精制高纯度替曲朵辛的方法 本发明涉及一种利用高压液相技术制取高纯度替曲朵辛的方法。
替曲朵辛(也称为河豚毒素)属于小分子非蛋白的高活性神经毒素，主要存在于河豚鱼的卵巢、肝脏和血液中，其它部分含量极微。替曲朵辛也在其它动物甚至海藻中发现，包括蜥蜴，加州蝾螈，虎虾鱼，蓝环章鱼等。
替曲朵辛的化学名是：八氢-12-(羟甲基)-2-亚氨基-5，9：7，10α-二甲桥-10αH-[1，3]二桥氧并[6，5-d]嘧啶-4，7，10，11，12-戊醇，分子式为C11H17N3O8，而分子量为319.27。其结构式为：替曲朵辛的结构特征是：仅有一个碳环，一个胍基，六个羟基和-个半醛糖内酯基团。纯的替曲朵辛是无色的结晶粉末，加热到220℃时晶体变暗但没有分解。替曲朵辛溶于酸性水溶液，不溶于水及有机溶剂：在水溶液中的Pka为8.76，属于碱性动物生物碱。在中性或弱有机酸性溶液中对热相当稳定，在强酸和强碱性水溶液中迅速破坏。
用高压液相法分离、测定的天然河豚鱼中的毒素是含有10余种类似物的混合物，其中主要成分叫替曲朵辛，它的含量在70％-80％之间。另外三种主要类似物为河豚酸、4-表替曲朵辛和脱水4-表替曲朵辛。这三个替曲朵辛衍生物的化学性质有些微小的差别，但生物活性差别较大，例如它们的毒性，替曲朵辛的毒性为4500鼠单位/毫克，4-表替曲朵辛的毒性仅为710鼠单位/毫克，而脱水4-表替曲朵辛地毒性降低到92鼠单位/毫克[1]。
在本专利申请人的另一项发明“高获得率提取替曲朵辛的方法”(中华人民共和国国家知识产权局申请号：00124516.3，2000年9月18日申请)提供了一种能以高获得率从河豚鱼内部组织(例如卵巢)中提取替曲朵辛的方法。以该方法提取的替曲朵辛的纯度可达80％以上，可以应用本发明作进一步的精制，从而使纯度达到96％甚至99％以上，从而为基于高纯度替曲朵辛的研究及应用，特别是医药方面的研究，提供必要的基础。
因此，本发明的目的在于提供一种精制替曲朵辛的方法，其特征在于包括以下步骤：将替曲朵辛原料溶于稀醋酸；选择庚烷磺酸钠溶液为流动相，ODS柱，应用高效液相技术对替曲朵辛溶液进行精制；然后将替曲朵辛浓缩、沉淀和结晶。
在本发明的优选实施方案中，在步骤(a)中稀醋酸的浓度为0.5％-5％。在步骤(b)中，庚烷磺酸钠溶液的浓度为0.005-0.04mol/L，而且ODS柱的直径为10mm-19mm。
在本发明的优选实施方案中，替曲朵辛原料在醋酸溶液的浓度为40-160mg/mL。
在本发明的优选实施方案中，替曲朵辛溶液的进样量为50-500μL，最好是100-300μL。
在本发明的优选实施方案中，替曲朵辛溶液的流速为4mL/分钟-10mL/分钟。
在本发明的优选实施方案中，在步骤(b)中，可以选择庚烷磺酸钠溶液与甲醇的混合体为流动相。
在本发明的优选实施方案中，庚烷磺酸钠溶液的浓度为0.005-0.04mol/L。
在本发明的优选实施方案中，庚烷磺酸钠溶液与甲醇的比例为200∶1到100∶1。
以下将参考附图对本发明作更为详细的描述，在附图中：
图1是替曲朵辛精制前的处理流程图。
图2是替曲朵辛精制的流程图。
图3是替曲朵辛粗品990705批HPLC含量测定图。
图4是替曲朵辛对照品(第一份样品)HPLC纯度检查图。
图5是替曲朵辛对照品(第一份样品)HPLC纯度检查图。
图6是替曲朵辛对照品(第二份样品)HPLC纯度检查图。
图7是替曲朵辛对照品(第二份样品)HPLC纯度检查图。
图8是替曲朵辛990224批HPLC含量测定图。
图9是替曲朵辛990224批HPLC含量测定图。
图10是替曲朵辛990224批核磁共振氢普图。
图11是替曲朵辛990224批紫外光吸收图谱。
图12是替曲朵辛990224批红外光吸收图谱。
图13是替曲朵辛990224批质谱图。
图14是替曲朵辛990315批HPLC含量测定图。
图15是替曲朵辛990315批HPLC含量测定图。
图16是替曲朵辛990315批核磁共振氢谱图。
图17是替曲朵辛990315批紫外光吸收图谱。
图18是替曲朵辛990315批红外图谱。
图19是替曲朵辛990315批质谱图。
图20是替曲朵辛990319批HPLC含量测定图。
图21是替曲朵辛9903195批HPLC含量测定图。
图22是替曲朵辛990319批核磁共振氢谱图。
图23是替曲朵辛990319批紫外光吸收图谱。
图24是替曲朵辛990319批红外光吸收图谱。
图25是替曲朵辛990319批质谱图。
精制方法依据：
替曲朵辛的精制涉及两个问题，一个问题是除去河豚毒素中不属于替曲朵辛及其类似物的杂质，例如残存的氨基酸、多肽和蛋白质，这些物质和替曲朵辛及其类似物的性质差别较大，可以很容易使用加入有机溶剂的方法或使用醋酸溶解-氨水沉淀的方法除去。
另一个问题，是除去和替曲朵辛共存的类似物，根据文献的报导和我们的经验比较简单的方法是使用HPLC技术。使用反相高效液相色谱的离子对技术报导最多[3]，使用几种柱可以将替曲朵辛和4-表河豚毒素和脱水4-表河豚毒素分开。然后收集流出的替曲朵辛溶液，再加以处理可以获得较纯的河豚毒素。尽管我们从HPLC仪收集的溶液替曲朵辛含量可以达99.9％，但放置和处理时发生转变，所得到固体精品替曲朵辛仍含有少量的类似物。一般情况下替曲朵辛含量在96％以上，从HPLC的色谱图看得很清楚。
精制操作一、替曲朵辛精制前处理
只有当替曲朵辛粗品中替曲朵辛含量低于80％的时候才需要精制前处理。含量低于80％的粗品必须预先处理以除去替曲朵辛中非替曲朵辛和它的类似物的杂质以及少量替曲朵辛的类似物，以免给色谱柱造成损坏。
前处理应首先分析粗品中替曲朵辛的含量。如果其含量低于80％，按能够溶解粗品中的替曲朵辛的量加入稀醋酸，搅拌，使粗品大部分溶解，过滤出不溶物，向滤液中逐滴加入稀NH3水，直到溶液pH值呈碱性，冷却，过滤出沉淀，用去离子水洗沉淀三次，将沉淀在真空中干燥，可得比粗品替曲朵辛含量较高的替曲朵辛结晶。可用类似的方法连续重复处理以达到含量高于80％的要求。精制前处理的流程如图1所示。二、替曲朵辛精制色谱条件：
仪器：高效液相(HPLC)制备系统
柱子：ODS柱
流动相：庚烷磺酸钠水溶液
检测：UV检测器分离与收集：
替曲朵辛粗品用稀乙酸溶解。待柱子平衡后，将替曲朵辛溶液用进样阀定量进样，收集替曲朵辛对应峰的流出液。收集时可以将替曲朵辛对应峰流出液完全收下。若替曲朵辛与杂质分离不完全，按照制备色谱样品峰收集的方法，要将替曲朵辛峰前后与杂质峰的交叉部分不收集。
经过HPLC制备，收集替曲朵辛对应流出峰。替曲朵辛流出液经分析型HPLC分析，替曲朵辛的纯度可达99％(替曲朵辛与原粗品中类似物和其他杂质的相对含量)。沉淀与结晶：
将经过HPLC制备仪收集的替曲朵辛流出液直接在旋转蒸发器内于温热下浓缩，冷却后逐滴加入浓氨水至溶液pH呈碱性，沉淀出大量替曲朵辛，抽滤，用去离子水洗，直到洗至用火焰检查无钠离子黄色火焰存在为止。火焰检查方法是：用白金丝沾上洗沉淀后液体在火焰上灼烧到无钠离子特征的黄色火焰为止，为了正确观察钠离子存在的特征火焰，可以和空白对照。然后，将沉淀溶解于稀乙酸，过滤，用稀氨水中和，调节溶液pH值呈碱性，使替曲朵辛沉淀，过滤，水洗抽干。再重复一次乙酸溶解，氨水沉淀的办法，将水洗抽干后的替曲朵辛结晶和过滤漏斗放在真空干燥器内干燥，待恒重后，收集替曲朵辛精品测定含量。实施例
以下实施例对本发明的方法作出阐释，但无意以任何方式对本发明作出限制。实施例1替曲朵辛精制色谱条件：
仪器：Waters 600 HPLC
柱子：ODS柱(5μ)，250×10mm
流动相：0.01mol/L庚烷磺酸钠水溶液
检测：UV检测器、检测波长201nm。
流速：4毫升/分。
进样量：毒素粗品(含86.17％的替曲朵辛，批号990705)用5％稀乙酸溶解，
加水稀释浓度到40mg/ml，每次进样200μl。分离与收集：
柱子平衡后，样品溶液用进样阀定量进样200微升。收集替曲朵辛对应峰的流出液。收集时可以将替曲朵辛对应峰流出液完全收下。若替曲朵辛与杂质分离不完全，按照制备色谱样品峰收集的方法，要将替曲朵辛峰前后与杂质峰的交叉部分不收集。
经过HPLC制备，收集替曲朵辛对应流出峰。替曲朵辛流出液经分析型HPLC分析，替曲朵辛的纯度可达99％(替曲朵辛与原粗品中类似物和其他杂质的相对含量)。沉淀与结晶：
将经过HPLC制备仪收集的替曲朵辛流出液直接在旋转蒸发器内于温热下浓缩至10毫升，冷却后逐滴加入浓氨水至溶液pH呈碱性，沉淀出大量替曲朵辛，抽滤，用去离子水洗，直到洗至用火焰检查无钠离子黄色火焰存在为止。将沉淀溶解于稀乙酸，过滤，用稀氨水中和，调节溶液pH值呈碱性，使替曲朵辛沉淀，过滤，水洗抽干。再重复一次乙酸溶解，氨水沉淀的办法，将水洗抽干后的替曲朵辛结晶和过滤漏斗放在真空干燥器内干燥，待恒重后，收集替曲朵辛精品送质检部门测定含量。三次样品测定结果如下：
表1 替曲朵辛精品(HPLC精制法)收率和质量情况 批号 投入样品重* (mg)获得精制品重 (mg) 平均得率 (％)含量测定结果 (％) 990224a 990315b 990319c 120 130 212 70 78 130 58 60 61 96.85** 96.77 96.31
a)图谱见图8-13。b)图谱见图14-19。c)图谱见图20-25。
*样品是相对含量为86.17％的替曲朵辛结晶，批号990705，见图3。
**绝对含量化学原料的规格标准：庚烷磺酸钠 纯度＞98.0％ 日本东京化成工业株式会社氨水 分析纯试剂 GB 631-89 广西师范学院化学试剂厂冰乙酸 分析纯试剂 GB 670-90 广西南宁化学试剂厂去离子水 自订标准 南宁枫叶药业有限公司生产参考文献
[1].Munetomo Nakamura and Takeshi Yasumoto，Toxicon，23，271-276(1985)。
[2].T.Goto，Y.Kishi，S.Tahahashi and Y.Hirata Tetrahedron，21，2059-2088(1965)。
[3].赵惠兰、辛修明、单国强、王文秀，中国卫生检验杂志，49，263-265(1994)。