有丝分裂驱动蛋白抑制剂的前体药物
发明背景
本发明涉及为有丝分裂驱动蛋白，特别是有丝分裂驱动蛋白KSP的抑制剂的二氢吡唑化合物的前体药物衍生物，其可用于治疗细胞增殖性疾病，所述的细胞增殖性疾病例如癌症、超常增生、再狭窄、心脏肥厚、免疫病变和炎症。
在用于治疗癌症的治疗剂中有紫杉烷类和长春花生物碱。紫杉烷类和长春花生物碱对存在于各种细胞结构中的微管起作用。微管为有丝分裂纺锤体的主要结构元件。有丝分裂纺锤体负责将基因组的复制拷贝分布至因细胞分裂产生的两个子细胞中的每一个。据推定这些药物使有丝分裂纺锤体破裂导致癌细胞分裂的抑制并且诱导癌细胞死亡。然而，微管形成其它类型的细胞结构，包括神经过程中胞内运输的轨道。因为这些活性剂无法特异性靶向有丝分裂纺锤体，所以它们存在限制其有用性的副作用。
用于治疗癌症的活性剂的特异性的改善因治疗有益性而相当引人关注，如果与给予这些活性剂有关的副作用可以得到减少，那么就可以实现这些治疗有益性。一般来说，治疗癌症中的显著性改善与鉴定通过新机制起作用的治疗剂有关。其实例不仅包括紫杉烷类，而且包括喜树碱类拓扑异构酶I抑制剂。从这两种观点来看，有丝分裂驱动蛋白为新抗癌药的有吸引力的靶标。
有丝分裂驱动蛋白为有丝分裂纺锤体装配和功能所必需的酶，但一般并非诸如神经过程中的其它微管结构的组成部分。有丝分裂驱动蛋白在有丝分裂所有阶段过程中起必需的作用。这些酶为将ATP水解释放的能量转化成驱动细胞货物沿微管定向运动的机械力的″分子发动蛋白″。足以进行该过程的催化结构域为约340个氨基酸的紧密结构。在有丝分裂过程中，驱动蛋白使微管组织为有丝分裂纺锤体的双极结构。驱动蛋白介导染色体沿纺缍体微管运动以及与有丝分裂特定阶段相关的有丝分裂纺锤体的结构改变。有丝分裂驱动蛋白功能的实验性干扰导致有丝分裂纺锤体畸形或机能障碍，通常导致细胞周期停滞和细胞死亡。
在已经鉴定的有丝分裂驱动蛋白中有KSP。KSP属于正极定向的微管发动蛋白的进化保守的驱动蛋白亚族，所述的正端定向的微管发动蛋白装配成由反向平行的同型二聚体组成的双极同型四聚体。在有丝分裂过程中，KSP与有丝分裂纺锤体的微管结合。将针对KSP的抗体显微注射入人体细胞可以防止前中期过程中的纺锤体极分离，从而产生单极纺锤体并且导致有丝分裂停滞且诱导程序性细胞死亡。KSP和在其它非人的生物体中的相关驱动蛋白捆扎反向平行微管并且使它们可以彼此滑动，由此促使两个纺锤体极分开。KSP还可以介导后期中的B纺锤体延长和纺锤体极上的微管集中。
已经描述了Human KSP(也称作HsEg5)[Blangy等，Cell，83：1159-69(1995)；Whitehead等，Arthritis Rheum.，39：1635-42(1996)；Galgio et al.，J.Cell Biol.，135：339-414(1996)；Blangy等，J Biol.Chem.，272：19418-24(1997)；Blangy等，Cell Motil Cytoskeleton，40：174-82(1998)；Whitehead和Rattner，J.Cell Sci.，111：2551-61(1998)；Kaiser等，JBC 274：18925-31(1999)；GenBank accessionnumbers：X85137，NM004523和U37426]，并且描述了KSP基因的片段(TRIP5)[Lee等，Mol Endocrinol.，9：243-54(1995)；GenBankaccession number L40372]。已经报导了Xenopus KSP同源物(Eg5)以及Drosophila K-LP61 F/KRP 130。
近来将某些喹唑酮类描述为KSP抑制剂(PCT Publ.WO 01/30768，2001年5月3日)。
有丝分裂驱动蛋白为用于发现和开发新有丝分裂化疗剂的有吸引力的靶标。因此，本发明的目的在于提供用于抑制有丝分裂驱动蛋白KSP的化合物、方法和组合物。
发明概述
本发明涉及用于治疗细胞增殖性疾病、用于治疗与KSP驱动蛋白活性相关的病症和用于抑制KSP驱动蛋白的二氢吡唑衍生物的前体药物。本发明的化合物可以由通式I表示：
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发明详述
本发明的化合物用于抑制有丝分裂驱动蛋白并且由通式I的化合物或其药物上可接受的盐或立体异构体表示：
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其中：
a独立为0或1；
b独立为0或1；
m独立为0、1或2；
n为0-8；
p为1-6；
u为1、2、3、4或5；
R1选自：
1)(C＝O)C1-C10烷基；
2)(C＝O)芳基；
3)(C＝O)C2-C10链烯基；
4)(C＝O)C2-C10炔基；
5)(C＝O)C3-C8环烷基；
6)(C＝O)杂环基；
7)(C＝O)NR9R10；
8)(C＝O)OC1-C10烷基；
9)SO2 NR9R10；
10)SO2C1-C10烷基；
11)SO2C1-C10芳基；
12)SO2C1-C10杂环基；
13)C1-C10烷基；
14)芳基；
15)杂芳基；
16)(CH2)u(C＝O)C1-C10烷基；
17)(CH2)u(C＝O)NR9R10；
18)3-吡咯烷酮基、3-哌啶酮基、2-环戊酮基、2-环己酮基；
19)(C＝O)(C＝O)C1-C10烷基；
20)(C＝O)(C＝O)NR9R10；
21)(C＝O)(C＝O)OC1-C10烷基；
所述的烷基、芳基、链烯基、炔基、环烷基、杂芳基和杂环基任选地被一个或多个选自R7的取代基取代；或
R2选自：
1)C1-C10烷基；
2)芳基；
3)C2-C10链烯基；
4)C2-C10炔基；
5)C1-C6全氟烷基；
6)C1-C6芳烷基；
7)C1-C6杂芳烷基；
8)C3-C8环烷基；和
9)杂环基；
所述的烷基、芳基、链烯基、炔基、环烷基、芳烷基、杂芳烷基和杂环基任选地被一个或多个选自R7的取代基取代；
R3、R4和R5独立地选自：
1)H；
2)C1-C10烷基；
3)芳基；
4)C2-C10链烯基；
5)C2-C10炔基；
6)C1-C6全氟烷基；
7)C1-C6芳烷基；
8)C3-C8环烷基；和
9)杂环基；
所述的烷基、芳基、链烯基、炔基、环烷基、芳烷基和杂环基任选地被一个或多个选自R7的取代基取代；或
与同一碳原子连接的R3和R4合并成-(CH2)u-，其中碳原子之一任选地被选自O、S(O)m、-N(R9)C(O)-和-N(COR10)-的部分取代；
R7为：
1)(C＝O)aObC1-C10烷基；
2)(C＝O)aOb芳基；
3)C2-C10链烯基；
4)C2-C10炔基；
5)(C＝O)aOb杂环基；
6)CO2H；
7)卤素；
8)CN；
9)OH；
10)ObC1-C6全氟烷基；
11)Oa(C＝O)bNR9R10；
12)S(O)mRa；
13)S(O)2NR9R10；
14)氧代；
15)CHO；
16)(N＝O)R9R10；或
17)(C＝O)aObC3-C8环烷基；
所述的烷基、芳基、链烯基、炔基、杂环基和环烷基任选地被一个或多个选自R8的取代基取代；
R8选自：
1)(C＝O)aOb(C1-C10)烷基；
2)Ob(C1-C3)全氟烷基；
3)(C0-C6)亚烷基-S(O)mRa；
4)氧代；
5)OH；
6)卤素；
7)CN；
8)(C＝O)aOb(C2-C10)链烯基；
9)(C＝O)aOb(C2-C10)炔基；
10)(C＝O)aOb(C3-C6)环烷基；
11)(C＝O)aOb(C0-C6)亚烷基-芳基；
12)(C＝O)aOb(C0-C6)亚烷基-杂环基；
13)(C＝O)aOb(C0-C6)亚烷基-N(Rb)2；
14)C(O)Ra；
15)(C0-C6)亚烷基-CO2Ra；
16)C(O)H；
17)(C0-C6)亚烷基-CO2H；
18)C(O)N(Rb)2；
19)S(O)mRa；
20)S(O)2NR9R10；和
21)C(NH)NH2；
所述的烷基、链烯基、炔基、环烷基、芳基和杂环基任选地被至多三个取代基取代，所述的取代基选自Rb、OH、(C1-C6)烷氧基、卤素、CO2H、CN、O(C＝O)C1-C6烷基、氧代和N(Rb)2；
R9和R10独立地选自：
1)H；
2)(C＝O)ObC1-C10烷基；
3)(C＝O)ObC3-C8环烷基；
4)(C＝O)Ob芳基；
5)(C＝O)Ob杂环基；
6)C1-C10烷基；
7)芳基；
8)C2-C10链烯基；
9)C2-C10炔基；
10)杂环基；
11)C3-C8环烷基；
12)SO2Ra；和
13)(C＝O)NRb2；
所述的烷基、环烷基、芳基、杂环基、链烯基和炔基任选地被一个或多个选自R8的取代基取代；或
R9和R10可以与它们所连接的氮彼此结合成单环或双环杂环，在每个环上带有3-7个成员并且除氮外，任选地含有一个或两个额外的选自N、O和S的杂原子，所述的单环或双环杂环任选地被一个或多个选自R8的取代基取代；
Ra为(C1-C6)烷基、(C3-C6)环烷基、芳基、苄基或杂环基；
Rb为H、(C1-C6)烷基、芳基、杂环基、(C3-C6)环烷基、(C＝O)OC1-C6烷基、(C＝O)C1-C6烷基或S(O)2Ra；和
Rc独立地选自：(C1-C6)烷氧基、新戊酰氧基甲氧基和NRb2；或
两个Rcs可以与它们所连接的磷彼此结合成5-7元的单环杂环，所述的单环杂环任选地被一个、两个或三个选自Rb的取代基取代；
Rd独立地选自H、(C1-C6)烷基、(C3-C6)环烷基、芳基、苄基或杂环基；
Rp选自：-PO(OH)2、-PO(Rc)2、-C(O)CH2CH2CH2OPO(OH)2、C(O)CH2CH2CH2OPO(Rc)2、-CH2OPO(OH)2、-CH2OPO(Rc)2、-C(O)(CHRd)pNRa2、-C(O)(CHRd)pNRa3+、-CH2OC(O)(CHRd)pNRa2、-CH2OC(O)(CHRa)pNRa3+和
![]()
本发明的另一个实施方案由通式II的化合物或其药物上可接受的盐或立体异构体表示：
![]()
其中：
a独立为0或1；
b独立为0或1；
m独立为0、1或2；
n为0-5；
R1选自：
1)(C＝O)C1-C10烷基；
2)(C＝O)芳基；
3)(C＝O)C2-C10链烯基；
4)(C＝O)C2-C10炔基；
5)(C＝O)C3-C8环烷基；
6)(C＝O)杂环基；
7)(C＝O)OC1-C10烷基；
8)(C＝O)NR9R10；
9)SO2NR9R10；
10)SO2C1-C10烷基；
11)SO2C1-C10芳基；
12)SO2C1-C10杂环基；
所述的烷基、芳基、链烯基、炔基、环烷基和杂环基任选地被一个或多个选自R7的取代基取代；或
R2选自：
1)C1-C10烷基；
2)芳基；
3)C2-C10链烯基；
4)C2-C10炔基；
5)C1-C6全氟烷基；
6)C1-C6芳烷基；
7)C3-C8环烷基；和
8)杂环基；
所述的烷基、芳基、链烯基、炔基、环烷基、芳烷基和杂环基任选地被一个或多个选自R7的取代基取代；
R3、R4和R5独立地选自：
1)H；
2)C1-C10烷基；
3)芳基；
4)C2-C10链烯基；
5)C2-C10炔基；
6)C1-C6全氟烷基；
7)C1-C6芳烷基；
8)C3-C8环烷基；和
9)杂环基；
所述的烷基、芳基、链烯基、炔基、环烷基、芳烷基和杂环基任选地被一个或多个选自R7的取代基取代；
R7为：
1)(C＝O)aObC1-C10烷基；
2)(C＝O)aOb芳基；
3)C2-C10链烯基；
4)C2-C10炔基；
5)(C＝O)aOb杂环基；
6)CO2H；
7)卤素；
8)CN；
9)OH；
10)ObC1-C6全氟烷基；
11)Oa(C＝O)bNR9R10；
12)S(O)mRa；
13)S(O)2NR9R10；
14)氧代；
15)CHO；
16)(N＝O)R9R10；或
17)(C＝O)aObC3-C8环烷基；
所述的烷基、芳基、链烯基、炔基、杂环基和环烷基任选地被一个、两个或三个选自R8的取代基取代；
R8选自：
1)(C＝O)aOb(C1-C10)烷基；
2)Ob(C1-C3)全氟烷基；
3)氧代；
4)OH；
5)卤素；
6)CN；
7)(C2-C10)链烯基；
8)(C2-C10)炔基；
9)(C＝O)aOb(C3-C6)环烷基；
10)(C＝O)aOb(C0-C6)亚烷基-芳基；
11)(C＝O)aOb(C0-C6)亚烷基-杂环基；
12)(C＝O)aOb(C0-C6)亚烷基-N(Rb)2；
13)C(O)Ra；
14)(C0-C6)亚烷基-CO2Ra；
15)C(O)H；
16)(C0-C6)亚烷基-CO2H；和
17)C(O)N(Rb)2；
18)S(O)mRa；和
19)S(O)2NR9R10；
所述的烷基、链烯基、炔基、环烷基、芳基和杂环基任选地被至多三个取代基取代，所述的取代基选自Rb、OH、(C1-C6)烷氧基、卤素、CO2H、CN、O(C＝O)C1-C6烷基、氧代和N(Rb)2；
R9和R10独立地选自：
1)H；
2)(C＝O)ObC1-C10烷基；
3)(C＝O)ObC3-C8环烷基；
4)(C＝O)Ob芳基；
5)(C＝O)Ob杂环基；
6)C1-C10烷基；
7)芳基；
8)C2-C10链烯基；
9)C2-C10炔基；
10)杂环基；
11)C3-C8环烷基；
12)SO2Ra；和
13)(C＝O)NRb2；
所述的烷基、环烷基、芳基、杂环基、链烯基和炔基任选地被一个、两个或三个选自R8的取代基取代；或
R9和R10可以与它们所连接的氮彼此结合成单环或双环杂环，在每个环上带有5-7个成员并且除氮外，还任选地含有一个或两个额外的选自N、O和S的杂原子，所述的单环或双环杂环任选地被一个、两个或三个选自R8的取代基取代；
Ra为(C1-C6)烷基、(C3-C6)环烷基、芳基或杂环基；
Rb为H、(C1-C6)烷基、芳基、杂环基、(C3-C6)环烷基、(C＝O)OC1-C6烷基、(C＝O)C1-C6烷基或S(O)2Ra；且
Rc独立地选自：(C1-C6)烷氧基、新戊酰氧基甲氧基和NRb2；或
两个Rcs可以与它们所连接的磷彼此结合成5-7元的单环杂环，所述的单环杂环任选地被一个、两个或三个选自Rb的取代基取代；
RP选自：-PO(OH)2、-PO(Rc)2、-C(O)CH2CH2CH2OPO(OH)2、C(O)CH2CH2CH2OPO(Rc)2、-C(O)CH2NRa2、-C(O)CH2NRa3+、-CH2OC(O)CH2NRa2、-CH2OC(O)CH2NRa3+和![]()
另一个实施方案为如上所述的通式II的化合物或其药物上可接受的盐或立体异构体，其中：
R1选自：
1)(C＝O)C1-C10烷基；
2)(C＝O)芳基；
3)(C＝O)C3-C8环烷基；
4)(C＝O)杂环基；
5)(C＝O)OC1-C10烷基；
6)SO2NR9R10；和
7)SO2C1-C10烷基；
所述的烷基、芳基、环烷基和杂环基任选地被一个、两个或三个选自R7的取代基取代；
R2选自：
1)C1-C10烷基；
2)芳基；和
3)杂芳基；
所述的烷基、芳基和杂芳基任选地被一个或多个选自R7的取代基取代；
R3和R4独立地选自：
1)H；和
2)C1-C10烷基；
所述的烷基任选地被一个或多个选自R7的取代基取代；且
R5选自：
1)H；
2)C1-C10烷基；
3)芳基；和
4)杂环基；
所述的烷基、芳基和杂环基任选地被一个或多个选自R7的取代基取代；
Rp选自：-PO(OH)2、-C(O)CH2CH2CH2OPO(OH)2、-CH2OPO(OH)2、-C(O)CH2NRa2、-C(O)CH2NRa3+、-CH2OC(O)CH2NRa2、-CH2OC(O)CH2NRa3+和![]()
R7、R8、R9、R10、Ra和Rb如上所述。
本发明的另一个实施方案由通式III的化合物或其药物上可接受的盐或立体异构体表示：
![]()
其中：
a独立为0或1；
b独立为0或1；
m独立为0、1或2；
n为0-5；
R1选自：
1)(C＝O)C1-C10烷基；
2)(C＝O)芳基；
3)(C＝O)C2-C10链烯基；
4)(C＝O)C2-C10炔基；
5)(C＝O)C3-C8环烷基；
6)(C＝O)杂环基；
7)(C＝O)OC1-C10烷基；
8)(C＝O)NR9R10；
9)SO2NR9R10；
10)SO2C1-C10烷基；
11)SO2C1-C10芳基；
12)SO2C1-C10杂环基；
所述的烷基、芳基，链烯基，炔基，环烷基，和杂环基任选地被一个或多个选自R7的取代基取代；或
R7a和R7c独立地选自：
1)H；
2)ObC1-C10烷基；
3)卤素；
4)CN；和
5)OH；
所述的烷基任选地被一个、两个或三个选自R8的取代基取代；
R7b为卤素；
R7为：
1)(C＝O)aObC1-C10烷基；
2)(C＝O)aOb芳基；
3)C2-C10链烯基；
4)C2-C10炔基；
5)(C＝O)aOb杂环基；
6)CO2H；
7)卤素；
8)CN；
9)OH；
10)ObC1-C6全氟烷基；
11)Oa(C＝O)bNR9R10；
12)S(O)mRa；
13)S(O)2NR9R10；
14)氧代；
15)CHO；
16)(N＝O)R9R10；或
17)(C＝O)aObC3-C8环烷基；
所述的烷基、芳基、链烯基、炔基、杂环基和环烷基任选地被一个或多个选自R8的取代基取代；
R8选自：
1)(C＝O)aOb(C1-C10)烷基；
2)Ob(C1-C3)全氟烷基；
3)氧代；
4)OH；
5)卤素；
6)CN；
7)(C2-C10)链烯基；
8)(C2-C10)炔基；
9)(C＝O)aOb(C3-C6)环烷基；
10)(C＝O)aOb(C0-C6)亚烷基-芳基；
11)(C＝O)aOb(C0-C6)亚烷基-杂环基；
12)(C＝O)aOb(C0-C6)亚烷基-N(Rb)2；
13)C(O)Ra；
14)(C0-C6)亚烷基-CO2Ra；
15)C(O)H；
16)(C0-C6)亚烷基-CO2H；和
17)C(O)N(Rb)2；
18)S(O)mRa；和
19)S(O)2NR9R10；
所述的烷基、链烯基、炔基、环烷基、芳基和杂环基任选地被至多三个取代基取代，所述的取代基选自Rb、OH、(C1-C6)烷氧基、卤素、CO2H、CN、O(C＝O)C1-C6烷基、氧代和N(Rb)2；
R9和R10独立地选自：
1)H；
2)(C＝O)ObC1-C10烷基；
3)(C＝O)ObC3-C8环烷基；
4)(C＝O)Ob芳基；
5)(C＝O)Ob杂环基；
6)C1-C10烷基；
7)芳基；
8)C2-C10链烯基；
9)C2-C10炔基；
10)杂环基；
11)C3-C8环烷基；
12)SO2Ra；和
13)(C＝O)NRb2；
所述的烷基、环烷基、芳基、杂环基、链烯基和炔基任选地被一个、两个或三个选自R8的取代基取代；或
R9和R10可以与它们所连接的氮彼此结合成单环或双环杂环，在每个环上带有5-7个成员并且除氮外，还任选地含有一个或两个额外的选自N、O和S的杂原子，所述的单环或双环杂环任选地被一个、两个或三个选自R8的取代基取代；
Ra独立地选自：(C1-C6)烷基、(C3-C6)环烷基、芳基和杂环基；
Rb独立地选自：H、(C1-C6)烷基、芳基、杂环基、(C3-C6)环烷基、(C＝O)OC1-C6烷基、(C＝O)C1-C6烷基或S(O)2Ra；和
Rp选自：-PO(OH)2、-C(O)CH2CH2CH2OPO(OH)2、-CH2OPO(OH)2、-C(O)CH2NRa2、-C(O)CH2NRa3+、-CH2OC(O)CH2NRa2、-CH2OC(O)CH2NRa3+和![]()
本发明的另一个实施方案由通式IV的化合物或其药物上可接受的盐或立体异构体表示：
![]()
其中：
a独立为0或1；
b独立为0或1；
m独立为0、1或2；
n为0-5；
R7a和R7c独立地选自：
1)ObC1-C10烷基；
2)卤素；
3)CN；和
4)OH；
所述的烷基任选地被一个、两个或三个选自R8的取代基取代；
R7b为卤素；
R7为：
1)(C＝O)aObC1-C10烷基；
2)(C＝O)aOb芳基；
3)C2-C10链烯基；
4)C2-C10炔基；
5)(C＝O)aOb杂环基；
6)CO2H；
7)卤素；
8)CN；
9)OH；
10)ObC1-C6全氟烷基；
11)Oa(C＝O)bNR9R10；
12)S(O)mRa；
13)S(O)2NR9R10；
14)氧代；
15)CHO；
16)(N＝O)R9R10；或
17)(C＝O)aObC3-C8环烷基；
所述的烷基、芳基、链烯基、炔基、杂环基和环烷基任选地被一个或多个选自R8的取代基取代；
R8选自：
1)(C＝O)aOb(C1-C10)烷基；
2)Ob(C1-C3)全氟烷基；
3)氧代；
4)OH；
5)卤素，
6)CN；
7)(C2-C10)链烯基；
8)(C2-C10)炔基；
9)(C＝O)aOb(C3-C6)环烷基；
10)(C＝O)aOb(C0-C6)亚烷基-芳基；
11)(C＝O)aOb(C0-C6)亚烷基-杂环基；
12)(C＝O)aOb(C0-C6)亚烷基-N(Rb)2；
13)C(O)Ra；
14)(C0-C6)亚烷基-CO2Ra；
15)C(O)H；
16)(C0-C6)亚烷基-CO2H；和
17)C(O)N(Rb)2；
18)S(O)mRa；和
19)S(O)2NR9R10；
所述的烷基、链烯基、炔基、环烷基、芳基和杂环基任选地被至多三个取代基取代，所述的取代基选自Rb、OH、(C1-C6)烷氧基、卤素、CO2H、CN、O(C＝O)C1-C6烷基、氧代和N(Rb)2；
R9和R10独立地选自：
1)H；
2)(C＝O)ObC1-C10烷基；
3)(C＝O)ObC3-C8环烷基；
4)(C＝O)Ob芳基；
5)(C＝O)Ob杂环基；
6)C1-C10烷基；
7)芳基；
8)C2-C10链烯基；
9)C2-C10炔基；
10)杂环基；
11)C3-C8环烷基；
12)SO2Ra；和
13)(C＝O)NRb2；
所述的烷基、环烷基、芳基、杂环基、链烯基将炔基任选地被一个、两个或三个选自R8的取代基取代；或
R9和R10可以与它们所连接的氮彼此结合成单环或双环杂环，在每个环上带有5-7个成员并且除氮外，还任选地含有一个或两个额外的选自N、O和S的杂原子，所述的单环或双环杂环任选地被一个、两个或三个选自R8的取代基取代；
R11选自：
1)C1-C10烷基；
2)芳基；
3)C3-C8环烷基；
4)杂环基；
所述的烷基、芳基、环烷基和杂环基任选地被一个或多个选自R10的取代基取代；或
Ra独立地选自：(C1-C6)烷基、(C3-C6)环烷基、芳基和杂环基；且
Rb独立地选自：H、(C1-C6)烷基、芳基、杂环基、(C3-C6)环烷基、(C＝O)OC1-C6烷基、(C＝O)C1-C6烷基或S(O)2Ra。
本发明化合物的具体实例包括：
3-[(5S)-1-乙酰基-3-(2，5-二氟苯基)-5-苯基-4，5-二氢-1H-吡唑-5-基]丙-1-醇；
3-[(5S)-1-乙酰基-3-(2，5-二氟苯基)-5-苯基-4，5-二氢-1H-吡唑-5-基]丙基二氢磷酸酯；
2-[(5R)-1-乙酰基-3-(2-氟-5-甲基苯基)-5-苯基-4，5-二氢-1H-吡唑-5-基]乙醇；
2-[(5R)-1-乙酰基-3-(2-氟-5-甲基苯基)-5-苯基-4，5-二氢-1H-吡唑-5-基]乙基二氢磷酸酯；
2-[(5R)-1-乙酰基-3-(2-氟-5-甲基苯基)-5-苯基-4，5-二氢-1H-吡唑-5-基]丙-1-醇；
2-[(5R)-1-乙酰基-3-(2-氟-5-甲基苯基)-5-苯基-4，5-二氢-1H-吡唑-5-基]丙基二氢磷酸酯；
2-[(5R)-1-乙酰基-3-(2-氟-5-甲基苯基)-5-苯基-4，5-二氢-1H-吡唑-5-基]丁-1-醇；
2-[(5R)-1-乙酰基-3-(2-氟-5-甲基苯基)-5-苯基-4，5-二氢-1H-吡唑-5-基]丁基二氢磷酸酯；
3-[(5S)-1-乙酰基-3-(5-溴-2-氟苯基)-5-苯基-4，5-二氢-1H-吡唑-5-基]丙-1-醇；和
3-[(5S)-1-乙酰基-3-(5-溴-2-氟苯基)-5-苯基-4，5-二氢-1H-吡唑-5-基]丙基二氢磷酸酯；
或其药物上可接受的盐或立体异构体。
本发明的化合物可以带有不对称中心、手性轴和手性平面(如：E.L.Eliel和S.H.Wilen，Stereochemistry of Carbon Compounds，JohnWiley & Sons，New York，1994，1119-1190页中所述)并且作为外消旋物、外消旋混合物和各非对映体出现，所有可能的异构体及其混合物，包括旋光异构体，所有这类立体异构体都包括在本发明中。此外，本文披露的化合物可以作为互变体存在并且两种互变异构形式均包括在本发明范围内，即使仅描述一种互变异构体结构。
当任意的变量(例如R7、R8、Rb等)在任何成分上出现一次以上时，其在每次出现时的定义与另一次出现时的定义彼此独立。此外，取代基和变量的组合是允许的，条件是这类组合产生稳定的化合物。从取代基上向下拉入环系的线表示所示的键可以与可取代的环原子中的任意一个连接。如果环系为多环，那么其含义是键仅与相邻环上的合适的碳原子中的任意一个连接。
可以理解本发明化合物上的取代基和取代模式可以由本领域技术人员选择，以便提供化学上稳定的并且易于通过本领域中公知的技术以及下述方法由易于获得的原料合成的化合物。如果取代基自身被一个以上基团取代，那么应理解这些多个基团可以位于同一碳或不同的碳上，只要产生稳定的结构。术语“任选地被一个或多个取代基取代”应与术语“任选地被至少一个取代基取代”等同，并且在这类情况中，优选的实施方案为带有0-3个取代基。
本文所用的″烷基″用以包括带有给定数量的碳原子的支链和直链饱和脂族烃基。例如，将“C1-C10烷基”中的C1-C10定义为包括在直链或支链排列的带有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个碳的基团。例如，“C1-C10烷基”特别包括甲基、乙基、正-丙基、异-丙基、正-丁基、叔-丁基、异-丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基等。术语“环烷基”指的是带有给定数量碳原子的单环饱和脂族烃基。例如，“环烷基”包括环丙基、甲基-环丙基、2，2-二甲基-环丁基、2-乙基-环戊基、环己基等。在本发明的一个实施方案中，术语“环烷基”包括上述基团并且进一步包括单环不饱和脂族烃基。例如，在该实施方案中定义的“环烷基”包括环丙基、甲基-环丙基，2，2-二甲基-环丁基、2-乙基-环戊基、环己基、环戊烯基、环丁烯基等。
术语“亚烷基”指的是带有指定数量碳原子的双自由烃基。例如，“亚烷基”包括-CH2-、-CH2CH2-等。
当在术语“C1-C6芳烷基”和“C1-C6杂芳烷基”中使用时，术语“C1-C6”指的是该部分中的烷基部分并且不描述该部分的芳基和杂芳基部分中的原子数量。
″烷氧基″表示通过氧桥连接的指明碳原子数的环或非-环烷基。“烷氧基”由此包括上述烷基和环烷基的定义。
如果未指定碳原子数，术语“链烯基”指的是含有2-10个碳原子和至少一个碳碳双键的直链、支链或环状的非-芳族烃基。优选存在一个碳碳双键并且可以存在至多四个非-芳族碳碳双键。因此，“C2-C6链烯基”指的是带有2-6个碳原子的链烯基。链烯基包括乙烯基、丙烯基、丁烯基、2-甲基丁烯基和环己烯基。链烯基的直链、支链或环状部分可以含有双键，并且如果指定取代的链烯基，那么可以被取代。
术语“炔基”指的是含有2-10个碳原子和至少一个碳碳三键的直链、支链或环状烃基。至多可以存在三个碳-碳三键。因此，“C2-C6炔基”指的是带有2-6个碳原子的炔基。炔基包括乙炔基、丙炔基、丁炔基、3-甲基丁炔基等。炔基的直链、支链或环状部分可以含有三键，并且如果指定取代的炔基，那么可以被取代。
在某些情况中，使用包括0的碳范围定义取代基，诸如(C0-C6)亚烷基-芳基。如果将芳基定为苯基，那么该定义包括苯基自身以及-CH2Ph、-CH2CH2Ph、CH(CH3)CH2CH(CH3)Ph等。
本文所用的″芳基″用以指各环上至多7个原子的任意稳定的单环或双环碳环，其中至少一个环为芳族环。这类芳基要素的实例包括苯基、萘基、四氢萘基、茚满基和联苯基。在芳基取代基为双环且一个环为非-芳族环的情况中，应理解通过芳族环连接。
本文所用的术语杂芳基表示各环上至多7个原子的稳定单环或双环，其中至少一个环为芳族环且含有1-4个选自O、N和S组成的组的杂原子。该定义范围内的杂芳基包括，但不限于：吖啶基、咔唑基、噌啉基、喹喔啉基、吡唑基、吲哚基、苯并三唑基、呋喃基、噻吩基、苯并噻吩基、苯并呋喃基、喹啉基、异喹啉基、唑基、异唑基、吲哚基、吡嗪基、哒嗪基、吡啶基、嘧啶基、吡咯基、四氢喹啉。类似于下文的杂环的定义，还可以将“杂芳基”理解为包括任意含氮的杂芳基的N-氧化物衍生物。在杂芳基取代基为双环且一个环为非-芳族环或不含杂原子的情况中，应理解分别通过芳族环或通过含杂原子的环连接。
本文所用的术语″杂环″或“杂环基”用以指含有1-4个选自O、N和S组成的组的杂原子的3-至10-元芳族或非芳族杂环并且包括双环基团。“杂环基”由此包括上述杂芳基及其二氢和四氢类似物。“杂环基”的额外的实例包括，但不限于如下基团：氮杂环丁烷基、苯并咪唑基、苯并呋喃基、苯并呋咱基、苯并吡唑基、苯并三唑基、苯并苯硫基、苯并唑基、咔唑基、咔啉基、噌啉基、呋喃基、咪唑基、二氢吲哚基、吲哚基、indolazinyl、吲唑基、异苯并呋喃基、异吲哚基、异喹啉基、异噻唑基、异唑基、萘啶基、二唑基、唑基、唑啉、异唑啉、氧杂环丁烷基、吡喃基、吡嗪基、吡唑基、哒嗪基、吡啶并吡啶基、哒嗪基、吡啶基、嘧啶基、吡咯基、喹唑啉基、喹啉基、喹喔啉基、四氢吡喃基、四氢硫代吡喃基、四氢异喹啉基、四唑基、四唑并吡啶基、噻二唑基、噻唑基、噻吩基、噻唑基、1，4-二烷基、六氢吖庚因基、哌嗪基、哌啶基、吡啶-2-酮基、吡咯烷基、吗啉基、硫代吗啉基、二氢苯并咪唑基、二氢苯并呋喃基、二氢苯并苯硫基、二氢苯并唑基、二氢呋喃基、二氢咪唑基、二氢吲哚基、二氢异唑基、二氢异噻唑基、二氢二唑基、二氢唑基、二氢吡嗪基、二氢吡唑基、二氢吡啶基、二氢嘧啶基、二氢吡咯基、二氢喹啉基、二氢四唑基、二氢噻二唑基、二氢噻唑基、二氢噻吩基、二氢三唑基、二氢氮杂环丁烷基、亚甲基二氧基苯甲酰基、四氢呋喃基和四氢噻吩基及其N-氧化物。可以通过碳原子或通过杂原子连接杂环基取代基。
在一个实施方案中，本文所用的术语″杂环″或“杂环基”用以指含有1-4个选自O、N和S组成的组的杂原子的5-至10-元芳族或非芳族杂环，并且包括双环基。在该实施方案中的“杂环基”由此包括上述杂芳基及其二氢和四氢类似物。“杂环基”的额外的实例包括，但不限于如下基团：苯并咪唑基、苯并呋喃基、苯并呋咱基、苯并吡唑基、苯并三唑基、苯并苯硫基、苯并唑基、咔唑基、咔啉基、噌啉基、呋喃基、咪唑基、二氢吲哚基、吲哚基、indolazinyl、吲唑基、异苯并呋喃基、异吲哚基、异喹啉基、异噻唑基、异唑基、萘啶基、二唑基、唑基、唑啉、异唑啉、氧杂环丁烷基、吡喃基、吡嗪基、吡唑基、哒嗪基、吡啶并吡啶基、哒嗪基、吡啶基、嘧啶基、吡咯基、喹唑啉基、喹啉基、喹喔啉基、四氢吡喃基、四氢硫代吡喃基、四氢异喹啉基、四唑基、四唑并吡啶基、噻二唑基、噻唑基、噻吩基、噻唑基、氮杂环丁烷基、1，4-二烷基、六氢吖庚因基、哌嗪基、哌啶基、吡啶-2-酮基、吡咯烷基、吗啉基、硫代吗啉基、二氢苯并咪唑基、二氢苯并呋喃基、二氢苯并苯硫基、二氢苯并唑基、二氢呋喃基、二氢咪唑基、二氢吲哚基、二氢异唑基、二氢异噻唑基、二氢二唑基、二氢唑基、二氢吡嗪基、二氢吡唑基、二氢吡啶基、二氢嘧啶基、二氢吡咯基、二氢喹啉基、二氢四唑基、二氢噻二唑基、二氢噻唑基、二氢噻吩基、二氢三唑基、二氢氮杂环丁烷基、亚甲二氧基苯甲酰基、四氢呋喃基和四氢噻吩基及其N-氧化物。可以通过碳原子或通过杂原子连接杂环基取代基。
在另一个实施方案中，杂环选自2-吖庚因酮、苯并咪唑基、2-二吖庚因酮、咪唑基、2-咪唑烷酮、吲哚基、异喹啉基、吗啉基、哌啶基、哌嗪基、吡啶基、吡咯烷基、2-哌啶酮、2-嘧啶酮、2-吡咯烷酮、喹啉基、四氢呋喃基、四氢异喹啉基和噻吩基。
正如本领域技术人员可以理解的，本文所用的“卤素(halo)”或“卤素(halogen)”用以包括氯、氟、溴和碘。
除非另有说明，所述的烷基、链烯基、炔基、环烷基、芳基、杂芳基和杂环基取代基可以被取代或未被取代。例如，(C1-C6)烷基可以被一个、两个或三个取代基取代，所述的取代基选自OH、氧代、卤素、烷氧基、二烷基氨基或杂环基，诸如吗啉基、哌啶基等。在这种情况中，如果一个取代基为氧代，而另一个为OH，那么定义中包括如下基团：
-C＝O)CH2CH(OH)CH3、-(C＝O)OH，-CH2(OH)CH2CH(O)等。
在同一碳原子上的R3和R4定义中合并成-(CH2)u-时形成的部分表示如下：
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此外，这类环状部分可以任选地包括杂原子。这类含杂原子的环状部分的实例包括，但不限于：
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在某些情况中，定义了R9和R10，使得它们可以与它们所连接的氮彼此结合成在每个环上带有5-7个成员并且除氮外，还可以任选地含有一个或两个额外的选自N、O和S的杂原子的单环或双环杂环，所述的杂环任选地被一个或多个选自R11的取代基取代。由此可以形成的杂环的实例包括，但不限于如下基团，谨记杂环任选地被一个或多个(且优选一个、两个或三个)选自R11的取代基取代：
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在某些情况中，定义了两个Rcs，使得它们可以与它们所连接的磷彼此结合成在环上带有5-7个成员的杂环，所述的杂环任选地被一个或多个选自Rb的取代基取代。由此可以形成的杂环的实例包括，但不限于如下基团，谨记杂环任选地被一个或多个(且优选一个或两个)选自Rb的取代基取代：
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在一个实施方案中，n为1、2或3。
在一个实施方案中，R1选自(C＝O)C1-C10烷基、(C＝O)芳基、(C＝O)C3-C8环烷基和-(C＝O)杂芳基，它们任选地被1-3个选自R7的取代基取代。在该实施方案的另一个方面中，R1为(C＝O)C1-C10烷基。
在一个实施方案中，R2选自芳基，它任选地被1-3个选自R7的取代基取代。在该实施方案的另一个方面中，R2为苯基，它任选地被1-3个选自卤素和C1-C6烷基的取代基取代。
在一个实施方案中，R3和R4为H。
在一个实施方案中，R5选自芳基，它任选地被1-3个选自R10的取代基取代。在该实施方案的另一个方面中，R5为苯基，它任选地被1-3个选自卤素和-OH的取代基取代。在该实施方案的另一个方面中，R5为苯基，它任选地被1-3个选自卤素的取代基取代。
在一个实施方案中，Rp为-P(O)(OH)2。
在通式IV化合物的一个实施方案中，R11为C1-C6烷基。在通式IV化合物的另一个实施方案中，R11为甲基。
在通式IV化合物的一个实施方案中，R7a和R7c独立地选自C1-C6烷基、卤素和OH。
在通式IV化合物的一个实施方案中，R7b为F。
在通式IV化合物的一个实施方案中，n为1、2或3。
本发明包括通式I化合物的游离形式及其药物上可接受的盐和立体异构体。本文中例举的具体化合物中的某些为胺化合物的质子化盐。术语“游离形式”指的是非-盐形式的胺化合物。包括的药物上可接受的盐不仅包括本文所述具体化合物的例举的盐，而且包括通式I化合物的游离形式的所有典型药物上可接受的盐。可以使用本领域公知的技术分离所述具体盐化合物的游离形式。例如，可以通过用合适的稀碱水溶液，诸如稀NaOH水溶液、碳酸钾、氨和碳酸氢钠处理以再生游离形式。游离形式在一定程度上在某些物理特性方面不同于其相应的盐形式，诸如在极性溶剂中的溶解度，但就本发明的目的而言，酸式和碱式盐在其它方面与其相应的游离形式等效。
可以通过常规化学方法，由含有碱性或酸性部分的本发明化合物合成本发明化合物的药物上可接受的盐。一般来说，通过离子交换色谱法或通过使游离碱与化学计算量或过量的所希望的成盐无机酸或有机酸在合适的溶剂或不同的溶剂组合中反应来合成碱性化合物的盐。类似地，通过与合适的无机碱或有机碱反应形成酸性化合物的盐。
因此，本发明化合物的药物上可接受的盐包括通过使本发明碱性化合物与无机酸或有机酸反应形成的本发明化合物的常用无毒性盐。例如，常用的无毒性盐包括那些来源于无机酸的盐，所述的无机酸诸如盐酸、氢溴酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸、硝酸等，以及由有机酸制备的盐，所述的有机酸诸如乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、硬脂酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、扑酸、马来酸、羟基马来酸、苯乙酸、谷氨酸、苯甲酸、水杨酸、对氨基苯磺酸、2-乙酰氧基-苯甲酸、富马酸、甲苯磺酸、甲磺酸、乙二磺酸、草酸、羟乙磺酸、三氟乙酸等。
当本发明的化合物为酸性时，合适的“药物上可接受的盐”指的是由药物上可接受的无毒性的碱，包括无机碱和有机碱制备的盐。本发明特别包括本发明化合物磷酸酯部分的一-和二取代盐。来源于无机碱的盐包括铝、铵、钙、铜、铁、亚铁、锂、镁、锰盐、亚锰、钾、钠、锌等。特别优选铝、钙、镁、钾和钠盐。来源于药物上可接受的有机无毒性碱的盐包括如下化合物的盐：伯、仲和叔胺类，取代的胺类，包括天然存在的取代的胺类，环状胺类和碱性离子交换树脂，诸如精氨酸、甜菜碱、咖啡因、胆碱、N，N1-二苄基乙二胺、二乙胺、2-二乙氨基乙醇、2-二甲氨基乙醇、乙醇胺、乙二胺、N-乙基吗啉、N-乙基哌啶、葡糖胺(glucamine)、葡糖胺(glucosamine)、组氨酸、海巴明(hydrabamine)、异丙胺、赖氨酸、甲基葡糖胺、吗啉、哌嗪、哌啶、聚胺树脂、普鲁卡因、嘌呤类、可可碱、三乙胺、三甲胺、三丙胺、氨丁三醇等。当本发明的化合物为酸性时，术语“游离形式”指的是非-盐形式的化合物，使得酸性官能基仍然质子化。
Berg等在“药用盐”-J.Pharm.Sci.，1977：66：1-19中更完整地描述了上述药物上可接受的盐和其它典型药物上可接受的盐的制备。
还注意到本发明的化合物可能为内盐或两性离子，因为在生理条件下，化合物中的去质子化酸性部分，诸如羧基可以为阴离子，并且这种电荷随后可以在内部与质子化或烷基化碱性部分，诸如四价氮原子的阳离子电荷平衡掉。带有内部平衡电荷且由此不与分子间抗衡离子结合的分离的化合物也可以被视为化合物的“游离形式”。
可以通过使用如下文方案中所示的反应与其它文献中公知或实验操作步骤中例举的标准操作制备本发明的化合物。因此，下文的解释性方案并不限于所列的化合物或任何用于解释目的的特定的取代基。如方案中所示的取代基编号不一定与权利要求中使用的编号相关，并且通常为了清楚起见，在上文通式I的定义允许多个取代基时，显示单一取代基与化合物连接。
方案
正如方案A中所示，适当取代的苯基异羟肟酸酯A-1与适当取代的乙炔A-2反应生成苯甲酰基炔中间体A-3。适当取代的苯基的铜介导的偶联生成中间体A-4。然后在有酰基氯存在下中间体A-4可以与肼反应而生成N-酰基二氢吡唑A-5。使末端羟基脱保护而得到本发明的化合物A-6。
方案B表示使用可选羟基保护基制备本发明化合物B-5的类似系列反应。该方案还解释了磷酸酯前体药物B-6的形成。
方案C-G解释了本发明化合物的其它前体药物部分的引入。
方案A
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方案B
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方案C
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方案E
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方案F
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方案G
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应用
本发明的化合物可应用于各种用途。正如本领域技术人员可以理解的，可以按照各种方式改变有丝分裂；即可以通过增加或减少有丝分裂途径中的成分的活性来影响有丝分裂。换句话说，可以通过打破平衡，即通过抑制或活化某些成分影响(例如破坏)有丝分裂。类似的手段可以用于改变减数分裂。
在一个实施方案中，本发明的化合物用于调节有丝分裂纺锤体形成，由此导致有丝分裂中的细胞周期停滞延长。本文中所谓的″调节″指的是改变有丝分裂纺锤体形成，包括增加和减少纺锤体形成。本文中所谓的″有丝分裂纺锤体形成″指的是有丝分裂驱动蛋白使微管组织为双极结构。本文中所谓的″有丝分裂纺锤体机能障碍″指的是有丝分裂停滞和单极纺锤体形成。
本发明的化合物用于结合和/或调节有丝分裂驱动蛋白活性。在一个实施方案中，有丝分裂驱动蛋白为有丝分裂驱动蛋白bimC亚家族中的成员(如美国专利US 6,284,480第5栏中所述)。在另一个实施方案中，有丝分裂驱动蛋白为人KSP，不过，还可以用本发明的化合物调节来自其它生物体的有丝分裂驱动蛋白活性。在该上下文中，调节指的是增加或减少纺锤体极分离，从而导致有丝分裂纺锤体极的畸形，即展开，或者导致有丝分裂纺锤体形态紊乱。在用于这些目的的KSP定义内还包括KSP的变体(avariants)和/或片段。此外，可以用本发明的化合物抑制其它有丝分裂驱动蛋白。
本发明的化合物用于治疗细胞增殖性疾病。可以用本文提供的方法和组合物治疗的疾病状态包括，但不限于：癌症(如下所述)；自身免疫性疾病；关节炎；移植物排斥；炎症性肠病；医疗操作，包括，但不限于手术、血管成形术等后诱导的增殖。可以理解在某些情况中，细胞可以不处于增殖过度或增殖低下状态(异常状态)，但仍然需要治疗。例如，在创伤愈合过程中，细胞可以″正常″增殖，但增殖促进可以为理想的。类似地，如上所述，在农业领域中，细胞可以处于“正常″状态，但需要增殖调节以便通过直接促进作物生长或通过抑制对作物产生不良影响的植物或生物体的生长来提高作物产量。因此，在一个实施方案中，本发明包括在患有或可能最终患有这些病症或状态中的任意一种的细胞或个体中的应用。
特别认为本文提供的化合物、组合物和方法可用于治疗癌症，包括实体瘤，例如皮肤、乳腺、脑、宫颈癌、睾丸癌等。特别地，可以用本发明化合物、组合物和方法治疗的癌症包括，但不限于：心脏：肉瘤(血管肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、脂肉瘤)、粘液瘤、横纹肌瘤、纤维瘤、脂肪瘤和畸胎瘤；肺：支气管癌(鳞状上皮细胞、未分化的小细胞、未分化的大细胞、腺癌)、肺泡(细支气管)癌、支气管腺瘤、肉瘤、淋巴瘤、软骨错构瘤、间皮瘤；胃肠：食道(鳞状上皮细胞癌、腺癌、平滑肌肉瘤、淋巴瘤)、胃(癌、淋巴瘤、平滑肌肉瘤)、胰腺(导管腺癌、胰岛素瘤、胰高血糖素瘤、胃泌素瘤、类癌瘤、血管活性肠肽肿瘤)、小肠(腺癌、淋巴瘤、类癌瘤、卡波西肉瘤、平滑肌瘤、血管瘤、脂肪瘤、神经纤维瘤、纤维瘤)、大肠(腺癌、管状腺瘤、绒毛状腺瘤、错构瘤、平滑肌瘤)； 生殖泌尿道： 肾(腺癌、肾母细胞瘤[肾胚细胞瘤]、淋巴瘤、白血病)、膀胱和尿道(鳞状上皮细胞癌、移行细胞癌、腺癌)、前列腺(腺癌、肉瘤)、睾丸(精原细胞瘤、畸胎瘤、胚胎癌、畸胎癌、绒毛膜癌、肉瘤、间质细胞癌、纤维瘤、纤维腺瘤、腺瘤样瘤、脂肪瘤)；肝：肝癌(肝细胞癌)、胆管癌、肝毒细胞瘤、血管肉瘤、肝细胞腺瘤、血管瘤；骨：骨源性肉瘤(骨肉瘤)、纤维肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、软骨肉瘤、尤因肉瘤、恶性淋巴瘤(网状细胞肉瘤)、多发性骨髓瘤、恶性巨细胞瘤、脊索瘤、骨软骨瘤(osteochronfroma)(骨软骨外生骨疣)、良性软骨瘤、成软骨细胞瘤、软骨粘液纤维瘤、骨样骨瘤和巨细胞瘤；神经系统：颅骨(骨瘤、血管瘤、肉芽肿、黄色瘤、畸形性骨炎)、脑膜(脑膜瘤、脑膜肉瘤、神经胶质瘤病)、脑(星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、神经胶质瘤、室管膜瘤、生殖细胞瘤[松果体瘤]、多形成胶质细胞瘤(gioblastomas)、少突神经胶质瘤、神经鞘瘤、视网膜成神经细胞瘤、先天性肿瘤)、脊髓神经纤维瘤、脑膜瘤、神经胶质瘤、肉瘤)；妇科：子宫(子宫内膜癌)、宫颈(宫颈癌、肿瘤前期宫颈非典型增生)、卵巢(卵巢癌[浆液性囊腺癌、粘液性囊腺癌、未分类的癌]、粒层-鞘细胞瘤、塞尔托利-莱迪希细胞瘤、无性细胞瘤、恶性畸胎瘤)、女阴(鳞状上皮细胞癌、上皮内癌、腺癌、纤维肉瘤、黑素瘤)、阴道(透明细胞癌、鳞状上皮细胞癌、葡萄状肉瘤(胚胎性横纹肌肉瘤)、输卵管(癌)；血液：血液(髓细胞性白血病[急性和慢性]、急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、骨髓增生性疾病、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征)、何杰金病、非何杰金淋巴瘤[恶性淋巴瘤]；皮肤：恶性黑素瘤、基底细胞癌、鳞状上皮细胞癌、卡波西肉瘤、发育不良痣、脂肪瘤、血管瘤、皮肤纤维瘤、瘢痕瘤、银屑病；和肾上腺：成神经细胞瘤。因此，本文提供的术语″癌性细胞″包括患有上文所列的疾病中任意一种的细胞。
正如美国专利US6,284,480中所述，本发明的化合物还可以通过调节bimC驱动蛋白亚群中的真菌成员的活性而用作抗真菌药。
可以将本发明的化合物单独或按照标准药物实践与药物上可接受的载体、赋形剂或稀释剂组合以药物组合物的形式对哺乳动物，优选对人给药。可以通过口服或非肠道，包括静脉内、肌内、腹膜内、皮下、直肠和局部给药途径给予所述的化合物。
含有活性组分的药物组合物可以为适合于口服应用的形式，例如，作为片剂、药片、锭剂、水或油混悬液、可分散粉末或颗粒、乳剂、硬或软胶囊或糖浆剂或酏剂。可以按照制备药物组合物领域中公知的任意方法制备用于口服应用的组合物，并且这类组合物可以含有一种或多种选自增甜剂、矫味剂、着色剂和防腐剂组成的组的试剂，以便制成药学上优雅和适口的药物制剂。片剂含有活性组分与适合于制备片剂的无毒性药物上可接受的赋形剂的混合物。这些赋形剂可以为：例如，惰性稀释剂，例如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；成粒剂和崩解剂，例如，微晶纤维素、交联羧甲基纤维素钠、玉米淀粉或藻酸；粘合剂，例如淀粉、明胶、聚乙烯吡咯烷酮或阿拉伯胶；和润滑剂，例如，硬脂酸镁、硬脂酸或滑石粉。可以不给片剂包衣或可以通过公知技术给它们包衣，以便掩蔽药物不适的味道或延缓在胃肠道中的崩解和吸收，由此在较长时间期限内提供持续作用。例如，可以使用水溶性掩蔽味道的物质，诸如羟丙基甲基纤维素或羟丙基纤维素，或延时物质，诸如乙基纤维素、乙酸丁酸纤维素。
还可以将口服使用的制剂制成硬明胶胶囊，其中将活性组分与惰性固体稀释剂混合，例如，碳酸钙、磷酸钙或高岭土，或制成软明胶胶囊，其中将活性组分与水溶性载体混合，诸如聚乙二醇或油介质，例如花生油、液体石蜡或橄榄油。
含水混悬液含有活性物质与适合于制备含水混悬液的赋形剂的混合物。这类赋形剂为悬浮剂，例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基-纤维素、藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、西黄蓍胶和阿拉伯树胶；分散剂或湿润剂可以为天然存在的磷脂，例如卵磷脂；或烯化氧与脂肪酸的缩合产物，例如聚氧乙烯硬脂酸酯；或环氧乙烷与长链脂族醇类的缩合产物，例如十七乙烯氧基鲸蜡醇；或环氧乙烷与来源于脂肪酸和己糖醇的偏酯类的缩合产物，例如聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯，或环氧乙烷与来源于脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物，例如聚乙烯失水山梨糖醇单油酸酯。含水混悬液还可以含有：一种或多种防腐剂，例如对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸正丙酯；一种或多种着色剂；或一种或多种矫味剂；和一种或多种增甜剂，诸如蔗糖、糖精或阿司帕坦。
可以通过将活性组分悬浮于植物油中，例如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油或矿物油，诸如液体石蜡来配制油混悬液。油混悬液可以含有增稠剂，例如蜂蜡、硬石蜡或鲸蜡醇。可以加入诸如如上所述的增甜剂和矫味剂以便制成适口的口服制剂。可以通过添加抗氧化剂，诸如丁羟茴醚或α生育酚给这些组合物防腐。
适合于通过添加水制备含水(aqueous)混悬液的可分散粉末和颗粒提供了活性组分与分散剂或湿润剂、悬浮剂和一种或多种防腐剂的混合物。合适的分散剂或湿润剂和悬浮剂以上述那些为典型。还可以存在额外的赋形剂，例如增甜剂、矫味剂和着色剂。可以通过添加抗氧化剂，诸如抗坏血酸给这些组合物防腐。
本发明的药物组合物还可以为水包油型乳剂形式。油相可以为植物油，例如橄榄油或花生油或矿物油，例如液体石蜡或这些物质的混合物。合适的乳化剂可以为天然存在的磷脂类，例如大豆卵磷脂和来源于脂肪酸和己糖醇酐类的酯类或偏酯类，例如失水山梨糖醇单油酸酯和所述的偏酯类与环氧乙烷的缩合产物，例如聚氧乙烯失水山梨糖醇单油酸酯。乳剂还可以含有增甜剂、矫味剂、防腐剂和抗氧化剂。
可以使用增甜剂，例如甘油、丙二醇、山梨醇或蔗糖配制糖浆剂和酏剂。这类制剂还可以含有湿润剂、防腐剂、矫味剂和着色剂以及抗氧化剂。
药物组合物可以为无菌可注射水溶液形式。在可以使用的可接受的媒介物和溶剂中有水、林格液、聚乙二醇/水溶液和等渗氯化钠溶液。
无菌可注射制剂还可以为无菌可注射的水包油型微乳，其中活性组分溶于油相。例如，首先将活性组分溶于大豆油和卵磷脂的混合物。然后将该油溶液导入水和甘油混合物并且加工成微乳。
可以通过局部快速浓注将可注射溶液或微乳导入患者血流。或者，可能有利的是以维持本发明化合物的恒定循环浓度的方式给予所述溶液或微乳。为了维持这类恒定的浓度，可以使用连续静脉内递送装置。这类装置的实例为Deltec CADD-PLUSTM型5400静脉注射泵。
药物组合物可以为用于肌内和皮下给药的无菌可注射水或油混悬液形式。可以按照公知技术，使用上述那些合适的分散剂或湿润剂以及悬浮剂配制混悬液。无菌可注射制剂还可以为在无毒性的肠道外可接受稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或混悬液，例如作为在1，3-丁二醇中的溶液。此外，无菌的不挥发油通常用作溶剂或悬浮介质。为了这一目的，可以使用任意温和的不挥发油，包括合成的单酸甘油酯类或二脂酰甘油酯类。此外，脂肪酸，诸如油酸可应用于制备注射剂。
还可以以用于直肠给药的栓剂形式给予通式I的化合物。可以通过将药物与在常温下为固体，而在直肠温度下为液体且由此在直肠中熔化以释放药物的无-刺激性赋形剂混合制备这些组合物。这类物质包括可可脂、甘油胶、氢化植物油、不同分子量的聚乙二醇与聚乙二醇的脂肪酸酯类的混合物。
就局部应用而言，使用含有通式I化合物的霜剂、软膏剂、凝胶剂、溶液或混悬液等(为了这一应用的目的，局部应用应包括口腔洗剂和漱口剂)。
通过局部应用合适的鼻内载体和递送装置以鼻内形式或通过使用那些本领域技术人员众所周知的透皮贴剂剂型的透皮途径给予本发明的化合物。当然，为了以透皮递送系统的形式给药，在整个剂量方案中，剂量的给予为连续的，而非间断的。还可以将本发明的化合物作为使用基质，诸如可可脂、甘油胶、氢化植物油、不同分子量的聚乙二醇与聚乙二醇的脂肪酸酯类的混合物的栓剂递送。
当将本发明的化合物给药入人受试者时，每日剂量一般由开据处方的临床医师决定，其中该剂量一般根据个体患者的年龄、体重、性别和反应以及患者症状的严重程度的不同而改变。
在一种典型的应用中，对进行癌症治疗的哺乳动物给予适量的化合物。给药量约为0.1mg/kg体重-约60mg/kg体重/天，优选0.5mg/kg体重-约40mg/kg体重/天。
还将本发明的化合物与公知的治疗剂和抗癌药联用。例如，将本发明的化合物与公知的抗癌药联用。目前披露的化合物与其它抗癌药或化疗剂的联合用药属于本发明的范围。这类活性剂的实例可以在Cancer Principles and Practice of Oncology by V.T.Devita和S.Hellman(editors)，6th edition(February 15，2001)，Lippincott Williams& Wilkins Publishers中找到。本领域技术人员能够基于涉及的药物和癌症的特定特征确定哪些活性剂的组合将是有用的。这类抗癌药包括，但不限于如下药物：雌激素受体调节剂、雄激素受体调节剂、类视色素受体调节剂、细胞毒性/细胞抑制剂、抗增殖药、异戊二烯基-蛋白转移酶抑制剂、HMG-CoA还原酶抑制剂和其它血管生成抑制剂、细胞增殖和存活信号传导抑制剂、编程性细胞死亡诱导剂和干扰细胞周期关卡的活性剂。当与放疗共同施用时，本发明化合物是特别有用的。
在一个实施方案中，还将本发明的化合物与包括如下药物的已知的抗癌药联用：雌激素受体调节剂、雄激素受体调节剂、类视色素受体调节剂、细胞毒性剂、抗增殖药、异戊二烯基-蛋白转移酶抑制剂、HMG-CoA还原酶抑制剂、HIV蛋白酶抑制剂、逆转录酶抑制剂和其它血管生成抑制剂。
“雌激素受体调节剂”指的是干扰或抑制雌激素与受体结合的化合物，而与机理无关。雌激素受体调节剂的实例包括，但不限于他莫昔芬、雷洛昔芬、艾多昔芬、LY353381、LY117081、托瑞米芬、氟维司群、4-[7-(2，2-二甲基-1-氧代丙氧基-4-甲基-2-[4-[2-(1-哌啶基)乙氧基]苯基]-2H-1-苯并吡喃-3-基)-苯基-2，2-二甲基丙酸盐、4，4’-二羟基二苯酮-2，4-二硝基苯基-腙和SH646。
“雄激素受体调节剂”指的是干扰或抑制雄激素与受体结合的化合物而与机理无关。雄激素受体调节剂的实例包括非那雄胺和其它5α-还原酶抑制剂、尼鲁米特、氟他胺、比卡鲁胺、利阿唑和醋酸阿比特龙。
“类视色素受体调节剂”指的是干扰或抑制类视色素与受体结合的化合物而与机理无关。这类类视色素受体调节剂的实例包括贝沙罗汀、维A酸、13-顺式-维甲酸、9-顺式维甲酸、α-二氟甲基鸟氨酸、ILX23-7553、反式-N-(4’-羟基苯基)维胺(retinamide)和N-4-羧基苯基维胺(retinamide)。
“细胞毒性/细胞抑制剂”指的是主要通过直接干扰细胞的功能作用而导致细胞死亡或抑制细胞增殖或抑制或干扰细胞有丝分裂的化合物，包括：烷化剂、肿瘤坏死因子、嵌入剂、低氧可活化化合物、微管抑制剂/微管-稳定剂、有丝分裂驱动蛋白抑制剂、涉及有丝分裂进程的激酶的抑制剂、抗代谢物；生物反应调节剂；激素/抗-激素治疗剂、造血生长因子、单克隆抗体靶向的治疗剂、拓扑异构酶抑制剂、蛋白酶体抑制剂和泛蛋白连接酶抑制剂。
细胞毒性剂的实例包括，但不限于sertenef、恶液质素、异环磷酰胺、他索纳明、氯尼达明、卡铂、六甲蜜胺、泼尼莫司汀、二溴卫矛醇、雷莫司汀、福莫司汀、奈达铂、奥沙利铂、替莫唑胺、heptaplatin、雌莫司汀、甲苯磺酸英丙舒凡、曲磷胺、尼莫司汀、二溴螺氯铵、嘌嘧替派、洛铂、沙铂、甲基丝裂霉素、顺铂、伊罗夫文、dexifosfamide、顺式-胺二氯(2-甲基-吡啶基)铂、苄基鸟嘌呤、葡磷酰胺、GPX100(反式，反式，反式)-双-mu-(己-1，6-二胺)-mu-[二胺-铂(II)]双[二胺(氯)铂(II)]四氯化物、二氮丙啶基精胺、三氧化二砷、1-(11-十二烷氨基-10-羟基十一基)-3，7-二甲基黄嘌呤、佐柔比星、伊达比星、柔红霉素、比生群、米托蒽醌、吡柔比星、吡萘非特、戊柔比星、氨柔比星、抗瘤酮、3’-脱氨基-3’-吗啉代-13-脱氧-10-羟基去甲柔红霉素、annamycin、加柔比星、依利奈法德、MEN10755和4-脱甲氧基-3-脱氨基-3-氮丙啶基-4-甲基磺酰基-柔红霉素(参见WO 00/50032)。
低氧可活化化合物的实例为替拉扎明。
蛋白酶体抑制剂的实例包括，但不限于乳胞素和bortezomib。
微管抑制剂/微管-稳定剂的实例包括紫杉醇、硫酸长春地辛、3’，4’-双脱氢-4’-脱氧-8’-norvincaleukoblastine、多西他赛、根霉素、多拉司他汀、羟乙基磺酸米伏布林、auristatin、西马多丁、RPR109881、BMS184476、长春氟宁、cryptophycin、2，3，4，5，6-五氟-N-(3-氟-4-甲氧基苯基)苯磺酰胺、脱水长春碱(anhydrovinblastine)、N，N-二甲基-L-缬氨酰基-L-缬氨酰基-N-甲基-L-缬氨酰基-L-脯氨酰基-L-脯氨酸-叔-丁酰胺、TDX258、埃坡霉素(例如，参见美国专利US 6,284,781和6,288,237)和BMS188797。
拓扑异构酶抑制剂的某些实例为托泊替康、hycaptamine、伊立替康、卢比替康、6-乙氧基丙酰基-3’，4’-O-外-亚苄基-教酒菌素、9-甲氧基-N，N-二甲基-5-硝基吡唑并[3，4，5-kl]吖啶-2-(6H)丙胺、1-氨基-9-乙基-5-氟-2，3-二氢-9-羟基-4-甲基-1H，12H-苯并[de]吡喃并[3’，4’：b，7]-吲嗪并[1，2b]喹啉-10，13(9H，15H)二酮、勒托替康、7-[2-(N-异丙氨基)乙基]-(20S)喜树碱、BNP1350、BNPI1100、BN80915、BN80942、磷酸依托泊苷、替尼泊苷、索布佐生、2’-二甲氨基-2’-脱氧-依托泊苷、GL331、N-[2-(二甲氨基)乙基]-9-羟基-5，6-二甲基-6H-吡啶并[4，3-b]咔唑-1-甲酰胺、asulacrine、(5a，5aB，8aa，9b)-9-[2-[N-[2-(二甲氨基)乙基]-N-甲氨基]乙基]-5-[4-羟基-3，5-二甲氧基苯基]-5，5a，6，8，8a，9-六氢呋喃并(3’，4’：6，7)萘并(2，3-d)-1，3-间二氧杂环戊烯-6-酮、2，3-(亚甲二氧基)-5-甲基-7-羟基-8-甲氧基苯并[c]-菲啶、6，9-双[(2-氨基乙基)氨基]苯并[g]isoguinoline-5，10-二酮、5-(3-氨基丙基氨基)-7，10-二羟基-2-(2-羟乙基氨基甲基)-6H-吡唑并[4，5，1-de]吖啶-6-酮、N-[1-[2(二乙氨基)乙氨基]-7-甲氧基-9-氧代-9H-噻吨-4-基甲基]甲酰胺、N-(2-(二甲氨基)乙基)吖啶-4-甲酰胺、6-[[2-(二甲氨基)乙基]氨基]-3-羟基-7H-茚并[2，1-c]喹啉-7-酮和地美司钠。
有丝分裂驱动蛋白且特别是人有丝分裂驱动蛋白KSP的抑制剂的实例，描述在PCT公开号WO 01/30768、WO 01/98278、WO03/050,064、WO 03/050,122、WO 03/049,527、WO 03/049,679、WO03/049,678和WO 03/39460和待审PCT申请号US03/06403(2003年3月4日提交)、US03/15861(2003年5月19日提交)、US03/15810(19，2003年5月19日提交)、US03/18482(2003年6月12日提交)和US03/18694(2003年6月12日提交)中。在一个实施方案中，有丝分裂驱动蛋白的抑制剂包括，但不限于KSP抑制剂、MKLP1抑制剂、CENP-E抑制剂、MCAK抑制剂、Kif14抑制剂、Mphosph1抑制剂和Rab6-KIFL抑制剂。
“涉及有丝分裂进程的激酶的抑制剂”包括，但不限于aurora激酶抑制剂、Polo-类激酶(PLK)抑制剂(特别是PLK-1抑制剂)、bub-1抑制剂和bub-R1抑制剂。
“抗增殖剂”包括：反义RNA和DNA寡核苷酸，诸如G3139、ODN698、RVASKRAS、GEM231和INX3001；和抗代谢物，诸如依诺他滨、卡莫氟、替加氟、喷司他丁、去氧氟尿苷、三甲曲沙、氟达拉滨、卡培他滨、加洛他滨、cytarabine ocfosfate、fosteabine sodiumhydrate、雷替曲塞、paltitrexid、乙嘧替氟、噻唑呋林、地西他滨、诺拉曲塞、培美曲塞、nelzarabine、2’-脱氧-2’-亚甲基胞苷、2’-氟亚甲基-2’-脱氧胞苷、N-[5-(2，3-二氢-苯并呋喃基)磺酰基]-N’-(3，4-二氯苯基)脲、N6-[4-脱氧-4-[N2-[2(E)，4(E)-十四烯酰基]甘氨酰氨基]-L-甘油基-B-L-甘露-庚吡喃糖基]腺嘌呤、aplidine、海鞘素、曲沙他滨、4-[2-氨基-4-氧代-4，6，7，8-四氢-3H-嘧啶并[5，4-b][1，4]噻嗪-6-基-(S)-乙基]-2，5-噻吩酰基-L-谷氨酸、氨基蝶呤、5-氟尿嘧啶、阿拉诺新、11-乙酰基-8-(氨基甲酰基氧基甲基)-4-甲酰基6-甲氧基-14-氧杂-1，11-二氮杂四环(7.4.1.0.0)-十四-2，4，6-三烯-9-基乙酸酯、苦马豆碱、洛美曲索、右雷佐生、甲硫氨酸酶、2’-氰基-2’-脱氧-N4-棕榈酰基-1-B-D-阿拉伯呋喃糖基胞嘧啶和3-氨基吡啶基-2-甲醛缩氨基硫脲。
单克隆抗体靶向的治疗剂的实例包括那些带有与癌细胞特异性或靶细胞特异性单克隆抗体结合的细胞毒性剂或放射性同位素的治疗剂。实例包括Bexxar。
“HMG-CoA还原酶抑制剂”指的是3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA还原酶的抑制剂。可以使用的HMG-CoA还原酶抑制剂的实例包括，但不限于洛伐他汀(MEVACOR；参见美国专利US4,231,938、US4,294,926和US4,319,039)、辛伐他汀(ZOCOR；参见美国专利US4,444,784、US4,820,850和US4,916,239)、普伐他汀(PRAVACHOL；参见美国专利US 4,346,227、US4,537,859、US4,410,629、US5,030,447和US5,180,589)、氟伐他汀(LESCOL；参见美国专利US5,354,772、US4,911,165、US4,929,437、US5,189,164、US5,118,853、US5,290,946和US5,356,896)和阿托伐他汀(LIPITOR；参见美国专利US5,273,995、US4,681,893、US5,489,691和US5,342,952)。可以用于本发明方法的这些和其它HMG-CoA还原酶抑制剂的结构通式描述在M.Yalpani的″降胆固醇药″-Chemistry&Industry，pp.85-89的87页(1996年2月5日)和美国专利US4,782,084和US4,885,314中。本文所用的术语HMG-CoA还原酶抑制剂包括具有HMG-CoA还原酶抑制活性的化合物的所有药物上可接受的内酯和开环的酸形式(即其中内酯环开环而形成游离酸)以及盐和酯形式，且由此这类盐、酯类、开环的酸和内酯形式的应用包括在本发明范围内。
“异戊二烯基-蛋白转移酶抑制剂”指的是抑制异戊二烯基-蛋白转移酶中任意一种或任意组合的化合物，所述的异戊二烯基-蛋白转移酶包括法尼基-蛋白转移酶(FPTase)、忙牛儿基忙牛儿基-蛋白转移酶I型(GGPTase-I)和忙牛儿基忙牛儿基-蛋白转移酶-II型(GGPTase-II，也称作Rab GGPTase)。
可以在下列公开文献和专利中找到异戊二烯基-蛋白转移酶抑制剂的实例：WO96/30343；WO97/18813；WO97/21701；WO97/23478；WO97/38665；WO98/28980；WO98/29119；WO95/32987；美国专利US5,420,245；美国专利US5,523,430；美国专利US5,532,359；美国专利US5,510,510；美国专利US5,589,485；美国专利US5,602,098；欧洲专利公开号EP0618221；欧洲专利公开号EP0675112；欧洲专利公开号EP0604181；欧洲专利公开号EP0696593；WO94/19357；WO95/08542；WO95/11917；WO95/12612；WO95/12572；WO95/10514；美国专利US5,661,152；WO95/10515；WO95/10516；WO95/24612；WO95/34535；WO95/25086；WO 96/05529；WO96/06138；WO96/06193；WO96/16443；WO96/21701；WO96/21456；WO96/22278；WO96/24611；WO96/24612；WO96/05168；WO96/05169；WO96/00736；美国专利US5,571,792；WO96/17861；WO96/33159；WO96/34850；WO96/34851；WO96/30017；WO96/30018；WO96/30362；WO96/30363；WO96/31111；WO96/31477；WO96/31478；WO96/31501；WO97/00252；WO97/03047；WO97/03050；WO97/04785；WO97/02920；WO97/17070；WO97/23478；WO97/26246；WO97/30053；WO97/44350；WO98/02436；和美国专利US5,532,359。就异戊二烯基-蛋白转移酶抑制剂对血管发生的作用的实例而言，参见European J.of Cancer，Vol.35，No.9，pp.1394-1401(1999)。
“血管生成抑制剂”指的是抑制新血管形成的化合物而与机理无关。血管生成抑制剂的实例包括，但不限于：酪氨酸激酶抑制剂，诸如酪氨酸激酶受体Flt-1(VEGFR1)和Flk-1/KDR(VEGFR2)的抑制剂；表皮-衍生的、成纤维细胞-衍生的或血小板衍生的生长因子的抑制剂；MMP(基质金属蛋白酶)抑制剂；整联蛋白阻滞剂；干扰素-α；白细胞介素-12；多硫酸戊聚糖；环加氧酶抑制剂，包括非类固醇抗炎药(NSAIDs)，如阿司匹林和布洛芬，以及选择性环加氧酶-2抑制剂，如塞来考昔和罗非考昔(PNAS，Vol.89，p.7384(1992)；JNCI，Vol.69，p.475(1982)；Arch.Opthalmol.，Vol.108，p.573(1990)；Anat.Rec.，Vol.238，p.68(1994)；FEBS Letters，Vol.372，p.83(1995)；Clin，Orthop.Vol.313，p.76(1995)；J.Mol.Endocrinol.，Vol.16，p.107(1996)；Jpn.J.Pharmacol.，Vol.75，p.105(1997)；Cancer Res.，Vol.57，p.1625(1997)；Cell，Vol.93，p.705(1998)；Intl.J.Mol.Med.，Vol.2，p.715(1998)；J.Biol.Chem.，Vol.274，p.9116(1999))；类固醇抗炎药(诸如皮质类固醇、盐皮质激素、地塞米松、泼尼松、泼尼松龙、甲泼尼龙、倍他米松)、羧基酰氨基三唑、考布他汀A-4、角鲨胺、6-O-氯乙酰基-羰基)-烟曲霉醇、沙利度胺、制管张素、肌钙蛋白-1、血管紧张素II拮抗剂(参见Fernandez等，J.Lab.Clin.Med.105：141-145(1985))；和针对VEGF的抗体(参见Nature Biotechnology，Vol.17，pp.963-968(October 1999)；Kim等，Nature，362，841-844(1993)；WO00/44777；和WO00/61186)。
调节或抑制血管发生并且还可以用于与本发明化合物联用的其它治疗剂包括调节或抑制凝血和纤维蛋白溶解系统的活性剂(参见Clin.Chem.La.Med.38：679-692(2000)中的综述)。调节或抑制凝血和纤维蛋白溶解途径的这类活性剂的实例包括，但不限于肝素(参见Thromb.Haemost.80：10-23(1998))、低分子量肝素和羧肽酶U抑制剂(也称作活性凝血酶可活化的纤维蛋白溶解抑制剂[TAFIa])的抑制剂(参见Thrombosis Res.101：329-354(2001))。PCT公开号WO03/013,526和美国专利顺序号US60/349,925(2002年1月18日提交)中已经描述了TAFIa抑制剂。
“干扰细胞周期关卡的活性剂”指的是抑制转导细胞周期关卡信号的蛋白激酶，由此使癌细胞对DNA损害剂敏感的化合物。这类活性剂包括ATR、ATM，、Chk1和Chk2激酶的抑制剂以及cdk和cdc激酶抑制剂并且特别以7-羟基星形孢菌素、flavopiridol、CYC202(Cyclacel)和BMS-387032为典型。
“细胞增殖和存活信号传导途径的抑制剂”指的是抑制细胞表面受体和那些表面受体下游的信号转导级联的药物活性剂。这类活性剂包括EGFR的抑制剂(例如gefitinib和erlotinib)、ERB-2的抑制剂(例如曲妥单抗)、IGFR的抑制剂、细胞因子受体的抑制剂、MET的抑制剂、PI3K的抑制剂(例如LY294002)、丝氨酸-苏氨酸激酶的抑制剂(包括，但不限于诸如WO02/083064、WO02/083139、WO02/083140和WO02/083138中所述的Akt的抑制剂)、Raf激酶的抑制剂(例如BAY-43-9006)、MEK的抑制剂(例如CI-1040和PD-098059)和mTOR的抑制剂(例如Wyeth CCI-779)。这类活性剂包括所有小分子抑制剂化合物和抗体拮抗剂。
“编程性细胞死亡诱导剂”包括TNF受体家族成员的激活物(包括TRAIL受体)。
本发明还包括与为选择性COX-2抑制剂的NSAID’s的联合用药物。就本说明书的目的而言，将为选择性COX-2抑制剂的NSAID’s定义为那些具有对COX-2的抑制超过对COX-1的抑制至少100倍的特异性活性剂，正如根据通过细胞或微粒体试验评估的COX-2的IC50与COX-1的IC50之比所确定的。这类化合物包括，但不限于如下文献中披露的那些化合物：美国专利US5,474,995；美国专利US5,861,419；美国专利US6,001,843；美国专利US6,020,343；美国专利US5,409,944；美国专利US5,436,265；美国专利US5,536,752；美国专利US5,550,142；美国专利US5,604,260；美国专利US5,698,584；美国专利US5,710,140；WO94/15932；美国专利US5,344,991；美国专利US5,134,142；美国专利US5,380,738；美国专利US5,393,790；美国专利US5,466,823；美国专利US5,633,272；和美国专利US5,932,598，将所有这些文献引入本文作为参考。
特别用于本发明治疗方法的COX-2抑制剂为：3-苯基-4-(4-(甲基磺酰基)苯基)-2-(5H)-呋喃酮；和5-氯-3-(4-甲基磺酰基)苯基-2-(2-甲基-5-吡啶基)吡啶；或其药物上可接受的盐。
已经描述为COX-2抑制剂且由此用于本发明的化合物包括，但不限于：帕瑞考昔、CELEBREX和BEXTRA或其药物上可接受的盐。
血管生成抑制剂的其它实例包括，但不限于内皮他丁、ukrain、豹蛙酶、IM862、5-甲氧基-4-[2-甲基-3-(3-甲基-2-丁烯基)环氧乙基]-1-氧杂螺[2，5]辛-6-基(氯乙酰基)氨基甲酸酯、acetyldinanaline、5-氨基-1-[[3，5-二氯-4-(4-氯苯甲酰基)苯基]甲基]-1H-1，2，3-三唑-4-甲酰胺、CM101、角鲨胺、考布他汀、RPI4610、NX31838、硫酸化甘露戊糖磷酸酯、7，7-(羰基-双[亚氨基-N-甲基-4，2-吡咯羰基亚氨基[N-甲基-4，2-吡咯]-羰基亚氨基]-双-(1，3-萘二磺酸酯)和3-[(2，4-二甲基吡咯-5-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮(SU5416)。
如上所述的“整联蛋白阻滞剂”指的是：选择性拮抗、抑制或阻碍生理配体与αvβ3整联蛋白结合的化合物；选择性拮抗、抑制或阻碍生理配体与αvβ5整联蛋白结合的化合物；选择性拮抗、抑制或阻碍生理配体与αvβ3整联蛋白和αvβ5整联蛋白结合的化合物；和拮抗、抑制或阻碍在毛细管内皮细胞上表达的特定整联蛋白活性的化合物。该术语还指αvβ6、αvβ8、α1β1、α2β1、α5β1、α6β1和α6β4整联蛋白的拮抗剂。该术语还指αvβ3、αvβ5、αvβ6、αvβ8、α1β1、α2β1、α5β1、α6β1和α6β4整联蛋白的任意组合的拮抗剂。
酪氨酸激酶抑制剂的某些具体实例包括N-(三氟甲基苯基)-5-甲基异唑-4-甲酰胺、3-[(2，4-二甲基吡咯-5-基)亚甲基]二氢吲哚-2-酮、17-(烯丙基氨基)-17-脱甲氧基格尔德霉素、4-(3-氯-4-氟苯基氨基)-7-甲氧基-6-[3-(4-吗啉基)丙氧基]喹唑啉、N-(3-乙炔基苯基)-6，7-双(2-甲氧基乙氧基)-4-喹唑啉胺、BIBX1382、2，3，9，10，11，12-六氢-10-(羟甲基)-10-羟基-9-甲基-9，12-环氧-1H-二吲哚并[1，2，3-fg：3’，2’，1’-kl]吡咯并[3，4-i][1，6]苯并二氮芳辛-1-酮、SH268、染料木黄酮、STI571、CEP2563、4-(3-氯苯基氨基)-5，6-二甲基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶甲磺酸酯、4-(3-溴-4-羟基苯基)氨基-6，7-二甲氧基喹唑啉、4-(4’-羟基苯基)氨基-6，7-二甲氧基喹唑啉、SU6668、STI571A、N-4-氯苯基-4-(4-吡啶基甲基)-1-酞嗪胺和EMD121974。
与非抗癌化合物的化合物的联合用药也包括在本发明的方法中。例如，本发明权利要求要求保护的化合物与PPAR-γ(即PPAR-gamma)激动剂和PPAR-δ(即PPAR-delta)激动剂的联合用药物用于治疗某些恶性肿瘤(malingnancies)。PPAR-γ和PPAR-δ为核过氧化物酶体增生物激活的受体γ和δ。在文献中已经报导了PPAR-γ在内皮细胞上的表达及其涉及血管发生(参见J.Cardiovasc.Pharmacol.1998；31：909-913；J.Biol.Chem.1999；274：9116-9121； Invest.OphthalmolVis.Sci.2000；41：2309-2317)。更近来，已经证实PPAR-γ激动剂在体外抑制对VEGF的生成血管反应；曲格列酮和马来酸罗西格列酮抑制小鼠的视网膜新生血管形成的发展(Arch.Ophthamol.2001；119：709-717)。PPAR-γ激动剂和PPAR-γ/α激动剂的实例包括，但不限于噻唑烷二酮类(诸如DRF2725、CS-011、曲格列酮、罗西格列酮和吡格列酮)、非诺贝特、吉非贝齐、氯贝丁酯、GW2570、SB219994、AR-H039242、JTT-501、MCC-555、GW2331、GW409544、NN2344、KRP297、NP0110、DRF4158、NN622、GI262570、PNU182716、DRF552926、2-[(5，7-二丙基-3-三氟甲基-1，2-苯并异唑-6-基)氧基]-2-甲基丙酸(USSN09/782,856中披露)和2(R)-7-(3-(2-氯-4-(4-氟苯氧基)苯氧基)丙氧基)-2-乙基色满-2-羧酸(USSN60/235,708和60/244,697中披露)。
本发明的另一个实施方案为目前披露的化合物与基因疗法的组合在治疗癌症中的应用。就治疗癌症的基团策略综述而言，参见Hall等(Am J Hum Genet 61：785-789，1997)和Kufe等(Cancer Medicine，5thEd，pp 876-889，BC Decker，Hamilton 2000)。基因疗法可以用于递送任意肿瘤抑制基因。这类基因的实例包括，但不限于：可以通过重组病毒-介导的基因转移递送的p53(参见，例如美国专利US6,069,134)；uPA/uPAR拮抗剂(″小鼠中uPA/uPAR拮抗剂的腺病毒-介导的递送抑制血管发生-依赖性肿瘤生长和传播″-Gene Therapy，August1998；5(8)：1105-13)；和干扰素γ(J Immunol 2000；164：217-222)。
本发明的化合物还可以与二膦酸盐(应理解包括二膦酸盐、双膦酸盐、二膦酸和双膦酸)联合用于治疗或预防癌症，包括骨癌。二膦酸盐的实例包括，但不限于：依替膦酸盐(Didronel)、帕米膦酸盐(Aredia)、阿仑膦酸盐(Fosamax)、利塞膦酸盐(Actonel)、zoledronate(Zometa)、伊班膦酸盐(Boniva)、伊卡膦酸盐或cimadronate、氯膦酸盐、EB-1053、minodronate、neridronate、piridronate和替鲁膦酸盐，包括其任意和所有的药物上可接受的盐、衍生物、水合物和混合物。
还可以将本发明的化合物与内在多药物耐受性(MDR)，特别是与高水平转运蛋白表达相关的MDR的抑制剂联合给药。这类MDR抑制剂包括p-糖蛋白(P-gp)的抑制剂，诸如LY335979、XR9576、OC144-093、R101922、VX853和PSC833(伐司朴达)。
可以将本发明的化合物与止吐药联用以便治疗恶心或呕吐，包括急性、延迟、晚期和可能因单独或与放疗联用本发明的化合物产生的预想中的呕吐。为了预防或治疗呕吐，可以将本发明的化合物与其它止吐药联用，尤其是神经激肽-1受体拮抗剂；5HT3受体拮抗剂，诸如昂丹司琼、格拉司琼、托烷司琼和扎托司琼；GABAB受体激动剂，诸如巴氯芬；皮质类固醇，诸如地卡特隆(地塞米松)、Kenalog、Aristocort、Nasalide、Preferid、Benecorten或其它药物，诸如披露在美国专利US2,789,118、US2,990,401、US3,048,581、US3,126,375、US3,929,768、US3,996,359、US3,928,326和US3,749,712中；抗多巴胺能药，诸如吩噻嗪类(例如丙氯拉嗪、氟奋乃静、硫利达嗪和美索达嗪)、甲氧氯普胺或屈大麻酚。在一个实施方案中，将选自神经激肽-1受体拮抗剂、5HT3受体拮抗剂和皮质类固醇的止吐药作为佐剂给予以便治疗或预防可能在本发明化合物给药时产生的呕吐。
与本发明化合物联用的神经激肽-1受体拮抗剂完整地描述在如下文献中：例如，在美国专利US5,162,339、US5,232,929、US5,242,930、US5,373,003、US5,387,595、US5,459,270、US5,494,926、US5,496,833、US5,637,699、US5,719,147中；欧洲专利公开号EP0360390、EP0394989、EP0428434、EP0429366、EP0430771、EP0436334、EP0443132、EP0482539、EP0498069、EP0499313、EP0512901、EP0512902、EP0514273、EP0514274、EP0514275、EP0514276、EP0515681、EP0517589、EP0520555、EP0522808、EP0528495、EP0532456、EP0533280、EP0536817、EP0545478、EP0558156、EP0577394、EP0585913、EP0590152、EP0599538、EP0610793、EP0634402、EP0686629、EP0693489、EP0694535、EP0699655、EP0699674、EP0707006、EP0708101、EP0709375、EP0709376、EP0714891、EP0723959、EP0733632和EP0776893；PCT国际专利公开号WO90/05525、WO90/05729、WO91/09844、WO91/18899、WO92/01688、WO92/06079、WO92/12151、WO92/15585、WO92/17449、WO92/20661、WO92/20676、WO92/21677、WO92/22569、WO93/00330、WO93/00331、WO93/01159、WO93/01165、WO93/01169、WO93/01170、WO93/06099、WO93/09116、WO93/10073、WO93/14084、WO93/14113、WO93/18023、WO93/19064、WO93/21155、WO93/21181、WO93/23380、WO93/24465、WO94/00440、WO94/01402、WO94/02461、WO94/02595、WO94/03429、WO94/03445、WO94/04494、WO94/04496、WO94/05625、WO94/07843、WO94/08997、WO94/10165、WO94/10167、WO94/10168、WO94/10170、WO94/11368、WO94/13639、WO94/13663、WO94/14767、WO94/15903、WO94/19320、WO94/19323、WO94/20500、WO94/26735、WO94/26740、WO94/29309、WO95/02595、WO95/04040、WO95/04042、WO95/06645、WO95/07886、WO95/07908、WO95/08549、WO95/11880、WO95/14017、WO95/15311、WO95/16679、WO95/17382、WO95/18124、WO95/18129、WO95/19344、WO95/20575、WO95/21819、WO95/22525、WO95/23798、WO95/26338、WO95/28418、WO95/30674、WO95/30687、WO95/33744、WO96/05181、WO96/05193、WO96/05203、WO96/06094、WO96/07649、WO96/10562、WO96/16939、WO96/18643、WO96/20197、WO96/21661、WO96/29304、WO96/29317、WO96/29326、WO96/29328、WO96/31214、WO96/32385、WO96/37489、WO97/01553、WO97/01554、WO97/03066、WO97/08144、WO97/14671、WO97/17362、WO97/18206、WO97/19084、WO97/19942和WO97/21702；和在英国专利公开号GB2266529、GB2268931、GB2269170、GB2269590、GB2271774、GB2292144、GB2293168、GB2293169和GB2302689中。这类化合物的制备完整地描述在上述专利和公开文献中，将它们引入本文作为参考。
在一个实施方案中，与本发明化合物联用的神经激肽-1受体拮抗剂选自：2-(R)-(1-(R)-(3，5-双(三氟甲基)苯基)乙氧基)-3-(S)-(4-氟苯基)-4-(3-(5-氧代-1H，4H-1，2，4-三唑并)甲基)吗啉或其药物上可接受的盐，其描述在美国专利US5,719,147中。
还可以将本发明的化合物与用于治疗贫血的活性剂一起给药。这类贫血的治疗剂例如为连续的红细胞生成(eythropoiesis)受体激活物(诸如阿法依伯汀)。
还可以将本发明的化合物与用于治疗中性白细胞减少的活性剂一起给药。这类中性白细胞减少治疗剂例如为调节中性白细胞产生和功能的造血生长因子，诸如人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)。G-CSF的实例包括非格司亭。
还可以将本发明的化合物与免疫-增强药物一起给药，诸如左旋咪唑、异丙肌苷和日达仙。
因此，本发明的范围包括本发明要求保护的化合物与第二种化合物的联合应用，所述的第二种化合物选自：雌激素受体调节剂、雄激素受体调节剂、类视色素受体调节剂、细胞毒性/细胞抑制剂、抗增殖药、异戊二烯基-蛋白转移酶抑制剂、HMG-CoA还原酶抑制剂、HIV蛋白酶抑制剂、逆转录酶抑制剂、血管生成抑制剂、PPAR-γ激动剂、PPAR-δ激动剂、二膦酸盐、内在多药物耐受性的抑制剂、止吐药、用于治疗贫血的活性剂、用于治疗中性白细胞减少的活性剂、免疫-增强药物、细胞增殖和存活信号传导抑制剂、干扰细胞周期关卡的活性剂和编程性细胞死亡诱导剂。
在涉及本发明化合物中的术语″给药″及其变化形式(例如″给予″化合物)指的是将化合物或化合物的前体药物导入需要治疗的动物系统。当将本发明的化合物或其前体药物与一种或多种其它活性剂(例如细胞毒性剂等)联合提供时，将″给药″及其变化形式各自理解为包括化合物或其前体药物和其它活性剂的同时和依次导入。
本文所用的术语″组合物″用以包括含有指定量的指定组分的产品以及直接或间接因指定量的指定组分的组合产生的任意产品。
本文所用的术语“治疗有效量”指的是在组织、系统、动物或人体内引起研究人员、兽医、医务人员或其他临床医师寻找的生物或医学反应的活性化合物或药物活性剂的量。
术语“治疗癌症(treating cancer)”或“癌症的治疗(treatment ofcancer)”指的是对患有癌性疾病的哺乳动物给药并且指的是通过杀伤癌细胞缓解癌性疾病(cancerous condition)的作用，还指的是导致癌生长和/或转移受到抑制的作用。
在一个实施方案中，用作第二种化合物的血管生成抑制剂选自酪氨酸激酶抑制剂、表皮-衍生的生长因子抑制剂、成纤维细胞-衍生的生长因子抑制剂、血小板衍生的生长因子的抑制剂、MMP(基质金属蛋白酶)抑制剂、整联蛋白阻滞剂、干扰素-α、白细胞介素-12、多硫酸戊聚糖、环加氧酶抑制剂、羧基酰氨基三唑、考布他汀A-4、角鲨胺、6-O-氯乙酰基-羰基)-烟曲霉醇、沙利度胺、制管张素、肌钙蛋白-1或针对VEGF的抗体。在一个实施方案中，雌激素受体调节剂为他莫昔芬或雷洛昔芬。
权利要求的范围内还包括治疗癌症的方法，包括给予治疗有效量的通式I的化合物与放疗的组合和/或与选自如下化合物的化合物的组合：雌激素受体调节剂、雄激素受体调节剂、类视色素受体调节剂、细胞毒性/细胞抑制剂、抗增殖药、异戊二烯基-蛋白转移酶抑制剂、HMG-CoA还原酶抑制剂、HIV蛋白酶抑制剂、逆转录酶抑制剂、血管生成抑制剂、PPAR-γ激动剂、PPAR-δ激动剂、二膦酸盐、内在多药物耐受性的抑制剂、止吐药、用于治疗贫血的活性剂、用于治疗中性白细胞减少的活性剂、免疫-增强药物、细胞增殖和存活信号传导抑制剂、干扰细胞周期关卡的活性剂和编程性细胞死亡诱导剂。
本发明的另一个实施方案为治疗癌症的方法，包括给予治疗有效量的通式I的化合物与紫杉醇或曲妥单抗的组合。
本发明进一步包括治疗或预防癌症的方法，包括给予治疗有效量的通式I的化合物与COX-2抑制剂的组合。
本发明还包括用于治疗或预防癌症的药物组合物，包括治疗有效量的通式I的化合物和选自如下的化合物：雌激素受体调节剂、雄激素受体调节剂、类视色素受体调节剂、细胞毒性/细胞抑制剂、抗增殖药、异戊二烯基-蛋白转移酶抑制剂、HMG-CoA还原酶抑制剂、HIV蛋白酶抑制剂、逆转录酶抑制剂、血管生成抑制剂、PPAR-γ激动剂、PPAR-δ激动剂、细胞增殖和存活信号传导抑制剂、干扰细胞周期关卡的活性剂、二膦酸盐和编程性细胞死亡诱导剂。
本发明的这些和其它方面从其中包含的教导中显而易见。
试验
通过下述试验测试实施例中所述的本发明化合物并且发现它们具有驱动蛋白抑制活性。在文献中已知其它试验并且它们易于由本领域技术人员实施(例如，参见PCT公开号WO01/30768，2001年5月3日，18-22页)。
I.驱动蛋白ATPase体外试验
人聚-组氨酸标记的KSP发动蛋白结构域(KSP(367H))的克隆和表达
通过PCR，使用p Bluescript全长人KSP构建体(Blangy等，Cell，vol.83，pp1159-1169，1995)作为模板克隆用于表达人KSP发动蛋白结构域构建体的质粒。N-末端引物5’-GCAACGATTAATATGGCGTCGCAGCCAAATTCGTCTGCGAAG(SEQ.ID.NO.：1)和C-末端引物5’-GCAACGCTCGAGTCAGTGATGATGGTGGTGATGCTGATTCACTTCAGGCTTATTCAATAT(SEQ.ID.NO.：2)用于扩增发动蛋白结构域和颈连接区。用AseI和XhoI消化PCR产物，将其连入pRSETa(Invitrogen)的NdeI/XhoI消化产物并且转化入大肠杆菌BL21(DE3)。
使细胞在37℃下生长至OD600为0.5。在将培养物冷却至室温后，用100μM IPTG诱导KSP表达并且将温育持续过夜。通过离心使细胞沉淀并且用冰冷的PBS洗涤一次。将沉淀快速冷冻并且贮存在-80℃下。
蛋白质纯化
使细胞沉淀在冰上融化并且重新悬浮于裂解缓冲液(50mM K-HEPES，pH8.0，250mM KCl，0.1％Tween，10mM咪唑，0.5mM Mg-ATP，1mM PMSF，2mM benzimidine，1x完全蛋白酶抑制剂混合物(Roche))。将细胞混悬液与1mg/ml溶菌酶和5mM β-巯基乙醇一起在冰上孵育10分钟，随后进行超声处理(3x30秒)。在4℃下进行所有随后的操作步骤。将裂解物以40,000xg离心40分钟。稀释上清液并且上在缓冲液A(50mM K-HEPES，pH 6.8，1mM MgCl2，1mM EGTA，10μM Mg-ATP，1mM DTT)中的SP琼脂糖柱(Pharmacia，5ml柱)且用缓冲液A中的0-750mM KCl梯度洗脱。收集含有KSP的级分并且与Ni-NTA树脂(Qiagen)一起温育1小时。用缓冲液B(除去PMSF和蛋白酶抑制剂混合物的裂解缓冲液)将树脂洗涤三次，随后进行三次15分钟-温育并且用缓冲液B洗涤。最后，温育树脂并且用缓冲液C(与缓冲液B相同，但pH为6.0)洗涤三次15分钟并且倾入柱。用洗脱缓冲液(与缓冲液B相同，但不包括150mM KCl和250mM咪唑)洗脱KSP。收集含有KSP的级分，在蔗糖中制成10％并且贮存在-80℃下。
由分离自牛脑的微管蛋白制备微管。在37℃下和在BRB80缓冲液(80mM K-PIPES，1mM EGTA，1mM MgCl2，pH 6.8下)中的10μM紫杉醇、1mM DTT、1mM GTP存在下聚合1mg/ml的纯化的微管蛋白(＞97％不含MAP)。通过超离心并且除去上清液从未聚合的微管蛋白中分离所得微管。将含有微管的沉淀缓慢地重新悬浮于在BRB80中的10μM紫杉醇、1mM DTT、50μg/ml氨苄西林和5g/ml氯霉素中。
将驱动蛋白发动蛋白结构域与微管、1mM ATP(1∶1 MgCl2∶Na-ATP)和化合物在23℃下和含有80mM K-HEPES(pH 7.0)、1mMEGTA、1mM DTT、1mM MgCl2和50mM KCl的缓冲液中一起温育。通过用80mM HEPES和50mM EDTA的最终缓冲液组合物稀释2-10倍(或备选地添加1∶1的反应体积和终止缓冲液(1.8M KCl和50mM EDTA)中)终止反应。通过喹哪啶红/钼酸铵试验，通过添加1.5倍体积的猝灭物C(例如向40μl反应体积+40μl终止缓冲液混合物中加入120μl猝灭物C)测定来自ATP水解反应的游离磷酸盐。猝灭物A含有0.1mg/ml喹哪啶红和0.14％聚乙烯醇；猝灭物B含有在1.15M硫酸中的12.3mM四水合钼酸铵。猝灭物C为2∶1比例的猝灭物A：猝灭物B。将该反应体系在23℃下温育5-10分钟并且在540nm处测定磷酸-钼酸盐复合物的吸收度。
在上述试验中测试实施例中的化合物1-5、1-7、1-9、1-11和1-13并且发现它们具有的IC50≤50μM。
II.细胞增殖试验
将细胞涂布在96-孔组织培养皿中，其密度允许细胞在24、48和72小时过程中成对数增长并且使其粘附过夜。在第二天，以10-点二分之一log滴度(in a 10-point，one-half log titration)向所有平板加入化合物。每个滴度系列均按照一式三份进行，并且在整个试验过程中维持0.1％的恒定DMSO浓度。还包括单独的0.1％DMSO对照。在不含血清的培养基中制备每种化合物的稀释系列。本试验中的血清终浓度为在200μL培养基体积中5％。在添加药物后24、48或72小时时向滴定板上的每个样品和对照孔中加入20微升Alamar蓝染色试剂并且使该体系返回至37℃下温育。在6-12小时后，在CytoFluor II平板读出器上使用530-560纳米的激发波长、590纳米的发射波长分析Alamar蓝荧光。
通过将x-轴上的化合物浓度与y-轴上的每一滴定点的细胞生长抑制平均百分比绘图来得到细胞毒性EC50。将已经用单独的载体处理的对照孔中的细胞生长定义为在本试验中100％的生长率，并且将用化合物处理的细胞生长与该值进行比较。将专卖的内部软件(proprietaryin-house software)用于计算细胞毒性值的百分比并且使用对数4-参数曲线拟合计算拐点。将细胞毒性百分比定义为：
％细胞毒性：(荧光对照)-(荧光样品)x100x(荧光对照)-1
将拐点报导为细胞毒性EC50。
III.通过FACS评价有丝分裂停滞和编程性细胞死亡
FACS分析用于通过测定处理的细胞群中的DNA含量评价化合物抑制有丝分裂中的细胞并且诱导编程性细胞死亡的能力。以1.4x106个细胞/6cm2组织培养皿的密度接种细胞并且使其粘附过夜。然后用载体(0.1％DMSO)或滴度系列(titration series)的化合物处理8-16小时。在处理后，通过在指定时间时进行胰蛋白酶消化收集细胞并且通过离心沉淀。在PBS中冲洗细胞沉淀并且固定在70％ 醇中且贮存在4℃下过夜或更长时间。
为了进行FACS分析，沉淀至少500,000个固定的细胞并且通过抽吸除去70％ 醇。然后将细胞在4℃下与RNase A(50 Kunitz个单位/ml)和碘化丙啶(50μg/ml)一起孵育30分钟并且使用BectonDickinson FACSCaliber分析。使用Modfit细胞周期分析模拟软件(Verity Inc.)分析数据(来自10,000个细胞)。
通过x-轴上的化合物浓度和y-轴上每一滴度点的细胞周期的G2/M期中的细胞百分比(如通过碘化丙啶荧光测定的)绘图来获得有丝分裂停滞的EC50。使用SigmaPlot程序进行数据分析以便使用对数4-参数曲线拟合计算拐点。拐点报导为有丝分裂停滞的EC50。类似的方法用于测定编程性细胞死亡的化合物EC50。此处，将在每一滴度点(如通过碘化丙啶荧光测定的)处的凋亡细胞百分比绘制在y-轴上并且如上所述进行类似的分析。
IV.检测单极纺锤体的免疫荧光显微技术
用于对DNA、微管蛋白和粒周蛋白进行免疫荧光染色的方法基本上如Kapoor等(2000)在J.Cell Biol.150：975-988中所述。为了进行细胞培养研究，将细胞涂布在组织培养物处理的玻璃室载玻片上并且使其粘附过夜。然后将细胞与所关注的化合物一起孵育4-16小时。在孵育完成后，抽吸培养基和药物并且从载玻片上除去室(chamber)和垫片。然后按照参考的方案透化细胞，固定，洗涤并且封闭以便进行非特异性抗体结合。用二甲苯将石蜡-包埋的肿瘤切片去石蜡化并且通过乙醇系列进行在水化，此后进行封闭。在4℃下在初级抗体(小鼠单克隆抗-α-微管抗体，来自Sigma的按照1∶500稀释的克隆DM1A；来自Covance的按照1∶2000稀释的兔多克隆抗-粒周蛋白抗体)中将载玻片温育过夜。在洗涤后，在室温下将载玻片与稀释至15μg/ml的缀合的二级抗体(微管蛋白的FITC-缀合的驴抗-小鼠IgG；粒周蛋白的德克萨斯红-缀合的驴抗-家兔IgG)一起温育1小时。然后洗涤载玻片并且使用Hoechst 33342复染色以便使DNA显影。在使用Metamorph去卷积和成像软件的Nikon落射荧光显微镜上用100x油浸物镜使免疫染色的样品成像。
实施例
提供的实施例用以有助于进一步理解本发明。具体使用的物质、种类和条件用于解释本发明，但并用非来限定本发明的合理范围。
方案1
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步骤1：1-1的合成
向在0℃下24.9g(255mmol)N，O-二甲基羟胺盐酸盐在1.5LCH2Cl2中的混悬液中加入71.1mL(510mmol)三乙胺，随后滴加100mLCH2Cl2中的25.0g(141.6mmol)2，5-二氟苯甲酰氯。在搅拌1小时后，用水洗涤该反应体系，用1M HCl洗涤三次，用盐水洗涤，用Na2SO4干燥并且浓缩至得到1-1为无色油状物。1-1的数据：1HNMR(500MHz，CDCl3)δ 7.2-7.0(m，3H)，3.6(bs，3H)，3.4(s，3H)ppm。
步骤2：1-(2，5-二氟苯基)-6-(四氢-2H-吡喃-2-基氧基)己-2-炔-1-酮(1-3)的合成
向在-78℃下的15.0g(89.2mmol)THP-炔1-2(如Tetrahedron，2001，57，2597-2608中所述制备)在750mL THF中的溶液中加入35.7mL(89.2mmol)在己烷中的2.5M nBuLi。在该温度下搅拌1小时后，通过注射器加入17.9g(89.2mmol)1-1在35mL THF中的溶液。将该溶液搅拌过夜，同时逐步升温至室温。用饱和NH4Cl水溶液使反应猝灭并且用EtOAc萃取。用盐水洗涤有机萃取物，用Na2SO4干燥，通过旋转蒸发进行浓缩，并且通过使用EtOAc/己烷的柱色谱法纯化而得到1-3，为无色油状物。1-3的数据：1HNMR(500MHz，CDCl3)δ7.7(m，1H)，7.3(m，1H)，7.15(m，1H)，4.6(m，1H)，3.9(m，2H)，3.55(m，2H)，2.65(m，2H)，1.95(m，2H)，1.85(m，1H)，1.75(m，1H)，1.6-1.5(m，4H)ppm。
步骤3：1-(2，5-二氟苯基)-3-苯基-6-(四氢-2H-吡喃-2-基氧基)己-2-烯-1-酮(1-4)的合成
向在-78℃下的20.2g(98.1mmol)溴化亚铜(I)二甲硫复合物在75mL THF中的混悬液中加入98.1mL(196mmol)在二丁基醚中的2MPhLi溶液。在搅拌1.5小时后，通过套管加入在200mL THF中的25.2g(81.7mmol)炔1-3，并且将该反应体系在-78℃下搅拌3小时。用饱和NH4Cl水溶液使反应猝灭并且用EtOAc提取两次。合并有机提取物，用盐水洗涤，用Na2SO4干燥，通过旋转蒸发浓缩并且通过使用EtOAc/己烷的柱色谱法纯化而得到1-4为黄色油状物，为(E)和(Z)异构体的混合物。1-4的数据：C23H24F2O3的HRMS(ES)计算值M+Na：409.1586.测定值：409.1586。
步骤4：3-[1-乙酰基-3-(2，5-二氟苯基)-5-苯基-4，5-二氢-1H-吡唑-5-基]丙-1-醇(1-5)的合成
向16.0g(41.4mmol)1-4在150mL吡啶中的溶液中加入3.0mL(62.1mmol)肼水合物并且将所得混合物在90℃下加热45分钟。在冷却至室温后，将该反应体系放入冰浴并且滴加14.7mL(207mmol)乙酰氯。除去冰浴并且将该反应体系在室温下搅拌过夜，此后放入含有EtOAc和盐水的分液漏斗。分离各层并且有机相用1M HCl洗涤两次，用盐水洗涤一次，用Na2SO4干燥并且通过旋转蒸发进行浓缩。将残余物重新悬浮于甲苯中两次并且浓缩至共沸出任何剩余的吡啶。将残余物溶于200mL MeOH并且加入8.0g(42mmol)对-甲苯磺酸一水合物。在室温下搅拌2小时后，通过旋转蒸发除去大部分溶剂并且使残余物分配在饱和NaHCO3水溶液与EtOAc之间。在分离各层后，用碳酸氢盐再次洗涤有机层，然后是盐水，用Na2SO4干燥并且通过旋转蒸发进行浓缩。将残余物与Et2O一起研磨并且通过过滤收集固体物质而得到外消旋物1-5，为白色固体。外消旋物1-5的数据：1HNMR(500MHz，CDCl3)δ7.7(m，1H)，7.4-7.0(m，7H)，3.8-3.65(m，2H)，3.6(m，1H)，3.5(m，1H)，2.9(m，1H)，2.4(s，3H)，2.3(m，1H)，1.7-1.5(m，2H)ppm。C20H20F2N2O3的HRMS(ES)计算值M+H：359.1566.测定值：359.1557
步骤5：3-[(5S)-1-乙酰基-3-(2，5-二氟苯基)-5-苯基-4，5-二氢-1H-吡唑-5-基]丙-1-醇1-5的手性拆分
通过制备型HPLC拆分对映体，其中使用10cm Chiralpak AD柱与92％己烷(含有0.1％二乙胺)、4％MeOH和4％EtOH的洗脱液，流速为150mL/分钟。洗脱下的第一个峰为无活性的(R)异构体，洗脱下的第二个峰为活性(S)异构体。
步骤6：3-[(5S)-1-乙酰基-3-(2，5-二氟苯基)-5-苯基-4，5-二氢-1H-吡唑-5-基]丙基二氢磷酸酯1-6的合成
向250mg(0.70 mmol)(S)-1-5在10mL CH2Cl2中的溶液中加入292μL(2.10mmol)三乙胺、151μL(1.40mmol)氯膦酸(clorophosponate)二甲酯和24mg(0.07mmol)叔丁醇钛(IV)。在室温下搅拌过夜后，使该反应体系分配在EtOAc与饱和NaHCO3水溶液之间。分离各层，用水、盐水洗涤有机层，用MgSO4干燥并且通过旋转蒸发进行浓缩。将残余物溶于0.5mL二甲硫和1mL甲磺酸并且将该混合物在室温下搅拌过夜。然后用少量CH3CN稀释该反应体系并且通过在Delta Pak C18柱上的使用CH3CN/H2O(+0.1％TFA)的制备型HPLC纯化。冻干含有产物的级分而得到1-6，为松散的白色固体。1-6的数据：1HNMR(500MHz，d6-DMSO)δ7.65(m，1H)，7.4(m，4H)，7.2(m，3H)，3.9(m，2H)，3.7(m，1H)，3.4(m，1H)，2.6(m，1H)，2.3(s，3H)，2.3(m，1H)，1.7(m，1H)，1.4(m，1H)ppm；C20H21F2N2O5P的HRMS(APCI)计算值M+H：439.1229.测定值：439.1231。
通过对上述操作步骤的简单修改制备下列化合物。将化合物1-13和1-14分离为外消旋混合物。除非另有说明，将表中的化合物作为游离碱分离。
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化合物 RP R7’ n名称HRMS m/z(M+H)
1-7 H CH3 02-[(5R)-1-乙酰基-3-(2-氟-5-甲基苯基)-5-苯基-4，5-二氢-1H-吡唑-5-基]乙醇HRMS m/z(M+H)341.1521测定值，341.1660理论值.
1-8 P(O)(OH)2 CH3 02-[(5R)-1-乙酰基-3-(2-氟-5-甲基苯基)-5-苯基-4，5-二氢-1H-吡唑-5-基]乙基二氢磷酸酯HRMS m/z(M+H)421.1325测定值，421.1323理论值
1-9 H CH3 12-[(5R)-1-乙酰基-3-(2-氟-5-甲基苯基)-5-苯基-4，5-二氢-1H-吡唑-5-基]丙-1-醇HRMS m/z(M+H)355.1798测定值，355.1817理论值
1-10 P(O)(OH)2 CH3 12-[(5R)-1-乙酰基-3-(2-氟-5-甲基苯基)-5-苯基-4，5-二氢-1H-吡唑-5-基]丙基二氢磷酸酯HRMS m/z(M+H)435.1477测定值，435.1480理论值
1-11 H CH3 22-[(5R)-1-乙酰基-3-(2-氟-5-甲基苯基)-5-苯基-4，5-二氢-1H-吡唑-5-基]丁-1-醇HRMS m/z(M+H)369.1971测定值，369.1973理论值
1-12 P(O)(OH)2 CH3 2 2-[(5R)-1-乙酰基-3-(2- 氟-5-甲基苯基)-5-苯基- 4，5-二氢-1H-吡唑-5-基] 丁基二氢磷酸酯 HRMS m/z(M+H) 449.1630测定值， 449.1636理论值
1-13 H Br 1 3-[1-乙酰基-3-(5-溴-2- 氟苯基)-5-苯基-4，5-二氢 -1H-吡唑-5-基]丙-1-醇 HRMS m/z(M+H) 419.0769测定值， 419.0765理论值
1-14 P(O)(OH)2 Br 1 3-[1-乙酰基-3-(5-溴-2- 氟苯基)-5-苯基-4，5-二氢 -1H-吡唑-5-基]丙基二氢 磷酸酯 HRMS m/z(M+H) 499.0423测定值， 499.0428理论值
序列表
<110>Merck&Co.，Inc.
Coleman，Paul J.
Cox，Christopher D.
Hartman，George D.
<120>有丝分裂驱动蛋白抑制剂的前体药物
<130>21685Y
<150>60/584,517
<151>2004-07-01
<150>60/605,840
<151>2004-08-30
<160>2
<170>FastSEQ for Windows Version 4.0
<210>1
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>全合成核苷酸序列
<400>1
gcaacgatta atatggcgtc gcagccaaat tcgtctgcga ag 42
<210>2
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>全合成核苷酸序列
<400>2
gcaacgctcg agtcagtgat gatggtggtg atgctgattc acttcaggct tattcaatat 60