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1、10申请公布号CN104083373A43申请公布日20141008CN104083373A21申请号201410320165722申请日20140708A61K31/513200601A61P11/0020060171申请人滨州医学院地址264003山东省烟台市莱山区观海路346号72发明人蒋王林纪云霞张亮吕长俊54发明名称洛匹那韦在制备预防或治疗急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征和肺纤维化的药物中的应用57摘要本发明提供了洛匹那韦的药物新用途，具体涉及洛匹那韦通过抑制I型肺泡上皮细胞凋亡，促进I型肺泡上皮细胞的糖基化终产物受体RECEPTORFORADVANCEDGLYCATIONENDPRO。
2、DUCTS，RAGE的表达从而抑制急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征ALI/ARDS和肺纤维化的发生发展，以致于预防或治疗ALI/ARDS和肺纤维化。在上述应用中，其使用剂量范围是100MG6000MG；优选2003000MG。51INTCL权利要求书1页说明书5页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书5页10申请公布号CN104083373ACN104083373A1/1页21本发明提供了洛匹那韦在制备预防或治疗急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征ALI/ARDS和肺纤维化的药物中的应用。2根据权利要求1所述的应用，洛匹那韦是通过抑制I型肺泡上皮细胞凋亡，增加I型肺泡上皮。
3、细胞糖基化终产物受体RECEPTORFORADVANCEDGLYCATIONENDPRODUCTS，RAGE表达到预防或治疗ALI/ARDS和肺纤维化的药物中的应用。3根据权利要求2所述的应用，洛匹那韦可预防或治疗ALI/ARDS。4根据权利要求2所述的应用，洛匹那韦预防或治疗肺纤维化。5根据权利要求3和4所述的应用，洛匹那韦用于ALI/ARDS和肺纤维化时，其使用剂量范围是100MG6000MG；优选2003000MG。6根据权利要求5所述的应用，洛匹那韦和药学上可接受的载体或辅料组成的药物，该药物可以以药学常规方法制备成片剂、胶囊剂，优选以片剂形式存在。权利要求书CN104083373A1。
4、/5页3洛匹那韦在制备预防或治疗急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征和肺纤维化的药物中的应用技术领域0001本发明涉及洛匹那韦抑制急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征ALI/ARDS和肺纤维化的发生发展从而预防或治疗ALI/ARDS和肺纤维化；具体涉及洛匹那韦通过抑制I型肺泡上皮细胞凋亡，促进I型肺泡上皮细胞的糖基化终产物受体RECEPTORFORADVANCEDGLYCATIONENDPRODUCTS，RAGE的表达，以致于预防或治疗ALI/ARDS和肺纤维化。背景技术0002急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征ALI/ARDS是一种常见危重症，病死率极高，严重威胁重症患者的生命并影响其生存质量。ALI/AR。
5、DS是在严重感染、休克、创伤及烧伤等非心源性疾病过程中，肺毛细血管内皮细胞和肺泡上皮细胞损伤造成弥漫性肺间质及肺泡水肿，导致的急性低氧性呼吸功能不全或衰竭，以肺容积减少，肺顺应性降低，严重的通气/血流比例失调为病理生理特征。临床表现为进行性低氧血症和呼吸窘迫，肺部影像学表现为非均一性的渗出性病变。目前ARDS的病死率较高，文献报道ARDS患者的病死率在50左右中华医学会重症医学分会急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征诊断和治疗指南中国危重病急救医学2006；1812706710。肺泡I型上皮细胞又称膜性肺泡细胞，是肺泡上皮中最多的细胞，其形态扁平，细胞核呈扁圆形，略向肺泡腔突出。I型肺泡上皮细胞几乎。
6、覆盖着全部肺泡腔，与邻近的毛细血管壁紧密相贴，是进行气体交换的基本场所。在ALI/ARDS中，I型肺泡上皮细胞发生明显凋亡，增加无效的上皮化由于I型肺泡上皮细胞无增殖能力，即死亡的I型肺泡上皮细胞的位置由增殖的II型肺泡上皮细胞填补，使肺泡壁受损，影响通气。糖基化终产物受体RECEPTORFORADVANCEDGLYCATIONENDPRODUCTS，RAGE在I型肺泡上皮细胞高表达，抑制RAGE的降低可减少肺的炎症反应，减轻肺实质性损伤ZHANGH，TASAKAS，SHIRAISHIYROLEOFSOLUBLERECEPTORFORADVANCEDGLYCATIONENDPRODUCTSON。
7、ENDOTOXININDUCEDLUNGINJURYAMJRESPIRCRITCAREMED2008；178356362。0003特发性肺纤维化IDIOPATHICPULMONARYBROSIS，IPF又称为隐源性致纤维化性肺泡炎CRYPTOGENICBROSINGALVEOLITIS，CFA，是一种慢性炎症性间质性疾病，以普通型间质性肺炎USUALINTERSTITIALPNEUMONIA，UIP为特征性病理改变且病因不明。主要表现为成纤维细胞灶BROBLASTICFOCI的出现致大量细胞外基质EXTRACELLULARMATRIX，ECM沉，胶原积聚，肺泡结构破坏，最终导致正常肺组织结构的。
8、破坏，是一种慢性、进行性、不可逆转也是最常见的一种致命性肺疾病KINGTJ，PARDOA，SELMANMIDIOPATHICPULMONARYFIBROSISJLANCET，2011，378980719491961。临床表现为进行性呼吸困难并伴有刺激性干咳，肺功能为限制性通气障碍，病情一般持续恶化，最终因呼吸衰竭而死亡。流行病学研究显示，IPF发病率呈不断上升趋势，目前约为163/100,000，且3年内急性恶化发生率为207NAVARATNAMV，FLEMINGKM，WESTJETALTHERISINGINCIDENCEOFIDIOPATHICPULMONARYBROSISINTHEUKJ说。
9、明书CN104083373A2/5页4THORAX，2011，666462467；SONGJW，HONGSB，LIMCMETALACUTEEXACERBATIONOFIDIOPATHICPULMONARYBROSISINCIDENCE，RISKFACTORSANDOUTCOMEJEURRESPIRJ，2011，372356363。已知肺纤维化主要是肺组织受损后修复调节失控、重建异常所引起的病变，在这过程中，一系列细胞因子和生长因子等表达异常、炎症反应参与肺纤维化的发病过程。由此造成上皮细胞缺损、成纤维细胞增生和ECM积聚等主要病变，最终结果是成纤维细胞替代了行使正常功能的肺泡上皮细胞ALVEO。
10、LAREPITHELIALCELLS，AECS，导致了纤维化的发生。0004临床上洛匹那韦与利托那韦合用商品名克力芝用于HIV/AIDS感染的治疗，亦可与其它抗逆转录病毒药物联用于成人和6个月以上儿童的HIV感染治疗，但洛匹那韦在预防或治疗ALI/ARDS和肺纤维化的药理作用未见报道。本发明人通过大量的研究发现洛匹那韦可以通过抑制I型肺泡上皮细胞的凋亡，增加I型肺泡上皮细胞的RAGE表达从而在预防或治疗ALI/ARDS和肺纤维化方面有明显的作用。基于此，本发明人发明了洛匹那韦通过抑制I型肺泡上皮细胞的凋亡，增加I型肺泡上皮细胞的RAGE表达从而抑制ALI/ARDS和肺纤维化的发生发展，以致于预。
11、防或治疗ALI/ARDS和肺纤维化。发明内容0005本发明提供了洛匹那韦在制备预防或治疗ALI/ARDS和肺纤维化的药物中的应用。0006本发明提供了洛匹那韦在制备预防或治疗ALI/ARDS的药物中的应用。0007本发明提供了洛匹那韦在制备预防或治疗肺纤维化的药物中的应用。0008本发明提供了洛匹那韦在抑制急慢性肺损伤中I型肺泡上皮细胞凋亡的药物中的应用。0009本发明提供了洛匹那韦在增加急慢性肺损伤中I型肺泡上皮细胞RAGE表达的药物中的应用。0010本发明还提供的洛匹那韦可以和药学上可接受的载体或辅料组成的药物，该药物可以以药学常规方法制备成片剂、胶囊剂，优选以片剂形式存在。0011发明提。
12、供的洛匹那韦在用于ALI/ARDS和肺纤维化时，其使用剂量范围是100MG6000MG；优选2003000MG。具体实施方式0012实施例1洛匹那韦片剂制备0013称取1200G洛匹那韦、和800G羧甲基淀粉钠充分混合均匀后过100目筛，加入适量的3PVPK30水溶液适量制软材，20目筛制粒，60干燥3小时，18目筛整粒，加入20G硬脂酸镁，混合均匀后压片，调节片重约200MG，即得。0014具体实施例0015试验例1洛匹那韦对人I型肺泡上皮细胞细胞株凋亡和RAGE表达的影响001611实验材料0017DMEM培养基为GIBCO公司产品，新生牛血清为杭州四季青公司产品0018TGF1购自PEP。
13、ROTECH公司，人I型肺泡上皮细胞细胞株ATI购自中国典型说明书CN104083373A3/5页5培养物保藏中心，用含10胎牛血清HYCLONE公司的低糖DMEM培养基GIBCO公司，常规培养于5的CO2，37人工培养箱中，细胞呈贴壁生长。0019RAGE一抗购买于SIGMA公司。0020洛匹那韦纯度995，购买于上海翰香生物科技有限公司002112试验方法0022当细胞生长融合至7080，用无血清培养基饥饿24H，换新鲜培养液，洛匹那韦以DMSO溶解，以培养基稀释成相应浓度。将传代的ATI细胞分为2部分，均包括1阴性对照组；2TGF1处理组3G/L作用时间24H；3TGF1处理组3G/L作。
14、用时间24H洛匹那韦022M；4TGF1处理组3G/L作用时间24H洛匹那韦067M；5TGF1处理组3G/L作用时间24H洛匹那韦2M；6TGF1处理组3G/L作用时间24H洛匹那韦6M。第一部分培养的细胞以流式细胞仪测定细胞凋亡，第一部分培养的细胞细胞裂解，BCA蛋白测定试剂盒PIERCE公司测定蛋白浓度后，取50G样品蛋白进行10的十二烷基磺酸钠2聚丙烯酰胺SDSPAGE凝胶变性电泳、然后转至聚偏二氟乙烯PVDF膜，加入RAGE一抗，ACTIN作内参，WESTERNBLOT检测细胞RAGE蛋白的表达。以TGF1未刺激组作为对照，计为相应蛋白的100，分析各浓度药物与单纯TGF1刺激组对R。
15、AGE蛋白的表达差异。组间进行T检验。0023表1洛匹那韦对TGF1刺激ATI细胞的凋亡和RAGE表达影响N500240025，P005，P001，与单纯TGF1刺激组比较0026表1结果可以看出，TGF1刺激ATI细胞24小时，ATI细胞凋亡明显增加，而RAGE表达明显下降，而加洛匹那韦0226M后24小时，ATI细胞凋亡明显下降，而RAGE表达明显上升。说明洛匹那韦可抑制ATI细胞凋亡，减轻急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征中因ATI细胞的耗竭导致的损伤。0027实验例2洛匹那韦对盲肠结扎穿孔导致的急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征ALI/ARDS模型大鼠的影响002821药品与试剂0029洛匹那。
16、韦纯度995，购买于上海翰香生物科技有限公司0030鲎试剂试剂盒福建省福州新北生化工业有限公司，批号0804300031ANTIAQUAPORIN5抗体ABCAM公司，AB1047510032RAGE一抗购买于SIGMA公司。0033实验动物SPF级SPRAGUEDAWLEY大鼠，雄性，体重150G200G，山东绿叶制药股份说明书CN104083373A4/5页6有限公司实验动物中心提供，动物合格证号为SYXK鲁20030020。003422实验方法与结果0035221盲肠结扎穿孔CLP大鼠的制备0036手术当天清晨大鼠禁食，乙醚麻醉后取仰卧位，75乙醇消毒腹部，沿腹白线中段作一长15CM的切。
17、口，剪开皮肤和肌层，探查腹腔分离盲肠；1号丝线距盲端1CM处回盲瓣远端结扎，16号穿刺针在结扎处远端贯穿盲肠3次呈三角形，针孔间距约3MM，并挤出少许内容物；盲肠回纳腹腔，逐层缝合关闭腹腔。0037222分组给药0038CLP大鼠50只，随机分为5组，即模型组、洛匹那韦灌胃给药10MG/KG，20MG/KG、300、600MG/KG组。另外取10只正常大鼠作为对照组。CLP手术1小时各组给予相应药物。CLP手术24小时取血，测定血清内毒素，血清内毒使用素鲎试剂试剂盒测定。取肺，称重，测定肺系数，取新鲜一叶肺，均浆，BCA蛋白测定试剂盒PIERCE公司测定蛋白浓度后，取50G样品蛋白进行10的十。
18、二烷基磺酸钠2聚丙烯酰胺SDSPAGE凝胶变性电泳、然后转至聚偏二氟乙烯PVDF膜，加入RAGE一抗，ACTIN作内参，WESTERNBLOT检测细胞RAGE蛋白的表达。另外取一叶肺，制备病理片，行AQUAPORIN5I型肺泡上皮细胞的特征标志免疫组化染色，200倍光镜拍照，计算每个视野下AQUAPORIN5阳性细胞数，以正常组的AQUAPORIN5阳性细胞数计为100，比较各给药组与模型组的差异。组间进行T检验。0039223实验结果0040表2结果显示洛匹那韦灌胃给药10MG/KG，20MG/KG、300MG/KG、600MG/KG组明显降低ALI/ARDS大鼠血清内毒素水平，抑制肺组织R。
19、AGE表达下降，抑制AQUAPORIN5阳性细胞数量下降P005或P001。洛匹那韦300MG/KG组抑制ALI/ARDS大鼠血清内毒素升高，抑制肺组织RAGE表达下降，抑制AQUAPORIN5阳性细胞数量下降水平与洛匹那韦600MG/KG组比较无显著性差异。0041表2洛匹那韦给药对盲肠结扎穿孔导致的ATI/ARDS大鼠的影晌N600420043，P005，P001，与模型组比较0044试验例3洛匹那韦对博莱霉素BLM诱导的肺纤维化模型大鼠的影响004531实验材料0046博莱霉素购于上海拜力生物科技有限公司0047羟脯氨酸检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所0048实验动物SPF级SPRA。
20、GUEDAWLEY大鼠，雄性，体重150G200G，山东绿叶制药股份有限公司实验动物中心提供，动物合格证号为SYXK鲁20030020。说明书CN104083373A5/5页70049洛匹那韦纯度995，购买于上海翰香生物科技有限公司005032试验方法005150只大鼠，10水合氯醛麻醉350MG/KG，IP，采用支气管内注射博莱霉素5MG/KG诱导肺纤维化模型。造模型21天后分组，分为模型组、洛匹那韦灌胃给药10MG/KG、洛匹那韦灌胃给药20MG/KG、洛匹那韦灌胃给药300MG/KG、洛匹那韦灌胃给药组600MG/KG，连续给药3周。处死动物，取肺，称重，计算肺指数，形态学改变分级肺泡。
21、炎和肺纤维化分级按文献SZAPIELSV，ELSONNA，FULMURJDBLEOMYCININDUCEDINTERSTITIALPULMONARYDISEASEINTHENUDE，ATHYMICMOUSEJAMREVRESPIRDIS，1979，120893899，将肺泡炎和肺纤维化的程度分为4级0级无明显改变；1级轻度改变，病变范围小于全肺的20；2级中度改变，病变范围占全肺的2050；3级重度改变，病变范围占全肺的50以上。测定体重和肺重量，计算肺指数，取肺，水解，测定肺组织羟脯氨酸含量。0052表3洛匹那韦对博莱霉素BLM诱导的肺纤维化模形大鼠的影响00530054，P005，P001，与模型组比较。0055表3结果显示洛匹那韦灌胃给药10、20、300和600MG/KG连续给药3周可以明显降低肺指数，降低纤维化分级，降低肺组织羟脯氨酸含量，说明洛匹那韦灌胃给药可抑制肺纤维化的发生发展。说明书CN104083373A。