活C－KIT表达细胞的分离工具.pdf

本发明为分离c－kit表达细胞提供了一个工具。该工具由c－kit质粒靶向载体组成，该载体能够整合到野生型c－kit等位基因上，并编码包含核仁定位信号，如TCOF－12、RLP313、RPS254或Fxr2h5的嵌合荧光蛋白。所述的构建体产生一个能够定位于活组织中的、浓缩的、亮荧光信号，该信号在组织解离后也存在。该构建体使得能够使用共聚焦显微镜进行观察，并使得能够利用流式细胞仪对解离的细胞进行自动细胞分选。

1.  能够整合到野生型c-kit等位基因中的c-kit质粒靶向载体，所述载体的特征是编码包含核仁定位信号的嵌合荧光蛋白。

2.  权利要求1的c-kit质粒靶向载体，其中核仁定位信号选自TCOF-1、RLP31、RPS25和Fxr2h。

3.  权利要求1的c-kit质粒靶向载体，其中核仁定位信号由RLP31组成。

4.  权利要求1的c-kit质粒靶向载体，其中荧光蛋白选自EGFP、EYFP、EBFP、ZsGreen1、ZsYellow1、DsRed、AmCyan、AsRed。

5.  权利要求1的c-kit质粒靶向载体，其中荧光蛋白由ZsGreen1组成。

6.  权利要求1的c-kit质粒靶向载体，其包含SEQ ID No.1。

7.  一种细胞，它被权利要求1～6任意一项的c-kit质粒靶向载体转染。

8.  根据权利要求7的细胞，其中所述细胞是哺乳动物细胞。

9.  根据权利要求8的细胞，其中所述细胞能够在适当的培养基中连续生长。

10.  根据权利要求9的细胞，其中所述细胞选自COS-7、colon26。

11.  根据权利要求9或10的细胞，其中所述细胞由COS-7组成。

12.  一种转基因非人类动物，其包含权利要求1～6任意一项的c-kit质粒靶向载体。

13.  从权利要求12中的转基因动物分离c-kit表达细胞的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)解离包含c-kit表达细胞的组织；和
(b)从所述解离组织中分离包含c-kit质粒靶向载体的荧光标记细胞。

14.  根据权利要求13的方法，其中使用细胞分选仪进行分离步骤。

15.  根据权利要求14的方法，其中细胞分选仪是流式细胞仪。

16.  根据权利要求13的方法，其中包含c-kit表达细胞的组织选自Cajal间质细胞、造血干细胞、上皮细胞和内分泌细胞，如朗氏岛的细胞、肾上腺髓质细胞、甲状腺细胞、松果体细胞和垂体细胞。

17.  根据权利要求16的方法，其中包含c-kit表达细胞的组织由Cajal间质细胞组成。

18.  一种c-kit表达细胞，其可根据权利要求13～17任意一项的方法获得。

19.  根据权利要求18的c-kit表达细胞，其用于建立原代细胞系。

20.  鉴定参与慢波形成的潜在药物靶的方法，所述方法包括用靶特异基因沉默手段对可根据权利要求17的方法获得的Cajal间质细胞进行处理，测定所述基因沉默手段对所述细胞形成慢波的影响。

21.  根据权利要求20的方法，其中基因沉默手段包括使用反义序列或短干扰RNA(siRNA)。

22.  根据权利要求20的方法，其中的Cajal间质细胞分离自c-kit/无限增殖转基因。

23.  根据权利要求20的方法，其中基因沉默手段由靶特异的siRNA组成。

24.  筛选调节Cajal间质细胞(ICC)中慢波形成的化合物的方法，所述方法包括使可根据权利要求17的方法获得的ICC和受试化合物相接触，测定所述化合物对所述细胞形成慢波的影响。

25.  根据权利要求24的方法，其中使用离子灵敏性荧光染料和荧光测定仪和荧光成像技术测定慢波的形成。

26.  根据权利要求25的方法，其中离子灵敏性荧光染料是钙离子灵敏性染料，优选地选自fluo-3、fluo-4、fluo-5N和fura red。

27.  根据权利要求25的方法，其中荧光成像技术由荧光成像板读数仪(FLIPR)组成。

活c-kit表达细胞的分离工具
本发明为分离c-kit表达细胞提供了一种工具。c-kit促癌基因(proto-oncogene)编码Kit。Kit是干细胞因子(SCF)的膜受体酪氨酸激酶，经鉴定它是许多细胞的特异性标记物¹，这些细胞包括Cajal间质细胞(ICC)、造血干细胞、上皮细胞和内分泌细胞，如朗氏岛的细胞、肾上腺髓质细胞、甲状腺细胞、松果体细胞和垂体细胞。
虽然Kit定位于细胞膜上，但由于在解离过程中膜蛋白丢失，难以进行c-kit表达细胞的成功分离。利用c-kit特异性抗体的常规技术，如免疫荧光法或免疫组化法评价分离细胞的c-kit表达特征，其结果是失败的。
本发明通过提供c-kit质粒靶向载体解决了本领域的这一问题，其中c-kit质粒靶向载体能够整合到野生型c-kit等位基因上，并编码包含核仁定位信号，如TCOF-1²、RLP31³、RPS25⁴或Fxr2h⁵的嵌合荧光蛋白。所述的构建体产生一个能够定位于活组织中的、浓缩的、亮荧光信号，该信号在组织解离后也存在。该构建体使得能够使用共聚焦显微镜进行观察，并使得能够利用流式细胞仪对解离的细胞进行自动细胞分选。
相应地，c-kit质粒靶向载体可用于产生一种转基因动物模型，该模型在内源c-kit启动子的控制下表达上述的嵌合荧光蛋白，从而使嵌合荧光蛋白在所述的转基因动物中特异性地标记c-kit表达细胞。可以将后者分离，建立c-kit表达细胞系，如ICC细胞系或造血干细胞系。
因此本发明的另一个目标是提供包含上述c-kit质粒靶向载体的转基因动物和c-kit表达细胞系。
参照下面的实验细节可以更好地理解本发明，本领域的熟练技术人员会明白：这些实验细节仅是本发明的示例，其后的权利要求书中会更全面地加以描述，另外，在整篇申请文本中引用了各种出版物。这些出版物的内容在申请文本中引用作为参考，以更全面地描述本发明所属领域的状态。
附图简述
图1：编码嵌合荧光蛋白的四个构建体图谱，其中嵌合荧光蛋白位于c-kit启动子控制下，包含核仁定位信号。
图2：pZsGreen-N1-c-kit-RLP31构建体序列
图3：在基因组c-kit毗邻序列群(contig)(KOS)中插入Sfi位点，使得中间载体pKI中的SfiI序列盒在酵母中通过同源重组交换到KOS基因组克隆中；URA＝尿嘧啶。
图4：KOS克隆pKOS.12和pKOS.65组装成完整的基因组c-kit克隆pKOS.11。
图5：c-kit gDNA毗邻序列群(26567bp)和插入了图3中PKI构建体的c-kit gDNA毗邻序列群(30072bp)。
发明详述
本发明为分离c-kit表达细胞提供了一个工具。该工具由一个核酸载体组成，能够指导表达的嵌合荧光蛋白进入c-kit表达细胞的核仁中，其中嵌合荧光蛋白特征是：嵌合蛋白包含一个核仁定位信号，并位于c-kit表达细胞中c-kit启动子的控制下。
这里所用的“嵌合蛋白”通常指融合蛋白，该融合蛋白由两个或多个蛋白质的全部或部分氨基酸序列组成，通过使用已知技术将蛋白质编码基因融合在一起而形成。在本发明中，嵌合蛋白由功能性核仁定位信号和荧光蛋白融合而成。举例来说，荧光蛋白选自EGFP、EYFP、EBFP、ZsGreen1、ZsYellow1、DsRED、AmCyan、AsRed，优选由ZsGreen1组成。举例来说，核仁定位信号选自TCOF-1、RLP31、RPS25和Fxr2h，优选由RLP31组成。
相应地，该构建体或载体能够产生表达嵌合荧光蛋白的非人类的动物细胞，其中所述嵌合荧光蛋白的表达位于c-kit启动子的控制之下。
在本发明的一个实施方案中，核酸载体进一包含促进载体向非人类动物细胞的基因组中整合的序列，以抑制所述动物c-kit蛋白的功能性表达，促进嵌合荧光蛋白的表达。因此本发明的一个目的是提供一个核酸载体，该核酸载体包括a)编码嵌合荧光蛋白的核酸序列；和b)促进载体整合到非人类动物基因组中的序列，以抑制所述动物c-kit蛋白的功能性表达，促进嵌合荧光蛋白的表达。
相应地，本发明提供了能够整合到野生型c-kit等位基因的c-kit质粒靶向载体，所述的载体编码包含核仁定位信号的嵌合荧光蛋白。在所述的发明中，核仁定位信号优选自TCOF-1、RLP31、RPS25和Fxr2h，更为优选的是，所述的核仁定位信号由RLP31组成。嵌合荧光蛋白分子进一编码荧光蛋白，所述的荧光蛋白选自任何商业来源的荧光蛋白，例如EGFP、EYFP、EBFP、ZsGreen1、ZsYellow1、DsRed、AmCyan或AsRed。在一个具体的实施方案中，荧光蛋白由ZsGreen1组成。
在一个优选的实施方案中，本发明的载体包含SEQ ID No.2，特别包含SEQ ID No.1，更优选由SEQ ID No.1组成。其中SEQ ID No.2由能够促进向非人类动物基因组中整合的多聚核苷酸序列组成，以抑制所述动物c-kit蛋白的功能性表达，促进和编码嵌合荧光蛋白的多聚核苷酸序列可操作性相连的嵌合荧光蛋白的表达。(Seq Id No2：cagagtctagcgcagccaccgcgatgagaggcgctcgcggcgcctgggatctgctctgcgtcctgttggtcctgctccgtgaattccgcttgtccagaaaacgtaaggatccaccggtcgccaccatggcccagtccaagcacggcctgaccaaggagatgaccatgaagtaccgcatggagggctgcgtggacggccacaagttcgtgatcaccggcgagggcatcggctaccccttcaagggcaagcaggccatcaacctgtgcgtggtggagggcggccccttgcccttcgccgaggacatcttgtccgccgccttcatgtacggcaaccgcgtgttcaccgagtacccccaggacatcgtcgactacttcaagaactcctgccccgccggctacacctgggaccgctccttcctgttcgaggacggcgccgtgtgcatctgcaacgccgacatcaccgtgagcgtggaggagaactgcatgtaccacgagtccaagttctacggcgtgaacttccccgccgacggccccgtgatgaagaagatgaccgacaactgggagccctcctgcgagaagatcatccccgtgcccaagcagggcatcttgaagggcgacgtgagcatgtacctgctgctgaaggacggtggccgcttgcgctgccagttcgacaccgtgtacaaggccaagtccgtgccccgcaagatgcccgactggcacttcatccagcacaagctgacccgcgaggaccgcagcgacgccaagaaccagaagtggcacctgaccgagcacgccatcgcctccggctccgccttgccctgagc)
编码嵌合荧光蛋白的序列优选是cDNA序列，该序列中核仁定位信号序列和编码荧光蛋白的核酸序列可操作性相连接，其中本发明中使用的核仁定位信号序列(NoLs)选自表2中所列序列，即RLP31(参见图1)、RPS25、Fxr2h和TCOF-1。为了获得嵌合荧光蛋白，将所述序列中的一个序列连接到编码荧光蛋白的商业来源载体上，例如购自Clontech的pZsGreen1、pZsYellow1或pDsRed。
本发明的载体可以转化到适当的宿主细胞中，宿主细胞优选真核细胞，自身用于转化非人类动物。因此，本发明的另一个方面提供了一种制备嵌合荧光蛋白的方法，该方法包括在一定条件下培养转化或转染有本发明载体的宿主细胞，提供载体表达的所述蛋白质，并回收表达的蛋白质。优选的是，宿主细胞是非人类动物细胞，优选哺乳动物细胞，更优选非人类动物地胚细胞。
相应地，本发明的一个进一步的实施方案提供了转染有本发明c-kit质粒靶向载体的细胞。其中所述的细胞是一种真核细胞，特别是能够在适当的培养基中连续培养的细胞，优选哺乳动物细胞，所述细胞从包含敲入了本发明载体的转基因动物分离，或者所述细胞选自COS-7或Colon26，更优选为COS-7细胞。
如下文更详细加以讨论的，可以使用本领域中在动物中操纵基因表达的已知方法，如使用Cre/Lox系统(使用Cre/Lox系统将可诱导基因靶向小鼠，酶学方法指南，14，381-392(1998)和最近如SigridW.et al.，1999 BioTechniques 26：1150-1160所述从λKOS基因组文库中建立的基因靶向载体，将本发明的载体靶向到小鼠的相应c-kit序列上。在后面的实施例中提供了该方法。该方法采用酵母同源重组机器来简化敲入载体的构建过程。
在本发明的一个具体实施方案中，促进载体向非人类动物基因组中整合的序列包括和动物的c-kit序列或其旁侧序列相比具有足够同源性的核苷酸序列，该同源性优选为95％，更优选为98％，最优选为100％，以进行同源重组和随后载体向所述动物基因组的插入，插入位置能够破坏编码区，进而内源c-kit的表达有利于所述载体中序列所编码的嵌合荧光蛋白。
通过Sambrook et al.，分子克隆：实验指南，冷泉港实验室出版社中所述的、本领域的熟练技术人员所熟知的方法，将核酸序列加到本发明的载体中，用于随后的转化和向所述宿主细胞基因组或非人类动物基因组中的整合。在一个具体的实施方案中，核酸序列SEQ IDNo.2最先克隆到中间载体pKI上(参见图3)，所述的载体包括旁侧有两个SfiI位点的剪接受体/剪接供体序列盒和一个诸如PGK Neo标记之类的floxed选择标记。该中间载体上剪接受体/剪接供体序列盒随即交换为旁侧有SfiI的酵母标记URA，在酵母中通过同源重组导入包含c-kit基因的KOS基因组克隆。在包含Prm-CRE转基因的ES细胞中进行c-kit基因的最终靶向。在该ES细胞系中，精子发生Cre的表达受控于鱼精蛋白启动子。因此，当饲养产生于ES细胞系的嵌合小鼠时，靶等位基因传经雄性胚系，旁侧带有loxP位点的Neo序列盒切除，从而使Neo标记在嵌合体的饲养过程中切除。
可以通过转染或其他诸如电穿孔之类的适当技术将载体导入。在本发明中，通过电穿孔法将载体导入胚胎干细胞，完成外源DNA向动物基因组中的导入。基因组中通过同源重组插入了外源DNA的细胞随即注射到胚泡中，产生具有所需表型的转基因动物。通过人们所熟知的技术鉴定包含本发明载体的成功转化细胞，比如裂解细胞，通过Southern印迹法或使用聚合酶链式反应对DNA进行验证。
举例来说，载体可以是质粒、病毒、粘粒或噬菌体载体，可以含有一个或多个选择标记，如新霉素或潮霉素标记基因。
本发明还有利地提供了由本发明的核酸中至少约10个连续核苷酸组成的核酸序列，优选10至50个核苷酸，核酸序列包含如表1所示的序列。这些序列可以有利地用作探针或启动复制的引物等。可以根据本领域人员所熟知的技术产生这种核酸序列。这些序列还可用于诊断试剂盒等，检测本发明中核酸的存在与否。这些实验通常包括在杂交条件下将探针和样品相接触，检测是否存在探针和样品中任意核酸之间所形成的二聚体或三聚体。
根据本发明的这一方面，探针可以锚定在固体支持物上，优选的是，它们存在于芯片上，使多个探针可以同时和单一的生物样品杂交。探针可以点在芯片上，或在芯片上原位合成。(参见Lockhart et al.，Nature Biotechnology，vol.14，December 1996“通过和高密度寡核苷酸芯片杂交进行表达监测”。一个芯片可以包含处于离散位置上的多于100、500、甚至1000个的不同探针。
可以使用重组手段或合成手段来生成本发明中的核酸序列，例如使用PCR克隆机制，该克隆机制通常涉及：制备引物对，这些引物可以是所要克隆的基因区域中的约10个至50个核苷酸；将引物和来源于人细胞的mRNA、cDNA或基因组DNA相接触；在能够导致所需区域扩增的条件下进行聚合酶链式反应；分离扩增区域或片段，回收扩增的DNA。通常来说，这些技术都是本领域人员所熟知的，如Sambrook等所述(分子克隆：实验指南，1989)。
本发明的核酸或寡核苷酸可以携带一个展现标记。适当的标记包括诸如³²p或³⁵S之类的同位素标记，酶标记或诸如生物素或荧光标记之类的其他蛋白质标记。这些标记可以加到本发明的核酸或核苷酸上，使用上文的已知技术进行检测。
根据本发明，特定的核酸不仅包括相同的核酸，还包括任意碱基突变，这些碱基突变尤其包括一种替换，这种替换由于保守氨基酸替换中的兼并密码，导致产生同义密码子(编码同一氨基酸残基的不同密码子)。术语“核酸序列”还包括和具有碱基突变的任意单链序列互补的序列。
本发明的进一步方面包括获得转基因非人类动物的方法，其中转基因非人类动物在c-kit表达细胞中表达嵌合荧光蛋白，该方法包括以下步骤：
(a)将本发明中的核酸载体导入所述动物的胚细胞中；(b)将步骤(a)获得的胚导入雌性动物；(c)饲养步骤(b)中的雌性动物，直至胚发育成熟，从雌性动物体内出生；和(d)饲养转基因动物。
优选的是，根据本发明方法使用的非人类动物是哺乳动物，更优选为小鼠。在一个进一步的方面中，本发明和涉及产生前面所述的转基因动物相交配的后代，后面称作子代。还包括从所述转基因动物获得的胚系细胞，这些胚系细胞自身用于产生后代，这些后代包含本发明中稳定整合到基因组中的载体。
例如，可以通过电穿孔法将所述的核酸载体导入胚胎干细胞中。在处于单细胞期的胚上进行细胞微注射，以确保核酸载体能够掺入到动物的胚系中，并在动物的所有细胞中表达，并随后转移到子代中。本发明的一个进一步的方面包括本发明中转基因动物的子代，这些子代携带有本发明中稳定整合到其基因组中的任意核酸载体。
在一个具体的实施方案中，将表达嵌合荧光蛋白的第一个非人类动物和转入另一个目标特征的另一个非人类转基因动物杂交，尤其是和转有SV40大T抗原的另一个非人类转基因动物杂交，也提供了本发明中的转基因的非人类动物。
因此，根据本发明的这一方面，提供了产生具有额外特征的转基因非人类动物的方法，所述的动物包含编码SV40大T抗原的核酸序列，后面称之为c-kit/无限增殖转基因，包括步骤为：将第一个转基因非人类动物和第二个包含编码SV40大T抗原之载体的转基因非人类动物相杂交，尤其是和商业来源的无限增殖小鼠(H-2Kb-tsA58：Charles River实验室)相杂交。其中第一个转基因非人类动物包含的载体具有a)编码嵌合荧光蛋白的核酸序列；和b)促进载体向非人类动物基因组中整合的序列，该序列能够抑制所述动物c-kit蛋白的功能性表达，促进嵌合荧光蛋白的表达。
术语“子代”或“后代”包括携带有本发明载体的所述转基因动物相交配的产物。还包括从所述转基因动物获得的胚系细胞，这些胚系细胞自身用于产生后代，这些后代包含本发明中稳定整合到基因组中的载体。
在本发明的一个进一步方面中，所述的核酸载体用于促进c-kit表达细胞从本发明中非人类转基因动物或从分离的生物样品的分离，尤其是从组织样品，如转染有所述载体的小肠；造血干细胞；上皮细胞和内分泌细胞，如朗氏岛的细胞、肾上腺髓质细胞、甲状腺细胞、松果体细胞和垂体细胞的分离。因此，本发明的一个目的是提供从转基因动物中分离c-kit表达细胞的方法，所述方法包括以下步骤；使包含c-kit表达细胞的组织解离；分离c-kit质粒靶向载体，从所述解离组织分离荧光标记细胞。可以使用本领域中已知的技术，从解离组织中分离荧光标记细胞，优选使用细胞分选仪进行分离步骤，更优选的细胞分选仪是流式细胞仪。在前面提到的方法中，包含c-kit表达细胞的组织选自Cajal间质细胞、造血干细胞、上皮细胞和内分泌细胞，如朗氏岛的细胞、肾上腺髓质细胞、甲状腺细胞、松果体细胞和垂体细胞。优选的是，收集的细胞由Cajal间质细胞组成。
细胞分离的方法包括，但不局限于外科切除或解剖、解离、荧光活化的细胞分选(FACS)、淘选、激光捕捉显微解剖(LCM)。从转基因动物标本中分离和纯化细胞的方法在Serafini于2001年2月14日提交的、题目为“转基因动物系标本(活体库)”的PCT申请WO02/64749中作有介绍，将其整体在此引入作为参考。
在某些实施方案中，使用外科切除或解剖来分离表达嵌合荧光蛋白的细胞。在解剖前，对转基因动物进行灌注。
优选使用包含α-鹅膏蕈碱或其他转录阻断剂的灌注液进行灌注，防止细胞分离过程中发生基因表达变化。
在其他的实施方案中，从解剖和解离的啮齿类动物小肠组织中分离表达嵌合荧光蛋白的细胞。这种解剖和解离的方法在本领域中是熟知的。参见Epperson，2000，J.Physiol.Cell.Physiol.279：C529-C539；Brewer，1997，J.Neurosci.Methods 71(2)：143-55；Nakajima et al.，1996，Nerosci.Res.26(2)：195-203；Masuko et al.，1992，Neuroscience49(2)：347-64；Baranes et al.，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA93(10)：4706-11；Emerling et al.，1994，Development 120(10)：2811-22；Martinou 1989，J Neurosci.9(10)：3645-56；Ninomiya，1994，Int.J.Dev.Neurosci.12(2)：99-106；Delree，1989，J.Neurosci.Res.23(2)：198-206；Gilbert，1997，J.Neurosci.Methods 71(2)：191-98；Huber，2000，J.Neurosci.Res.59(3)：372-78。所有文献以整体形式在此引入作为参考。
在其他的实施方案中，通过透光度光直接显影从组织片中分离表达嵌合蛋白的细胞，并使用Nakajima et al.，1996，Neurosci.Res.26(2)：195-203；Masuko et al.，1992，Neuroscience 49(2)：347-64的方法对这些细胞进行培养，这些文献以整体形式在此引入作为参考。
在其他的实施方案中，使用蛋白酶，如木瓜蛋白酶(Brewer，1997，J.Neurosci.Methods 71(2)：143-55；Nakajima et al.，1996，Neurosci.Res.26(2)L195-203)或胰蛋白酶(Baranes，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA93(10)：4706-11；Emerling et al.，1994，Development 120(10)：2811-22；Gilbert，1997，J.Neuroosci.Methods 71(2)：191-98；Ninomiya，1994，Int.J.Dev.Neurosci.12(2)：99-106；Huber，2000，J.Neurosci.Res.59(3)：372-78；这些文献以整体形式在此引入作为参考)解离表达嵌合荧光蛋白的细胞。还可以使用胶原酶解离细胞(Delree，1989，J.Neurosci.Res.23(2)：198-206；以整体形式在此引入作为参考)。解离的细胞在饲养层上生长。在一个实施方案中，解离的细胞是培养在商业来源的平滑肌细胞培养基，如Clonetic的SM或SMGM(Cambrex公司，NJ，美国)中的cajal间质细胞。
在另一个实施方案中，标记有嵌合荧光蛋白的组织可以使用Martinou的方法进行显微解剖和解离(1989，J.Neurosci.9(10)：3645-56；以整体形式在此引入作为参考)。
标记细胞的显微解剖之后进行密度梯度离心。通过荧光活化的细胞分选方法(FACS)对细胞进行纯化。在其他的实施方案中，可以通过仅使用光散射参数的细胞分选方法对细胞进行纯化，从而不必进行标记(Martinou，1989，J.Neurosci.9(10)：3645-56)。
在本发明的一个具体实施方案中，通过关键基因，即嵌合荧光蛋白和标记基因，即SV40大T抗原的表达，识别来源于转基因动物标本中转基因动物的杂合细胞群体的细胞亚群。可以使用任何便于操作的方法实现目标细胞亚群的选择和/或分离。例如，如果标记物是外部可接近的细胞表面相关蛋白或其他包含表位的分子，就可使用免疫吸附淘选技术或荧光免疫标记和荧光活化的细胞分选(FACS)相偶联。
使用Mouawad等(1997，J.Immunol.Methods，204(1)，51-56；以整体形式在此引入作为参考)所述的流式细胞仪方法检测表达标记基因产物的细胞。该方法的依据是：使用与标记基因序列所编码的标记酶特异结合的单克隆抗体，进行见解免疫荧光染色。该方法可以用于哺乳动物中酶表达的体外和体内定量。使用这种方法，可以对表达关键基因和/或标记基因的细胞进行定量，研究基因调控，包括转染死亡率、启动子效率、增强子活性和其他调控因子(Mouawad et al.，1997，J.Immunol.Methods，204(1)，51-56)。
在另一个特定实施方案中，使用荧光活化的细胞分选仪(FACS)从转基因小鼠的组织中分离携带有嵌合荧光蛋白的个体细胞。参见Hadjaantonakis and Naki，2000，Genesis，27(3)：95-8，以整体形式在此引入作为参考。在本发明的某些实施方案中，嵌合荧光蛋白包含一个自体荧光(AFP)受体，包括但不局限于野生型绿色荧光蛋白(wtGFP)和其变体，包括增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和增强型黄色荧光蛋白(EYFP)、ZsGreen、ZsYellow、DsRed、AmCyan或AsRed。
在本发明的某些实施方案中，通过在抗细胞表面标记物的抗体上淘选来分离细胞。在优选的实施方案中，抗体是单克隆抗体。使用本领域中已知的、Camu and Henderson，1992，Nez rosci.Methods44(1)：59-79；KashTwagi et al.，2000，41(1)：2373-7；Brocco and Panzetta，1997，75(1)：15-20；Tanaka et al.，1997，Dev.Neurosci.19(1)：106-11；和Barres et al.，1998，Neuron 1(9)：791-803中所述的方法对细胞进行分离和鉴定，这些文献以整体形式在此引入作为参考。
在其他的实施方案中，使用激光捕捉显微解剖(LCM)来分离细胞。对神经系统进行激光捕捉显微解剖的方法是本领域中所熟知的。参见Emmert-Buck et al.，1996，Science 274，998-1001；Luo et al.，1999，Nature Med.5(1)：117-122；Ohyama et al.，2000，Biotechniques29(3)：530-36；Murakami et al.，2000，Kidney Int.58(3)：1346-53；Goldsworthy et al.，1999，Mol.Carcinog.25(2)：86-91；Fend et al.，1999，Am.J.Pathol.154(1)：61-66；Schutze et al.，1998，Nat Biotechnol.Aug；16(8)：737-42，这些文献以整体形式在此引入作为参考。
在一个特定的实施方案中，使用本发明中的c-kit/无限增殖转基因小鼠系标本来分离表达关键基因，即本发明中嵌合荧光蛋白的cajal间质细胞，这些细胞位于小肠中，产生对于肠蠕动重要的定步组分(慢波(slow waves))。
本发明的转基因动物系和从本发明的转基因动物系中分离的细胞可用于靶证实、药物发现、药效学分析、行为分析、发育分析、电生理学分析和基因表达分析等，但优选靶证实和药物发现。本发明因此提供了鉴定参与c-kit表达细胞功能的潜在药物靶的方法，所述的方法包括：用靶向特异基因沉默手段(means)对使用上述任意方法获得的c-kit表达细胞进行处理，测定所述基因沉默手段对所述细胞功能的影响。
在第一个方面中，可以通过本领域中已知的任意方法来分析表达本发明中嵌合荧光蛋白的分离细胞，鉴定潜在的药物靶。相应地，在本发明的一个方面中，使用本领域中已知的任意方法来分析细胞的基因表达谱，举例来说，但不具有限制性，这些方法通过从分离细胞中分离mRNA，将mRNA和芯片相杂交，鉴定分离细胞中表达或不表达的基因。对用或不用目标化合物处理的细胞中的基因表达进行比较，或从经或不经特定处理的动物体内获得的细胞中的基因表达进行比较。另外，还可以通过Northern印迹分析、PCR、Rnase保护等对从分离细胞中获得的mRNA进行分析，确定编码特定蛋白产物的mRNA存在与否，依赖于细胞处理的这些mRNA的存在或水平。
在另一个方面中，从分离细胞中获得的mRNA可以用于生成cDNA文库，事实上，可以从不同的分离细胞群产生这种细胞类型特异性cDNA文库的集合。这种cDNA文库可用于分离基因表达，分离和鉴定细胞类型特异性基因，剪接变体和非编码RNA。在另一个方面中，从经或不经处理的本发明的转基因动物体内分离、或从具有或不具有疾病状态的本发明的转基因动物体内分离的细胞中制备的这种细胞类型特异性文库，可用于进行减法杂交，鉴定和未处理转基因动物相比，特定处理或疾病状态情况下更高或更低水平表达的基因。
这些分析数据可用于产生动物中，或特定组织中，或解剖区域，如小肠中不同细胞群基因表达分析的数据库。使用这一数据库和生物信息工具，如层级和非层级聚类分析和主成分分析，对细胞绘制“指纹图谱”，用作健康和疾病模型动物或组织的具体指征。
在一个优选的实施方案中，用在上文所述分析中的分离细胞由来源于c-kit/无限增殖转基因动物的cajal间质细胞组成。因此，本发明的一个目的是提供鉴定参与慢波形成的潜在药物靶的方法，所述方法包括用靶向特异基因沉默手段对使用上述任意方法获得的cajal间质细胞进行处理，测定所述基因沉默手段对所述细胞形成慢波的影响。在一个具体的实施方案中，cajal间质细胞从本发明的转基因动物体内分离，更优选从c-kit/无限增殖转基因动物体内分离。这里所用的靶向特异基因沉默手段通常指本领域中抑制潜在药物作用靶蛋白的基因表达的已知方法，该方法包括使用反义序列或段干扰RNA(siRNA)。
可以设计反义寡核苷酸，用来和核酸、前体mRNA或成熟mRNA的互补序列相杂交，干扰靶向DNA序列所编码多肽的生成，总的表现为降低或抑制多肽的表达。反义序列的构建及其应用在Peyman andUlman，Chemical Reviews，90：543-584，(1990)；Crooke，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32：329-376，1992)和Zamecnik and Stephenson，P.N.A.S，75：280-284，(1984)中作有介绍。核酶的构建及其应用在Gibsonand Shillitoe，Molecular Biotechnology 7(2)：125-137，(1997)中作有介绍。
可以设计短干扰RNA，用来和编码潜在药物作用靶蛋白的mRNA相杂交，总的表现为降低或抑制蛋白质的表达。SiRNA的构建及其应用在Elbashir，2001 Nature 411：494；Brummelkamp，2002 Science296：550；和Sui，2002 PNAS 99(8)：5515中作有介绍。本发明的优选实施方案中提供了鉴定参与慢波形成的潜在药物靶(drug target)的方法，所述方法包括使从c-kit/无限增殖转基因动物体内分离的cajal间质细胞和靶特异性siRNA相接触，测定所述siRNA对所述细胞形成慢波的影响。
通过测定所述细胞中的Ca-摆动来测定慢波的形成。可使用各种技术实时测定离子流，例如传统的电生理技术，当可以使用电生理技术时，新的高通量(high throughput)筛选方法正在建立。尤其是使用完整细胞膜片钳技术来记录(转染有siRNA)ICC的膜电势或电流。类似的，利用离子敏感的荧光染料，如fluo-3、fluo-4、fluo-5N、fura红测定离子流，从而利用荧光计和荧光成像技术来进行实时分析，其中荧光成像技术包括带有或不带有激光共聚焦的荧光显微方法和成像分析公式联用。
另一个方法是化合物的高通量筛选分析，其中化合物作为激动剂或调节剂发挥活性、从而影响分离ICC中钙瞬间电流。该分析方法借助于称作荧光成像板读数仪((FLIPR)，Molecular Device公司)的仪器。在其最常见的构型中，它能够激发并测定荧光染料所发射的荧光。它使用氩离子激光产生荧光物质在488nm处的高能激发，使用光学系统快速扫描96-/384-孔板，使用灵敏的冷CCD相机捕捉所发射荧光。它还含有一个96-/384-孔移液吸头，使仪器能够将受试试剂的溶液转移到96-/384-孔板的孔中。设计FLIPR分析，在加入化合物之前、过程中或之后实时测定细胞群产生的信号，同时对所有96-/384-孔进行测定。可以使用FLIPR分析法筛选并鉴定对ICC具有活性的化合物，其中ICC从c-kit/无限增殖转基因动物体内分离得到。
举例来说，但决不具有限制性，可以监测细胞电生理、生理(例如，细胞中15个生理参数的变化，如细胞内或细胞外钙或其他离子浓度、pH变化、第二信使的存在或量上的变化、细胞形态、细胞活性、凋亡指标、分泌因子的分泌、细胞复制、接触抑制等)、形态等的变化。因此本发明的一个进一步方面是提供筛选调控ICC中慢波形成的化合物的方法，所述方法包含使根据本发明方法获得的cajal间质细胞和受试化合物相接触，测定所述受试化合物对所述细胞形成慢波的影响。在一个特定的实施方案中，所述细胞从包含本发明载体的转基因动物体内分离，更优选的是，所述细胞从c-kit/无限增殖转基因动物体内分离得到。
参照下面的实验细节可以更好地理解本发明，但是本领域的熟练技术人员也明白这些实验细节仅是本发明的示例，后面的权利要求书会更为全面地描述本发明。另外，整篇申请中引用了多种出版物。这些出版物的内容在本申请中引用作为参考，以更全面地描述本发明所述的技术领域。
实施例1  建立用于产生转基因小鼠的ZsGreen1/NoLS c-kit构建体
引言：Cajal间质细胞(ICC)产生对于肠蠕动重要的定步标记(慢波)。定步标记的分子机制尚不清楚。由于在解离过程中ICC的唯一标记物，即c-kit丢失，过去分离ICC的尝试都是不成功的。因此，我们将产生一种转基因小鼠，这种小鼠和W^lacZ模型¹类似，只是携带有位于c-kit启动子控制下的ZsGreen1基因，而非LacZ。核仁定位信号(NoLS)将和ZsGreen1相融合，产生一个浓缩的、亮荧光信号。这种定位的荧光报告基因将能够示踪活组织中的c-kit表达性ICC，和解离后的c-kit表达性ICC。
方法：使用表1中提到的引物和退火温度，通过PCR(30”94℃，(30”94℃，1’Tm，1’ 72℃)25×)获得不同的NoLS(TCOF-1²、RLP31³、RPS25⁴或Fxr2h⁵)和c-kit第一个外显子的一部分。分别用EcoRI和BamHI、SacI和EcoRI、SacI和BamHI对NoLS、c-kit和载体pZsGreen1-N1进行消化，并使它们相连接。将构建体(参见图1)转化到感受态E.coli中(one shot cells，Invitrogen)，DNA分离后瞬时转染COS-7(DOTAP，Roche)细胞。使用共聚焦显微镜和FACS对各构建体的亚细胞靶向效率和细胞毒性进行定量。固定后，使用TOPRO-3核染料(Molecular Probe)，用溶于PBS中的0.1μM TOPRO-3将细胞孵育5分钟对细胞核进行染色。
结果：
1.共聚焦显微观察显示了细胞核的红色信号(TOPRO-3核染色)和构建体的绿色信号(ZsGreen1)。
和不具有核仁定位信号的pZsGreen1-N1不同，NoLS构建体RPS25、TCOF-1和Fxr2h诱导荧光蛋白在核仁的积累(图2)。长时间后，这些核仁定位的ZsGreen1重新转运至细胞质中(图3)。
转染后24h，RPS25良好地定位于核仁中，但是在32h时，RPS25返回到细胞质中。TCOF-1信号较弱，仅缓慢地定位于核仁中(32h)。虽然有些Fxr2h-ZsGreen1定位于核仁中，但仍有大部分存在于细胞质中。
四个构建体中，RLP31能够最好地将ZsGreen1定位。定位的发生早在8h，持续至转染后32h。另人奇怪的是，该信号并不定位在细胞核中，而是定位在邻近细胞核的部位。用抗-球蛋白(MolecularProbes)对RLP31转染的HeLa细胞进行免疫染色，结果表明ZsGreen1确实定位于高尔基体中，不非定位于核仁中，和以前的报道相一致3(图3)。
2.RLP31转染细胞的FACS分析表明有20％的转染效率。转染和未转染群体中死亡细胞的百分比分别是8％～10％和5％～7％(数据未列出)。
为了比较未转染HeLa细胞和稳定转染HeLa细胞的增殖效率，进行了Via Light HS分析。72h时，不同克隆间没有观察到显著的差异，说明RLP31-ZsGreen1蛋白没有毒性(图5)。共聚焦显微分析表明5个克隆中RLP31-ZsGreen1的表达水平是相当的(数据未列出)。
结论：除了RLP31将ZsGreen1定位于高尔基体之外，所有的NoLS(RPS25＞TCOF-1³Fxr2h)都将ZsGreen1定位于核仁中。使用pZsGreen1-N1-c-kit-RLP31构建体获得了持续时间最长的定位。其表达不导致显著的细胞毒性，能够使得转染细胞通过共聚焦显微镜进行观察，通过流式细胞仪进行细胞分选。通过同源重组，pZsGreen1-N1-c-kit-RLP31正用于产生转基因Kit W-GFP小鼠。
表1.引物
(SEQ ID No.3)c-kit正向：     GAGCTCAGAGTCTAGCGCAGCC      521bp Tm＝61℃
(SEQ ID No.4)c-kit反向：     GGACAAACGTCAGGTCCGTGG
(SEQ ID No.5)c-kit嵌套正向： CATGGAGCTCAGAGTCTAGCGCAG    84bp Tm＝65℃
(SEQ ID No.6)c-kit嵌套反向： GCTGTGAATTCACGGAGCAGGAC
(SEQ ID No.7)RPS25正向：     GACGACAAGAAGAAGAAAGATGCCG   302bp Tm＝58℃
(SEQ ID No.8)RPS25反向：     GCTCTGTGCTTTGAAACCAGCTTGA
(SEQ ID No.9)RPS25嵌套正向： GACCCAGAATTCAAATCTGGTGGC    53bp Tm＝66℃
(SEQ ID No.10)RPS25嵌套反向：TTGTFCGGATCCTCCCGAACTTTG
(SEQ ID No.11)
RLP31as1引物：GCATCGAATTCCGCTTGTCCAGAAAACGTAAGGATCCTGAGG
(SEQ ID No.12)FXR2H正向：CGCCGTACTGATGAAGACAGGACTG 296bp Tm＝60℃
(SEQ ID No.13)FXR2H反向：GGAGCTTGCTGACAGAGTCACCCT
(SEQ ID No.14)FXR2H嵌套正向：GAATCAGAATTCAGACCCCAGAGACG 44bp Tm＝65℃
(SEQ ID No.15)FXR2H嵌套反向：CAGTCGGATCCCCACGATTACGG
(SEQ ID No.16)TCOF-1正向：GTGCTGGTGGCAAGGGGAAG 263bp Tm＝59℃
(SEQ ID No.17)TCOF-1反向：TCACACGGCAGGCTCGGCTG
(SEQ ID No.18)TCOF-1嵌套正向：GAAAGAATTCAAGAAAAAAAAAGACAAG 125bp
Tm＝58℃
(SEQ ID No.19)TCOF-1嵌套反向：GTATGGATCCCACACGGCAG
表2-所用的NoLS和c-kit序列