具有增强免疫和抗肿瘤活性的厚壳贻贝多糖MF4 技术领域
本发明涉及医药技术领域，是从海洋动物厚壳贻贝中分离到一种新的具有增强免疫和抗肿瘤活性的多糖MF4。
背景技术
厚壳贻贝(Mytilus Coruscus)属贻贝科(Mytilidae)贻贝属(Mytilus)；为温水性种，在我国主要分布在辽宁省的大连、小长山；山东省的青岛、砣矶岛、大钦岛、蓬莱、烟台、威海；浙江省的嵊泗列岛、舟山群岛、朱家尖、鱼山群岛、下大陈、南麂岛；福建省的平谭、厦门、东山。贝壳较大，厚重，呈楔形；成体体长100-200mm左右，壳长度为或大于高度的2倍，约为宽度的2.5-3倍。壳前端较尖细，后端宽圆；壳表较粗糙，被有棕褐色或栗褐色的壳皮(王祯瑞，中国动物志.软体动物门.双壳纲：贻贝目.第1版.北京.北京科学出版社，1997)贻贝贝肉肉质含丰富的营养物质，是高级蛋白、维生素D的重要来源；文献报道(刘志峰等，中国海洋药物，2001，20(6)：9)贻贝有抗动脉粥样硬化，降血脂，抑制血小板的凝聚从而抑制血栓的形成，改善心肌氧和营养物质的供应及保护实验性心肌缺血，改善微循环和降血压等功效，而对该种贻贝的活性成分未见报道。
发明内容
本发明从生长于中国浙江海域的厚壳贻贝中提取分离到一种新的具有免疫增强作用和抗肿瘤作用地多糖，命名为MF4，经理化性质分析，其理化性质为：白色絮状化合物，易溶于水和二甲基亚砜，相对分子量为113,000，主要由岩藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖组成，比例依次为15∶15∶26∶37；糖苷键的构型为β构型；糖苷键的类型为1-4糖苷键，1-2糖苷键和五碳糖1-3糖苷键，比例依次为80∶9∶2；而存在于分支点处的糖苷键为1-6糖苷键和脱氧六碳糖1-2糖苷键，比例为7∶10；端基糖除了六碳糖外，分子还含有部分脱氧六碳糖。
本发明厚壳贻贝多糖MF4的提取分离方法如下：
(1)提取：将新鲜的厚壳贻贝贝肉洗净、用搅拌机搅碎后，在3倍体积沸水中加热提取4小时，提取液用2倍体积95％的乙醇沉淀，沉淀用乙醇、丙酮分别洗涤3次，用Savager法除蛋白2次(将沉淀与Savage试剂∶CHCl3-n-BuOH＝4∶1充分混匀，离心收集上清液，去除水与有机相之间的蛋白变性层)，收集水相，冷冻干燥，得厚壳贻贝多糖粗提物。
(2)分离：上述多糖粗提物用DEAE-纤维素-52(Pharmacia公司)分离，依次用0.05、0.1、0.2、0.5、1.0mol/L的NaCl洗脱，收集0.5mol/L的洗脱部分，脱盐浓缩，冷冻干燥，得MF部分；MF用葡聚糖凝胶Sephadex G-100(Pharmacia公司)分离，以0.05mol/L的NaCl洗脱，收集第一个洗脱峰，脱盐浓缩，冷冻干燥；最后用HPLC处理，以0.1M磷酸盐缓冲系统(含有14.2g/L Na2SO4及0.5g/LNaN3的0.1mol/L的NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液)作为流动相，收集第一个洗脱峰，脱盐浓缩，冷冻干燥，得到多糖MF4。
本发明厚壳贻贝多糖MF4理化性质的分析方法及结果如下：
(1)HPGFC法纯度的鉴定：分析柱为TSK-G3000SWXL，7.8mm×30cm(Merck公司)，流动相为含有14.2g/L Na2SO4及0.5g/L NaN3的0.1mol/L的NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液，进样量50μl，流速为0.8ml/min，示差检测。结果显示：多糖MF4呈单一的对称峰，表明该样品的均一性。
(2)HPGFC法相对分子量的测定：条件同HPGFC法纯度的鉴定一样，以Dextran T10、T40、T70、T100、T120为标准分子量，测得各自的洗脱体积Ve，以葡萄糖T2000(Pharmacia公司)测得其外水体积Vo，葡萄糖测得柱的总体积Vt，以(Ve-Vo)/(Vt-Vo)对其分子量的对数作图得标准曲线，再以同样的条件及方法测得MF4洗脱体积，求出其相对分子量为113,000。
(3)紫外光谱：MF4经紫外扫描在250-280nm之间都无蛋白质及核酸特征吸收峰。
(4)红外光谱：MF4红外光谱显示出多糖的特征吸收峰，3442cm-1(OH伸缩振动)，1650cm-1(酰胺基C＝O伸缩振动)，1137cm-1，995cm-1(这一宽峰为糖苷键的吸收峰以及羟基的变角振动)。
(5)1HNMR：多糖质子信号大多堆集δ4.0-5.51的狭小范围内，除端基质子的信号在δ4.8-5.5较易解析外，其它H2-H6的信号均集中在δ4.0-4.8之间，解析困难。通常α-吡喃己糖端基质子的δ值往往超过5.0，而β型的δ值则小于5.0。 MF4的H-1质子信号不明显，δ应为小于5.0，和其他H2-H6的质子以及重水的信号相互重叠，故认为是β-吡喃己糖。
(6)组分分析：MF4用1mol/L的H2SO4水解8小时后制成糖腈乙酸酯衍生物用于GC-MS分析，与标准品对照显示其组成及比例为岩藻糖∶甘露糖∶葡萄糖∶半乳糖＝15∶15∶26∶37。硫酸咔唑法糖醛酸的定性反应呈阴性。
(7)糖苷键分析结果：过碘酸氧化反应后加入酚酞指示剂呈现无色，说明无甲酸生成，从而判定其不含1-6糖苷键。Smith降解后进行糖腈乙酰化GC-MS分析，发现只有甘油和赤藓醇存在，没有单糖存在，说明含有1-4糖苷键和1-2糖苷键，而不含1-3糖苷键。多糖MF4甲基化后水解制成糖醇乙酰化衍生物GC-MS分析发现其含有：1，5-二-O-乙酰基-6-脱O-2，3，4-三-O-甲基己糖醇，1，5-二-O-乙酰基-2，3，4，6-四-O-甲基己糖醇，1，3，5-三-O-乙酰基-2，4-二-O-甲基戊糖醇，1，2，4，5-四-O-乙酰基-6-脱O-3-O-甲基己糖醇，1，2，5-三-O-乙酰基-3，4，6-三-O-甲基己糖醇，1，4，5-三-O-乙酰基-2，3，6-三-O-甲基己糖醇，1，4，5，6-四-O-乙酰基-2，3-二-O-甲基己糖醇，1，4，5-三-O-乙酰基-2-乙酰胺基-3，6-二-O-甲基己糖醇，而且比例依次为：8∶7∶1∶8∶7∶59∶6∶4，证实了过碘酸氧化和Smith降解分析结果，同时也说明该多糖糖苷键的类型为1-4糖苷键，1-2糖苷键和五碳糖1-3糖苷键，比例依次为80∶9∶2；而存在于分支点处的糖苷键为1-6糖苷键和脱氧六碳糖1-2糖苷键，比例为7∶10；端基糖除了六碳糖外，分子内所含的部分脱氧六碳糖也处在端基糖的位置。
该多糖为首次从厚壳贻贝贝肉中提取分离到，命名为MF4。
本发明对多糖MF4进行了体外和体内的免疫增强活性实验，表明可明显的促进NK细胞的活性和淋巴细胞的增殖，能提高免疫系统的功能。动物体内试验表明，对S180肉瘤和Lewis肺癌均有显著的抑制作用。故可用于制备免疫增强剂或抗肿瘤药物。
具体实施方式：
下面结合实施例对本发明作详细的描述。
实施例1.制备厚壳贻贝多糖MF4
选择生长在浙江海域的厚壳贻贝新鲜贝肉16kg，洗净、用搅拌机搅碎后，在3倍体积量沸水中加热提取4小时，提取液用2倍体积95％的乙醇沉淀，沉淀用乙醇、丙酮分别洗涤3次，用Savager法除蛋白2次，冷冻干燥，得厚壳贻贝多糖粗提物。多糖粗提物用DEAE-纤维素-52分离，依次用0.05、0.1、0.2、0.5、1.0mol/L的NaCl洗脱，收集0.5mol/L的洗脱部分，冷冻干燥，得MF部分。MF用葡聚糖凝胶(Sephadex G-100)分离，以0.05mol/L的NaCl洗脱，收集第一个洗脱峰，最后用HPLC处理，以0.1M磷酸盐缓冲液作为流动相，收集第一个洗脱峰，分离纯化得到多糖MF4样品217mg。
实施例2.厚壳贻贝多糖MF4体内外增强免疫活性试验
1.T、B淋巴细胞增殖反应实验
按常规加入有丝分裂原刀豆蛋白A(ConA)5mg·L-1诱导T淋巴细胞增殖，加入有丝分裂原脂多糖(LPS)10mg·L-1诱导B淋巴细胞增殖，细胞的形态和代谢可发生一系列的变化，转化为母细胞，并分化增殖。细胞内蛋白质和核酸的合成增加，并释放出多种淋巴因子。用3H TdR掺入法定量测定样品对细胞增殖的影响：在培养液中加入3H TdR，使其参入到新合成的DNA中，可定量细胞内DNA合成的强度，从而测定细胞的增殖，放射性核素参入法准确而客观。用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测样品对细胞的毒性，活细胞内线粒体脱氧酶能将MTT由黄色还原成蓝色的甲肷，甲肷产量与活细胞成正比。用有机溶剂溶解甲肷后，可用酶标仪检测光密度(OD)值。
结果：详见表1，表2
表1 多糖MF4样品对T淋巴细胞毒性实验结果
样品名 浓度(mg·L-1) OD值(x±s) 细胞毒性
阴性对照 5 0.395±0.001 -
多糖MF4 1 0.502±0.008 无
10 0.606±0.012 无
100 0.814±0.013 无
注：实验组的OD值如果大于对照品的OD值，就判断样品无毒性
表2 多糖MF4对T、B淋巴细胞增殖反应结果
T淋巴细胞 B淋巴细胞
T淋巴细 B淋巴细
浓度 ConA刺激 浓度 LPS刺激
样品名
胞综合活
胞综合活
(mg·L-1) CPM平均 (mg·L-1) CPM平均
性评价(％)
性评价(％)
值(x±s) 值(x±s)
阴性对照 1966±341 2013±184
阳性对照 5 29450±1429 10 24409±1367
多糖MF4 1 41715±2020 42 1 33820±1659 39
10 41135±526 40 10 43241±1245 77
100 40935±2766 39 100 50974±3083 109
注：测试体系：体外
(1)结果评定：淋巴细胞的增殖采用被测样品脉冲指数(CPM)值减去阳性对照孔的CPM值，除以阳性对照孔的CPM值乘以％。
(2)百分比前有负号代表样品对T、B淋巴细胞有抑制作用
(3)百分比前没有负号代表样品对T、B淋巴细胞有增强作用
(4)淋巴细胞毒性的判断为“有”或“无“
(5)在无细胞毒的情况下，T、B淋巴细胞的增强/抑制的百分比在±15％以上，表示有作用
(6)T淋巴细胞阳性对照为刀豆蛋白A(ConA)，B淋巴细胞阳性对照为脂多糖(LPS)
上述实验表明，MF4对T、B淋巴细胞均有明显的增殖作用。
2.厚壳贻贝多糖MF4对荷Lewis肺癌瘤小鼠淋巴细胞转化和NK细胞活性的实验
受试样品：精确称取受试样品MF4以生理盐水稀释，配制成所需浓度的各档溶液，每鼠每天注射体积为0.5ml。
阳性对照品：注射用环磷酰胺(CTX)，上海华联制药厂出品。云芝糖肽胶囊，上海新康制药厂生产。
瘤源：小鼠Lewis肺癌细胞和小鼠L929培养细胞均由上海医药工业研究院药理室培养及体内传代维持。
实验动物：C57BL/6小鼠由上海中科院实验动物中心提供，合格证号：SCXK(沪)2003-0003。体重：19-21g。性别：雄性。动物数：实验组及阳性对照组每组6只小鼠，阴性对照为10只。
剂量设置：5mg/kg/d。
给药方案：静脉给药，每天1次，连续10天。
实验对照：阴性对照给以与实验组等体积的生理盐水，给药方案为静脉给药，每天1次，连续10天。阳性对照环磷酰胺(CTX)30mg/kg，腹腔给药，每天1次，连续7天。参照样品云芝多糖2g/kg，灌胃给药，每天1次，连续10天。
(1)对荷Lewis肺癌C57BL/6小鼠的淋巴细胞增殖试验：取C57BL/6小鼠足趾皮下接种无菌制成的Lewis肺癌混悬液0.05ml/鼠(1×106个肿瘤细胞)。次日随机分组，按实验设计方案给药，末次给药后，次日解剖各组小鼠，无菌摘取脾脏，用100目筛网制备成单个脾细胞悬液，用含10％灭活小牛血清的RPM1640培养液调节细胞浓度为1×107个细胞/ml，将细胞悬液加入96孔细胞培养板，每孔100μl(1×106个细胞/孔)，再加入含ConA(5μg/ml)的培养液100μl，置37℃，5％CO2条件培养72小时后，轻轻吸取上清液100μl，加入MTT染色液(5mg/ml，20μl)，置37℃，5％CO2条件再培养2小时后加入消化液100μl，于次日测定各孔的OD值，按下列公式计算刺激指数：刺激指数＝实验组OD值/对照组OD值。
(2)对荷Lewis肺癌小鼠的NK细胞活性的测试：取C57BL/6小鼠足趾皮下接种无菌制成的Lewis肺癌混悬液0.05ml/鼠(1×106个肿瘤细胞)。次日随机分组，按实验设计方案给药，末次给药后，次日解剖各组小鼠，无菌摘取脾脏，用100目筛网制备成单个脾细胞悬液，低渗除去红细胞，将细胞悬液转入培养瓶中37℃5％的CO2培养1小时后除去贴壁细胞，计数活细胞并用培养液调至3×106个细胞/ml，作为效应细胞。靶细胞去L929体外培养细胞常规培养24小时，以培养液调整细胞浓度为1.5×105个细胞/ml，使效靶细胞的比例为20∶1。取96孔培养板分别加入效应细胞和靶细胞，另设效应细胞和靶细胞对照，于37℃，5％CO2条件培养4小时后，加入MTT染色液，再培养2小时后加入消化液于次日测定各孔的OD值，按下列公式计算NK细胞的活性：NK细胞毒％＝[靶细胞对照OD均值-(实验组OD均值-效应细胞对照OD均值)]/靶细胞对照组OD均值×100％
实验结果详见表3和表4：
表3 多糖MF4对荷Lewis肺癌小鼠(皮下接种)NK细胞活性影响
组别 剂量 给药方案 动物数 动物体重 OD值* NK 活性
(mg/kg/d) (只)始/终 (g)始/终 X±SD (％)
MF4 5 iv×7qd 6/6 20.3/23.9 0.397±0.14*** 55.57
CTX 30 ip×7qd 6/6 20.4/24.4 0.505±0.08 40.94
云芝糖肽 2000 ig×10qd 6/6 20.2/20.5 0.358±0.05*** 58.13
阴性对照 相应溶剂 iv×7qd 10/10 20.4/24.7 0.517±0.04 39.53
注：实验组与阴性对照组相比，***表示P值＜0.01
*为实验组OD均值-效应对照组OD均值
云芝糖肽为阳性对照，CTX为肿瘤化疗药物环磷酰胺
表4 MF4对荷Lewis肺癌C57BL/6小鼠(皮下接种)淋巴细胞转化增值影响
组别 剂量 给药方案 动物数 动物体重 OD值* 刺激指数
(mg/kg/d) (只)始/终 (g)始/终 X±SD
MF4 5 iv×7qd 6/6 20.3/23.9 0.947±0.07*** 1.77
CTX 30 ip×7qd 6/6 20.4/24.4 0.463±0.05 0.87
云芝糖肽 2000 ig×10qd 6/6 20.2/20.5 0.947±0.07*** 1.79
阴性对照 相应溶剂 iv×7qd 10/10 20.4/24.7 0.535±0.06
注：实验组与阴性对照组相比，***表示P值＜0.01
上述实验显示，MF4对荷Lewis肺癌小鼠NK细胞活性和淋巴细胞转化均有较大程度的提高和促进作用，与临床使用的抗肿瘤药物云芝糖肽具有同样的增值效果，而化疗药物CTX对淋巴细胞的转化则有明显的抑制作用。
3.厚壳贻贝多糖MF4体内抗肿瘤实验
实验准备和设计
受试样品：精确称取受试样品MF4以生理盐水稀释，配制成所需浓度的各档溶液，每鼠每天注射体积为0.5ml。
阳性对照品：注射用香菇多糖，南京振中生物工程有限公司出品。
瘤源：小鼠肉瘤S-180培养细胞，小鼠Lewis肺癌体内肿瘤模型；均由上海医药工业研究院药理室培养及体内传代维持。
实验动物：C57BL/6小鼠由上海中科院实验动物中心提供，合格证号：SCXK(沪)2003-0003号。昆明小鼠由上海医药工业研究院动物组提供，合格证号：沪合动证字第117号。体重：19-21g。性别：雌性。动物数：实验组及阳性对照组每组10只小鼠，阴性对照各为20只。
剂量设置：高、中、低剂量组分别为12.5mg/kg，5mg/kg，2mg/kg
给药方案：静脉给药，每天1次，连续15天。
实验对照：阴性对照给以与实验组等体积的生理盐水，给药方案为静脉给药，每天1次，连续15天。阳性对照香菇多糖2mg/kg，静脉给药，每天1次，连续15天。
实验步骤
无菌条件下取对数生长的小鼠肉瘤S-180细胞，以生理盐水稀释成约7×106个/ml癌细胞匀浆，分别腋下皮下接种(0.2ml/鼠)，接种24小时后按实验设计方案给药，实验结束时取各组肿瘤与阴性对照组对比，按下式计算各组的抑瘤率：抑瘤率％＝[(阴性对照组肿瘤体积-给药组肿瘤体积)/阴性对照组肿瘤体积]×100％
对Lewis肺癌足趾接种的疗效实验：无菌条件下取生长旺盛的Lewis肺癌瘤源，以生理盐水为溶剂，采用匀浆法制备成约1×107个/ml细胞悬液，相应宿主每鼠足趾皮下接种0.05ml/鼠，次日按实验设计方案给药，两周后处死动物，截取足趾称重，按下式计算各组的抑瘤率：抑瘤率％＝[(阴性对照组平均荷瘤足趾重-给药组平均荷瘤足趾重)/(阴性对照组平均荷瘤足趾重-空白组平均足趾重)]×100％
实验结果：MF4以高、中、低剂量组12.5mg/kg，5mg/kg，2mg/kg剂量iv×15qd方案，对小鼠S-180肉瘤腋下皮下接种的抑瘤率分别为61.19％，55.24％，39.16％，详见表5；对小鼠Lewis肺癌足趾皮下接种的抑瘤率分别为49.34％，43.41％，34.73％，见表6。
表5 MF4多糖对昆明种小鼠肉瘤S-180(腋皮下接种)模型的疗效
样品 剂量 给药方案 动物数 动物体重 瘤重 抑瘤率
(mg/kg/d) (只)始/终 (g)始/终 (g)X±SD (％)
MF4 12.5 iv×15qd 10/10 19.5/26.3 1.11±0.17*** 61.19
MF4 5 iv×15qd 10/10 19.8/26.9 1.28±0.19*** 55.24
MF4 2 iv×15qd 10/10 19.3/27.1 1.74±0.17*** 39.16
香菇多糖 2 iv×15qd 10/10 19.6/26.5 1.92±0.13*** 32.87
阴性对照 相应溶剂 iv×15qd 20/20 19.4/27.9 2.86±0.26
注：实验组与阴性对照组相比，***表示P值＜0.01
表6 MF4多糖对昆明种小鼠Lewis肺癌(足趾皮下接种)模型的疗效
样品 剂量 给药方案 动物数 动物体重 瘤重(g) 抑瘤率
(mg/kg/d) (只)始/终 (g)始/终 X±SD (％)
MF4 12.5 iv×15qd 10/10 20.9/25.6 0.461±0.09*** 49.34
MF4 5 iv×15qd 10/10 20.4/26.1 0.515±0.09*** 43.41
MF4 2 iv×15qd 10/10 20.5/25.9 0.594±0.12*** 34.73
香菇多糖 2 iv×15qd 10/10 20.6/26.3 0.680±0.13 25.27
CTX 30 ip×7qd 10/10 20.6/24.2 0.024±0.02*** 97.36
阴性对照 相应溶剂 iv×15qd 20/20 20.6/26.5 0.91±0.14
注：实验组与阴性对照组相比，***表示P值＜0.01
结果表明，MF4静脉给药对小鼠Lewis肺癌及S-180肉瘤均具有明显抗肿瘤疗效，并显示一定的量效关系，也与疗程呈正相关。各实验组动物实验前后动物体重都有较明显的增长，提示本发明的MF4毒性较小。与目前临床使用的香菇多糖比较，在同等剂量下，MF4对肿瘤的抑制率明显高于香菇多糖。因此，厚壳贻贝多糖MF4可用于制备新的免疫增强制剂或抗肿瘤药物。本发明对开发利用中国的海洋生物资源开辟了新的途径。