-455 2.07 8 EPS8-455-1Y 2.75 80059 3.3、CTL 表位肽诱导的特异性 CTL 分泌 IFN- 能力检测0060 1、效应细胞的制备0061 (1)常规聚蔗糖-泛影葡胺密度梯度法分离HLA-A*0201阳性健康志愿者的抗凝新鲜全血，获得外周血单个核细胞 (PBMC)，用含 10胎牛血清的 RPMI-1640 完全培养基调整细胞浓度为 1.0106/ml，接种于 24 孔板，每孔 1ml ；0062 (2)次日每组分别加入CTL表位肽至终浓度为10g/ml，同时设立PBS组(以PBS替代表位肽。
27、 ) 作为阴性对照组 ；0063 (3) 第三天每孔加入 IL-2 至终浓度为 50U/ml，每 2 3 天半量换液并补充 IL-2至终浓度为 50U/ml ；0064 (4) 分别于第七天、第十四天进行第二轮、第三轮荷肽刺激，即每组分别加入 CTL表位肽 /PBS 至终浓度为 10g/ml，次日加入 IL-2 至终浓度为 50U/ml ；0065 (5) 第三轮刺激后 3 天，得到效应细胞 CTL。0066 2、ELISPOT 实验 ：使用 Human IFN-gamma ELISPOT kit(ELISPOT 试剂盒，U-Cytech公司 ) 进行 IFN- 分泌的检测，主要步骤如下 ( 。
28、详见试剂盒说明书 ) ：0067 (1) 包被 ：0068 向 PVDF 板加入 70乙醇预湿，15l/ 孔 ；0069 加入去离子水洗涤 2 次，100l/ 孔 ；0070 加入 PBS 稀释好的包被抗体，50l/ 孔，4包被过夜 ；0071 (2) 封闭 ：0072 倾倒包被液 ；0073 PBS 洗涤 3 次，100l/ 孔，最后一次在灭菌的吸水纸上拍干 ；0074 加入稀释好的封闭液，200l/ 孔，37封闭 1h ；0075 (3) 细胞上样 ：0076 倾倒封闭液，PBS 洗涤一次，灭菌的吸水纸上拍干 ；0077 细胞上板 ：上述诱导的 CTL 作为效应细胞 (1105/ 孔 )，。
29、荷肽的 T2A2 细胞作为刺激细胞 (1105/ 孔 ) 铺板，100l/ 孔。设置正对照组 ：细胞浓度为 1105/ 孔，加入PHA 至终浓度为 1 4l/ml，该浓度能有效刺激 IFN- 的分泌 ；设置背景负对照组 ：加入说 明 书CN 104497125 A6/7 页8100l 含 10胎牛血清的 RPMI-1640 培养基 ；0078 加完所有样品后，盖上板盖，37，5 CO2，饱和湿度条件下孵育 18 24h ；0079 (4) 培养后操作 ：0080 低渗法裂解细胞 ：倾倒孔内细胞及培养基，加入冰冷的去离子水，200l/ 孔，4冰浴 10min ；0081 洗涤 ：倾倒孔内液体，加。
30、入稀释好的washing buffer洗涤57次，200l/孔，每次停留 30 60s，最后一次，在吸水纸上拍干 ；0082 检测抗体孵育 ：加入稀释好的生物素标记检测抗体，100l/ 孔，4孵育过夜 ；0083 洗涤：次日倾倒孔内液体，加入稀释好的washing buffer洗涤57次，200l/ 孔，每次停留 30 60s，最后一次，在吸水纸上拍干 ；0084 酶联亲和素孵育 ：加入稀释好的酶联亲和素工作液，100l/ 孔，37孵育 1h ；0085 洗涤 ：倾倒孔内液体，加入稀释好的 washing buffer 洗涤 5 次，200l/ 孔，每次停留 30 60s，最后一次，在吸水纸上。
31、拍干 ；0086 显色 ：加入配置好的 AEC 显色液，100l/ 孔，室温避光静置 15 30min ；0087 终止显色 ：倾倒孔内液体，去离子水洗涤 3 5 次，终止显色过程 ；0088 ELSPOT 图像分析仪计数每孔形成的斑点数。0089 结果 ：如图 1 所示，天然 CTL 表位肽 EPS8-101、EPS8-276、EPS8-360、EPS8-455 及其模拟表位肽 EPS8-101-2L、EPS8-276-9V、EPS8-276-1Y9V、EPS8-455-1Y 诱导的特异性 CTL分泌 IFN- 的能力明显高于阴性对照组 (P 0.001)。0090 3.4、CTL 表位肽诱。
32、导的特异性 CTL 对肿瘤细胞特异性杀伤效应的检测0091 (1) 实验分组 ：0092 效应细胞 ：分为 9 个样品大组 ：EPS8-101、EPS8-276、EPS8-360、EPS8-455 和EPS8-101-2L、EPS8-276-9V、EPS8-276-1Y9V、EPS8-455-1Y，分别以各表位肽诱导的特异性CTL 为效应细胞 ；0093 靶细胞 ：人乳腺癌细胞 MCF-7(HLA-A*0201 表达阳性、EPS8 表达阳性 )，荷肽T2A2 细胞 (HLA-A*0201 表达阳性、EPS8 表达阳性 )、T2 细胞 (HLA-A*0201 表达阳性，EPS8表达阴性 )009。
33、4 (2) 效应细胞制备 ：按照前述同样方法制备 CTL 表位肽诱导的特异性 CTL，用含5胎牛血清的 RPMI-1640 培养基调整至适当浓度，作为效应细胞。0095 (3)LDH 检测 ：使用 CytoTox Non-Radioactive Cytotoxicity Assay( 细胞毒性检测试剂盒，Promega 公司 ) 进行 LDH 试验检测细胞毒活性，主要步骤如下 ( 详见试剂盒说明书 ) ：0096 设立检测板 (100l/ 孔 )0097 设立实验组：以MCF-7、荷肽T2A2、T2A2细胞作为靶细胞(最优靶细胞数为5103/ 孔 )，按不同的效靶比 10:1、20:1、40:。
34、1 加入上述效应细胞 CTL，各种浓度细胞以50l/ 孔接种于 96 孔培养板中，终体积 100l ；0098 设立效应细胞自发释放组 ：各组效应细胞以 50l/ 孔加入 96 孔板，补充 50l含 5胎牛血清的 RPMI-1640 培养基至终体积 100l ；0099 设立靶细胞自发释放组 ：各组靶细胞以 50l/ 孔加入 96 孔板，补充 50l 含说 明 书CN 104497125 A7/7 页95胎牛血清的 RPMI-1640 培养基至终浓度 100l ；0100 设立靶细胞最大释放组 ：细胞上样同靶细胞自发释放组 ；0101 设立背景对照组 ：加入含 5胎牛血清的 RPMI-1640。
35、 培养基 100l ；0102 设立体积校正对照组 ：加入含 5胎牛血清的 RPMI-1640 培养基 100l ；0103 细胞裂解及收获上清0104 细胞铺板后，250g 离心 4min，37，5 CO2，饱和湿度条件下孵育 4h ；0105 收获上清前 45min，分别于靶细胞最大释放组和体积校正对照组加入裂解液(10)，10l/ 孔 ；0106 250g 离心 4min，收获上清 ；0107 LDH 检测0108 转移上清至另一 96 孔板，50l/ 孔 ；0109 迅速添加稀释的底物混合液，50l/ 孔，室温避光反应 30min ；0110 添加终止液终止显色反应，50l/ 孔 ；0。
36、111 取出孔中气泡，1h 内于酶标仪检测 490nm 吸光值 OD。0112 (4) 计算细胞杀伤率0113 杀伤率 ( ) ( 实验组 OD 值 - 效应细胞自发释放组 OD 值 - 靶细胞自发释放组OD 值 )/( 靶细胞最大释放组 OD 值 - 靶细胞自发释放组 OD 值 )1000114 ( 注 ：所有实验组、效应细胞自发释放组、靶细胞自发释放组的 OD 值均应减去背景平均吸收值 ；靶细胞最大释放组吸收值应减去体积校正对照组的平均吸收值 )0115 结果 ：如图 2 所示，天然 CTL 表位肽 EPS8-101、EPS8-276、EPS8-360、EPS8-455 及其模拟表位肽 E。
37、PS8-101-2L、EPS8-276-9V、EPS8-276-1Y9V、EPS8-455-1Y 对 HLA-A*0201 和EPS8 表达阳性的 MCF-7 细胞和负载 EPS8 的 T2A2 细胞均具有特异性杀伤作用，而对不表达 EPS8 只表达 HLA-A*0201 的 T2A2 细胞未见特异性杀伤作用。如图 3 至图 10 所示，用抗HLA-A2.1 抗体蜂蜜 MCF-7 细胞表面的 HLA-A2.1 分子或沉默 MCF-7 的 EPS8 表达后，各 EPS8抗肿瘤 CTL 表位肽诱导的特异性 CTL 在各效靶比对 MCF-7/A2Ab、MCF-7/EPS8- 细胞均未见特异性杀伤，表。
38、明其诱导的特异性 CTL 对 MCF-7 为抗原特异性、MHC 限制性杀伤。0116 基于上述实验结果，可得出如下结论 ：天然 CTL 表位肽 EPS8-101、EPS8-276、EPS8-360、EPS8-455 及 其 模 拟 表 位 肽 EPS8-101-2L、EPS8-276-9V、EPS8-276-1Y9V、EPS8-455-1Y 与 HLA-A*0201 分子具有很好的亲和力和结合稳定性，同时，其诱导的特异性CTL均能分泌一定的IFN-，并对HLA-A*0201和EPS8表达阳性的MCF-7细胞以及负载EPS8的 T2A2 细胞均表现出一定的抗原特异性杀伤效应 ；由于肿瘤抗原 EPS8 广泛表达于不同时期不同类型的肿瘤组织中，因此，本发明的EPS8抗肿瘤CTL表位可以作为活性成分，和药学上可接受的载体组成组合物，或者，与其它具有药理活性的提取物和 / 或合成药物和药学上可接受的载体组成组合物，再按照药学领域的常规方法制成 EPS8 表达阳性肿瘤的治疗性多肽疫苗，在肿瘤特异性免疫治疗领域有着巨大的开发应用潜力。说 明 书CN 104497125 A1/5 页10图1图2说 明 书 附 图CN 104497125 A。