酵母重组株及IFNα-1a干扰素的纯化方法 [技术领域]
本发明涉及分泌表达α-1a干扰素的工程菌株及利用它来生产α-1a干扰素的纯化方法。
[背景技术]
目前，国内生产的α-1a干扰素，多为大肠杆菌表达产物，主要工艺缺陷是：大肠杆菌的表达系统为包含体型，生产过程中需要复性，复性率低，最高为40％，因而比活性低，只有1.0×108单位/毫克蛋白，有较大的副作用；并且，分离纯化中要用价值昂贵的单抗柱，纯度才能达到95％以上；而目前国产的单抗柱，无论在产量和质量上，都不能够满足厂家需要，需要花大量经费进口，生产成本很高。
[发明内容]
为了克服上述缺陷，本发明采用酵母分泌表达系统取代大肠杆菌包涵体表达系统，目标蛋白α-1a干扰素不需要复性，其生物比活性可达到6.0×108单位/毫克蛋白，毒副作用低；在纯化过程中，不需要价值昂贵的单抗柱，即可从发酵液中提取获得纯度达95％以上的目标蛋白α-1a干扰素，降低了生产成本。
α-1a干扰素酵母重组株的构建方法为：将克隆修饰的α-1a干扰素基因插入pGAPZα-A之GAP启动子/α-factor信号肽下游位点，删除Kex2(Lys-Arg)位点之后的Ste13位点(Glu-Ala-Glu-Ala)和启始密码子ATG，构建成α-1a干扰素基因分泌型表达载体；利用澳大利亚Invitrogen公司的Pichia EasyComp Transformation Kit的方法作改进，将α-1a干扰素基因分泌型表达载体转化毕赤氏酵母(Pichia pastoris)的菌株GS115，构建成分泌型表达α-1a干扰素的酵母工程菌株--IFNα-1a/pGAPZα-A/GS115；通过抗生素筛选、SDS-PAGE分析及生物比活性测定，获得目标酵母重组株。
上述的酵母重组株目标蛋白α-1a干扰素的表达量为目标蛋白占分泌总蛋白的50-60％，比活性为1.08×109单位/毫克蛋白；目标蛋白α-1a干扰素具有与天然α-1a干扰素相同的免疫原性。本工程菌株接受外源基因是以整合于基因组形式，这与大肠杆菌、酿酒酵母的独立染色体组外质粒表达体系有显著差别，故本工程菌株较大肠杆菌、酿酒酵母稳定，不易发生外源基因丢失现象，一旦以工程菌作为样品模板，通过PCR、分子杂交等技术鉴定选择出来地阳性菌株一定是真实可靠的，且其目标表达产物α-1a直接表达分泌在培养液中，因此检测其蛋白表达量及目标产物的生物活性非常简易，这较大肠杆菌表达体系—表达产物需复性—优越得多；另外，酵母是一种简单的真核生物，因此其表达后加工模式类似高等真核生物，故用它表达的基因产物不仅具有天然产物相同的生物活性，而且低毒副作用，产品加工成本低，适用性更广。
α-1a干扰素的纯化方法为：利用获得的高产物表达量、高产物活性的酵母重组株进行发酵，离心收集上清液，以醋酸调节pH，过阳离子层析柱，收集目标洗脱峰，加硫酸铵至稍混浊，离心取上清液，过疏水层析柱，收集目标洗脱峰，过阴离子层析柱，收集目标洗脱峰，过Sephacryl分子筛层析柱，收集目标峰，得到α-1a干扰素。
本发明提供的α-1a干扰素的纯化方法，缩短了纯化时间，不需要价格昂贵的单抗柱就可以得到纯度大于95％的α-1a干扰素原液，降低了成本，在工业生产中应用将良好的经济效益。
[附图说明]
附图为α-1a干扰素表达载体构建图。
pGAPZα-A/IFNα-1a表达载体分子大小为3.6kb
pGAPZα-A载体结构为：
磷酸甘油酸脱氢酶基因启动子区域：第1-483bp
磷酸甘油酸脱氢酶基因启动子引物位点：第455-476bp
α-交配因子分泌信号肽序列：第493-759bp
α-交配因子分泌信号肽引物位点：第696-716bp
载体多克隆位点：第760-828bp
myc抗原决定簇包：第827-856bp
多聚组氨酸包：第872-889bp
3’-乙醇氧化酶1基因引物位点：第974-994bp
乙醇氧化酶1转录终止区域：第893-1233bp
转录延伸因子1启动子区域：第1234-1644bp
合成原核启动子：第1645-1712bp
链霉菌zeocin抗性基因阅读框：第1713-2087bp
细胞色素合成酶1转录终止区域：第2088-2405bp
大肠杆菌复制子1(来源于pUC载体)：第2416-3089bp
[具体实施方式]
下面结合实施例详细介绍本发明在α-1a干扰素重组酵母工程菌株的构建和α-1a干扰素纯化工艺中的具体应用。
实施例1
一、IFNα-1a干扰素酵母工程菌的构建
(一)材料：
1.IFNα-1a基因
2.pGAPZα-A、P.pastoris Strain GS115(his4)购自
澳大利亚Invitrogen公司。
(二)方法：
1.基因PCR扩增：
(1)引物设计：在5’端引物中删除Kex2(Lys-Arg)位点
之后的Ste13位点(Glu-Ala-Glu-Ala)和启始密码子ATG。
P1-5’GCTCGAGAAAAGAATGTGTGATCTGCCTCAAACC3’(“ATG”被删除)
Xho I Lys-Arg(Kex2位点)
P2-5’GTCTAGATCATTCCTTACTTCTTAAACT3’
XbaI
(2)热循环：95℃，5’；95℃，30”→49℃，30”→72℃，60”72℃，10’扩增30个循环。
2.PCR扩增产物回收与克隆：
(1)IFNα-1a基因经扩增电泳后获得约521bp的DNA带；
(2)用德国宝灵曼公司生产的PCR产物高纯度试剂盒回收目标片段并进行T-Vector克隆。
3.基因序列分析：采用美国PE公司生产的ABI 377A DNA自动测序仪进行DNA序列分析。
4.酵母分泌型表达载体构建：采用基因克隆技术将α-1a干扰素基因通过XhoI/XbaI插入pGAPZα-A之GAP启动子/α-factor信号肽下游的Xho I/Xba I位点，构建成含α-factor信号肽的分泌型酵母表达载体；表达载体转化GS115(his4)：利用澳大利亚Invitrogen公司生产的PichiaEasyComp Transformation Kit(Cat.No.K1730-01)经稍作改进的方法进行。具体操作如下：(1)挑取毕赤氏酵母(Pichia pastoris)GS115单菌落，在30℃，300转/分钟条件下以YPD+Zeocin100毫克/升培养基振荡培养至OD600＝1.3-1.5；取0.1-0.5毫升菌液至50毫升同样培养基中振荡培养至OD600＝6-8，在5000转/分钟、4℃条件下离心5分钟，去上清液，用10毫升溶液I重悬，制成感受态细胞；(2)取100微升感受态，加入5-10微升线性化的α-1a干扰素重组表达载体，再加400毫升溶液II，混匀后28℃培养1小时，加1毫升YPD，30℃培养1小时；(3)将培养物在5000转/分钟、4℃条件下离心15分钟，去上清，用200毫升溶液III重悬，涂布YPD+Zeocin100毫克/升平板，28-30℃培养24-36小时，产生单菌落。
5.高表达酵母工程菌株的筛选：用Zeocin抗生素筛选获得阳性菌株后，提取工程菌基因组DNA，进一步以引物P1/P2作PCR分析和以德国宝灵公司生产的DiG Labelling and Detection Kit标记α-1a干扰素基因之520bp DNA片段为探针，进行Southern blotting等技术鉴定筛选出阳性菌株，再用SDS-PAGE筛选高表达目标蛋白的IFNα-1a/pGAPZα-A/GS115工程菌株。
实施例2
α-1a干扰素的纯化方法：构建α-1a干扰素酵母工程菌(IFNα-1a/pGAPZα-A/GS115)后，-80℃保存菌种。发酵前，接种平板，使菌种活化，在YPD+Zeocin100毫克/升培养基中，接种单菌落发酵72小时，离心收集发酵上清液，以醋酸调节pH4.0-5.0，过CM Sepharose柱层析，收集0.4摩尔/升氯化钠洗脱峰，加硫酸铵至30％，离心取上清液，过PhenylSepharose柱层析，收集10％硫酸铵洗脱峰，过DEAE Sepharose柱层析，收集0.1摩尔/升氯化钠洗脱峰，过Sephacryl S-200柱层析，收集蛋白峰，得到纯度大于95％的α-1a干扰素原液。