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1、10申请公布号CN104169415A43申请公布日20141126CN104169415A21申请号201380011332322申请日20130128201204445220120229JPC12N1/21200601C08G73/22200601C12P13/00200601C12N15/0920060171申请人味之素株式会社地址日本东京都72发明人正瑞文田岛义教74专利代理机构北京市柳沈律师事务所11105代理人张文辉54发明名称能够产生3氨基4羟基苯甲酸的大肠杆菌57摘要本发明提供一种用于通过利用大肠杆菌来方便且便宜地产生氨基羟基苯甲酸型化合物如3氨基4羟基苯甲酸的方法，所述大肠杆。
2、菌是常用于通过生物合成的生产过程的细菌。具体地，本发明提供具有产生3氨基4羟基苯甲酸的能力的大肠杆菌，其经过修饰以降低N羟基芳基胺O乙酰基转移酶NHOA的活性；使用这类大肠杆菌来产生3氨基4羟基苯甲酸型化合物的方法；等等。30优先权数据85PCT国际申请进入国家阶段日2014082786PCT国际申请的申请数据PCT/JP2013/0517782013012887PCT国际申请的公布数据WO2013/129001JA2013090651INTCL权利要求书2页说明书18页序列表40页附图1页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书18页序列表40页附图1页10申请公。
3、布号CN104169415ACN104169415A1/2页21具有产生3氨基4羟基苯甲酸的能力的大肠杆菌ESCHERICHIACOLI，其经过修饰以增加从二羟基丙酮磷酸和天冬氨酸半醛形成3氨基4羟基苯甲酸的活性，其中所述大肠杆菌经过修饰以降低N羟基芳基胺O乙酰基转移酶NHOA活性。2依照权利要求1的大肠杆菌，其中所述NHOA活性通过使染色体上的NHOA基因突变或缺失而降低。3依照权利要求1或2的大肠杆菌，其中所述产生3氨基4羟基苯甲酸的能力是通过用掺入有DNA的重组载体进行转化而赋予的，所述DNA编码具有从二羟基丙酮磷酸和天冬氨酸半醛形成3氨基4羟基苯甲酸的活性的蛋白质。4依照权利要求3的大。
4、肠杆菌，其中所述具有形成3氨基4羟基苯甲酸的活性的蛋白质是GRII和GRIH。5依照权利要求4的大肠杆菌，其中所述GRII是依照以下A至C中任一项的蛋白质，且所述GRIH是依照以下D至F中任一项的蛋白质A包含由SEQIDNO5或SEQIDNO14所示氨基酸序列的蛋白质；B包含在上文A所示的氨基酸序列中具有一个或几个氨基酸取代、缺失、插入或添加的氨基酸序列，且具有醛缩酶活性的蛋白质；C包含与上文A所示的氨基酸序列具有70或更高同一性的氨基酸序列，且具有醛缩酶活性的蛋白质；D包含由SEQIDNO7或SEQIDNO16所示氨基酸序列的蛋白质；E包含在上文D所示的氨基酸序列中具有一个或几个氨基酸取代、。
5、缺失、插入或添加的氨基酸序列，且具有3氨基4羟基苯甲酸合酶活性的蛋白质；和F包含与上文D所示的氨基酸序列具有70或更高同一性的氨基酸序列，且具有3氨基4羟基苯甲酸合酶活性的蛋白质。6依照权利要求3的大肠杆菌，其中所述编码具有形成3氨基4羟基苯甲酸的活性的蛋白质的DNA包含GRII基因和GRIH基因。7依照权利要求6的大肠杆菌，其中所述GRII基因是依照以下A至C中任一项的DNA，且所述GRIH基因是依照以下D至F中任一项的DNAA包含由SEQIDNO6或SEQIDNO15所示核苷酸序列的DNA；B在严格条件下与和上文A所示核苷酸序列互补的核苷酸序列杂交，且编码具有醛缩酶活性的蛋白质的DNA；C。
6、与上文A所示的核苷酸序列具有70或更高同一性，且具有醛缩酶活性的DNA；D包含由SEQIDNO8或SEQIDNO17所示核苷酸序列的DNA；E在严格条件下与和上文D所示核苷酸序列互补的核苷酸序列杂交，且编码具有3氨基4羟基苯甲酸合酶活性的蛋白质的DNA；和F与上文D所示的核苷酸序列具有70或更高同一性，且具有3氨基4羟基苯甲酸合酶活性的DNA。8依照权利要求7的大肠杆菌，其中所述GRII基因和所述GRIH基因源自放线菌ACTINOMYCETE。9依照权利要求7的大肠杆菌，其中所述GRII基因和所述GRIH基因源自链霉菌属STREPTOMYCES。权利要求书CN104169415A2/2页310。
7、依照权利要求7的大肠杆菌，其中所述GRII基因和所述GRIH基因源自灰色链霉菌STREPTOMYCESGRISEUS。11依照权利要求7的大肠杆菌，其中所述GRII基因和GRIH基因源自STREPTOMYCESMURAYAMAENSIS。12依照权利要求1至11中任一项的大肠杆菌，其具有编码突变的天冬氨酸激酶III的基因，该酶中的反馈抑制被消除。13一种用于产生3氨基4羟基苯甲酸型化合物的方法，包括培养依照权利要求1至12中任一项的大肠杆菌的步骤。14一种用于产生含有3氨基4羟基苯甲酸型化合物作为组分的聚合物的方法，包括将通过依照权利要求13的方法产生的3氨基4羟基苯甲酸型化合物聚合的步骤。1。
8、5依照权利要求14的方法，其中所述聚合物是聚苯并噁唑POLYBENZOXAZOLE聚合物。权利要求书CN104169415A1/18页4能够产生3氨基4羟基苯甲酸的大肠杆菌发明领域0001本发明涉及具有产生3氨基4羟基苯甲酸的能力的大肠杆菌ESCHERICHIACOLI和使用其产生氨基羟基苯甲酸型化合物的方法。0002发明背景0003氨基羟基苯甲酸型化合物可用作染料、农业化学物、药物和其他合成的有机产物的中间体及可用作一种复杂且耐热性的聚合物聚苯并噁唑POLYBENZOXAZOLE的单体。3氨基4羟基苯甲酸3,4AHBA使用二羟基丙酮磷酸DHAP和天冬氨酸半醛ASA作为底物通过GRII和GRI。
9、H两者在两步中生物合成，GRII是催化具有氨基基团的C4化合物与C3或C4化合物之间的碳碳结合反应的酶，GRIH是催化在脱羧基化情况下C7化合物环化或C8化合物环化的酶。0004化学物100050006以下内容作为与本发明有关的现有技术是可获得的。0007在专利文献1中公开了一种使用其中引入GRII和GRIH的灰色链霉菌STREPTOMYCESGRISEUS产生3,4AHBA的方法。专利文献1还披露了形成作为3,4AHBA副产物的3乙酰氨基4羟基苯甲酸3,4ACAHBA，且3,4ACAHBA被脱乙酰化以形成3,4AHBA。例示了使用强碱如氢氧化钠和强酸如盐酸作为将3,4ACAHBA脱乙酰化的特。
10、定方法。然而，这类方法具有的问题在于必须使用强碱和强酸。0008在专利文献2中披露了通过使用其中引入GRII和GRIH的谷氨酸棒杆菌CORYNEBACTERIUMGLUTAMICUM来形成3,4AHBA。0009在非专利文献1中披露了通过将GRII和GRIH引入大肠杆菌来形成3,4AHBA和3,4ACAHBA。0010在非专利文献2中披露了当芳基胺N乙酰基转移酶基因NATA在灰色链霉菌中缺失时，培养物中不形成3,4ACAHBA。说明书CN104169415A2/18页50011在非专利文献3中披露了源自大肠杆菌的N羟基芳基胺O乙酰基转移酶基因NHOA作用为催化芳香族氨基基团的乙酰化。同时，在非。
11、专利文献4中披露了大肠杆菌BAP1菌株形成N乙酰化形式3,5ACAHBA作为3,5AHBA3,4AHBA的结构异构体的副产物，在大肠杆菌BAP1的NHOA基因缺失菌株MAR1菌株中也产生3,5ACAHBA作为副产物，如此，NHOA似乎不是3,5AHBA的N乙酰化的主要因子。0012现有技术文献0013专利文献0014专利文献1JP2004283163A0015专利文献2国际公开文本WO2010/0050990016非专利文献0017非专利文献1JBIOLCHEM，2812006，36944369510018非专利文献2JBACTERIOL，1892007，215521590019非专利文献3B。
12、IOCHIMBIOPHYSACTA，14752000，10160020非专利文献4JANTIBIOT，VOL592006，P4640021发明概述0022本发明要解决的问题0023本发明根据这类现有技术的实际情况完成，而且本发明的目的是提供一种用于通过利用大肠杆菌来方便且便宜地产生氨基羟基苯甲酸型化合物如3氨基4羟基苯甲酸的方法，所述大肠杆菌是常用于通过生物合成方法的生产工艺的细菌。0024用于解决问题的手段0025由于大量研究，发明人已经发现了NHOA涉及大肠杆菌中从3,4AHBA以副产物形成3,4ACAHBA，如此可通过使用经修饰以降低NHOA活性的大肠杆菌大量产生未乙酰化的3,4AHBA。
13、，并完成了本发明。0026亦即，本发明如下。00271具有产生3氨基4羟基苯甲酸的能力的大肠杆菌，其经过修饰以增加从二羟基丙酮磷酸和天冬氨酸半醛形成3氨基4羟基苯甲酸的活性，其中所述大肠杆菌经过修饰以降低N羟基芳基胺O乙酰基转移酶NHOA活性。00282依照1的大肠杆菌，其中通过使染色体上的NHOA基因突变或缺失来降低所述NHOA活性。00293依照1或2的大肠杆菌，其中所述产生3氨基4羟基苯甲酸的能力是通过用掺入有DNA的重组载体进行转化而赋予的，所述DNA编码具有从二羟基丙酮磷酸和天冬氨酸半醛形成3氨基4羟基苯甲酸的活性的蛋白质。00304依照3的大肠杆菌，其中所述具有形成3氨基4羟基苯甲。
14、酸的活性的蛋白质是GRII和GRIH。00315依照4的大肠杆菌，其中所述GRII是依照以下A至C中任一项的蛋白质，且所述GRIH是依照以下D至F中任一项的蛋白质0032A包含由SEQIDNO5或SEQIDNO14所示氨基酸序列的蛋白质；0033B包含在上文A所示的氨基酸序列中具有一个或几个氨基酸取代、缺失、插入或添加的氨基酸序列，且具有醛缩酶活性的蛋白质；说明书CN104169415A3/18页60034C包含与上文A所示的氨基酸序列具有70或更高同一性的氨基酸序列，且具有醛缩酶活性的蛋白质；0035D包含由SEQIDNO7或SEQIDNO16所示氨基酸序列的蛋白质；0036E包含在上文D所。
15、示的氨基酸序列中具有一个或几个氨基酸取代、缺失、插入或添加的氨基酸序列，且具有3氨基4羟基苯甲酸合酶活性的蛋白质；和0037F包含与上文D所示的氨基酸序列具有70或更高同一性的氨基酸序列，且具有3氨基4羟基苯甲酸合酶活性的蛋白质。00386依照3的大肠杆菌，其中所述编码具有形成3氨基4羟基苯甲酸的活性的蛋白质的DNA包含GRII基因和GRIH基因。00397依照6的大肠杆菌，其中所述GRII基因是依照以下A至C中任一项的DNA，且所述GRIH基因是依照以下D至F中任一项的DNA0040A包含由SEQIDNO6或SEQIDNO15所示核苷酸序列的DNA；0041B在严格条件下与和上文A所示核苷酸。
16、序列互补的核苷酸序列杂交，且编码具有醛缩酶的活性的蛋白质的DNA；0042C与上文A所示的核苷酸序列具有70或更高同一性，且具有醛缩酶的活性的DNA；0043D包含由SEQIDNO8或SEQIDNO17所示核苷酸序列的DNA；0044E在严格条件下与和上文D所示核苷酸序列互补的核苷酸序列杂交，且编码具有3氨基4羟基苯甲酸合酶的活性的蛋白质的DNA；和0045F与上文D所示的核苷酸序列具有70或更高同一性，且具有3氨基4羟基苯甲酸合酶的活性的DNA。00468依照7的大肠杆菌，其中所述GRII基因和GRIH基因源自放线菌ACTINOMYCETE。00479依照7的大肠杆菌，其中所述GRII基因和。
17、GRIH基因源自链霉菌属STREPTOMYCES。004810依照7的大肠杆菌，其中所述GRII基因和GRIH基因源自灰色链霉菌STREPTOMYCESGRISEUS。004911依照7的大肠杆菌，其中所述GRII基因和GRIH基因源自STREPTOMYCESMURAYAMAENSIS。005012依照1至11中任一项的大肠杆菌，其具有编码突变的天冬氨酸激酶III的基因，该酶中的反馈抑制被消除。005113一种用于产生3氨基4羟基苯甲酸型化合物的方法，包括培养依照1至12中任一项的大肠杆菌的步骤。005214一种用于产生含有3氨基4羟基苯甲酸型化合物作为组分的聚合物的方法，包括将通过依照13的。
18、方法产生的3氨基4羟基苯甲酸型化合物聚合的步骤。005315依照14的方法，其中所述聚合物是聚苯并噁唑聚合物。0054发明效果0055依照本发明，可以方便且便宜地产生氨基羟基苯甲酸型化合物如3氨基4羟基苯甲酸。说明书CN104169415A4/18页7附图说明0056图1是显示通过下列各项的反相柱层析得到的分析结果的图A大肠杆菌BW25113菌株的培养上清液，B大肠杆菌BW25113NHOA菌株的培养上清液，和C3,4AHBA的标准制备物。0057发明详述0058实施本发明的最佳模式0059本发明提供了作为具有产生3氨基4羟基苯甲酸的能力的细菌的大肠杆菌。在本发明的细菌中可以抑制乙酰化副产物3。
19、,4ACAHBA的形成。0060降低N羟基芳基胺O乙酰基转移酶NHOA的活性的修饰0061在本发明的细菌中，可通过修饰细菌以降低N羟基芳基胺O乙酰基转移酶NHOA的活性来抑制乙酰化副产物的形成。所述NHOA活性是N羟基芳基胺O乙酰基转移酶活性，而且指从3氨基4羟基苯甲酸3,4AHBA与3,4AHBA相关地形成3乙酰氨基4羟基苯甲酸3,4ACAHBA的活性。0062短语“经修饰以降低NHOA活性”指NHOA活性变得低于未经修饰的菌株例如野生型大肠杆菌中的比活。NHOA活性优选相比于未经修饰菌株中的NHOA活性降低至每微生物细胞50或更低，优选30或更低，且更期望地10或更低。“降低”包括其中活性。
20、完全消失的情况。在本发明的大肠杆菌中，仅需要NHOA活性低于野生型菌株或未经修饰的菌株中的，但3,4AHBA的进一步累积相比于这些菌株是期望增强的。短语“经修饰以降低NHOA活性”对应于其中每细胞的NHOA分子数降低的情况和其中每分子NHOA活性降低的情况等。具体地，可通过常规诱变或基因工程处理引入降低NHOA活性的修饰。诱变的例子可以包括用X射线或紫外线辐射和用诱变剂如N甲基N硝基N亚硝基胍处理。这类修饰的例子可以包括将突变引入染色体上的NHOA基因包含表达调控区或缺失部分或全部的NHOA基因，从而NHOA活性相比于非突变菌株可以降低或消失。用于使基因突变或缺失的方法的例子可以包括表达调控区。
21、如启动子序列和SHINEDALGARNOSD序列的修饰，将错义突变、无义突变或移框突变引入到可读框中，以及基因的部分缺失JBIOLCHEM1997，2721386117。可将NHOA基因的突变和缺失引入微生物中，其通过使用同源重组方法其中将染色体上的野生型基因用具有突变或缺失的基因替换或通过使用转座子或IS因子进行。同源重组方法可以包括使用线性DNA、温度敏感性质粒和非复制质粒的方法。这些方法记载于PROCNATLACADSCIUSA，2000JUN6；971266405、美国专利NO6,303,383，JP05007491A等中。0063可通过使用从候选微生物菌株获得的细胞提取物或从其纯化的。
22、级分测量酶活性，并将该活性与野生菌株或未经修饰菌株的活性进行比较来确认靶酶的活性和降低的活性的水平。例如，可通过非专利文献3中描述的方法来测量NHOA活性。0064经修饰以降低NHOA活性的大肠杆菌可以包括本质上具有产生3,4AHBA的能力的大肠杆菌和本质上没有产生3,4AHBA的能力，但已经被给予产生3,4AHBA的能力的大肠杆菌。可通过后面描述的方法给予产生3,4AHBA的能力。适宜的菌株可用作本发明中使用的大肠杆菌，并且其例子可以包括K12菌株ATCC10798或其次代菌株SUBSTRAIN例如BW25113CGSC7630，DH1ATCC33747，MG1655ATCC700926，W。
23、3110ATCC27325，和B说明书CN104169415A5/18页8菌株或其次代菌株例如BL21ATCCBAA1025，REL606CGSC12149。在上述菌株中以CGSC编号指定的那些菌株可从大肠杆菌遗传储备中心THECOLIGENETICSTOCKCENTERHTTP/CGSCBIOLOGYYALEEDU/获得。在上述菌株中以ATCC编号指定的那些菌株可从美国典型培养物保藏中心HTTP/WWWATCCORG/获得。0065NHOA可以包括以下蛋白质，其包含与SEQIDNO2所示的氨基酸序列具有70或更高，优选80或更高，更优选90或更高，仍更优选95或更高，特别优选98或99或更高。
24、同一性的氨基酸序列且具有NHOA活性。NHOA基因还可以包含如下的基因，其包含与SEQIDNO23所示的核苷酸序列具有70或更高，优选80或更高，更优选90或更高，仍更优选95或更高，特别优选98或99或更高同一性的核苷酸序列且编码具有NHOA活性的蛋白质。0066可通过使用KARLIN和ALTSCHUL的算法BLASTPRONATLACADSCIUSA，90，58731993或PEARSON的FASTAMETHODSENZYMOL，183，631990来测定氨基酸序列之间或核苷酸序列之间的同源性例如同一性或相似性。已基于此算法BLAST开发出称为BLASTP和BLASTN的程序参见HTTP/。
25、WWWNCBINLMNIHGOV。如此，可使用具有缺省设置的这些程序来计算氨基酸序列之间和核苷酸序列之间的同源性。再例如，通过使用在ORF中编码的多肽的全长部分，使用具有比较单元大小UNITSIZETOCOMPARE2的设置的软件GENETYXVER709其可从GENETYXCORPORATION获得，采用LIPMANPEARSON方法计算为百分比获得的数值可用作氨基酸序列之间的同源性。可采用从这些计算得到的数值中的最低值作为氨基酸序列之间和核苷酸序列之间的同源性。0067NHOA基因的核苷酸序列根据大肠杆菌的菌株有时是不同的。由NHOA基因编码的蛋白质的例子可以包括如下的蛋白质，其包含在SE。
26、QIDNO2所示的氨基酸序列的一个或多个位置处具有一个或几个氨基酸取代、缺失、插入或添加的氨基酸序列，且具有NHOA活性。这里，“几个”随蛋白质三维结构中的氨基酸残基的类型位置等而变化，但优选指1至50，更优选1至20，仍更优选1至10且特别优选1至5。这类取代、缺失、插入、添加等包括基于具有NHOA基因的微生物的个体差异从天然存在的突变突变体或变体得到的那些。0068NHOA基因还可以是在严格条件下与和SEQIDNO23所示核苷酸序列互补的核苷酸序列杂交，且编码具有NHOA活性的蛋白质的DNA。这里，“严格条件”指其中形成所谓的特异性杂合物而不形成非特异性杂合物的条件。一个例子是其中具有高同。
27、源性例如同一性或相似性，例如70或更高，优选80或更高，更优选90或更高，仍更优选95或更高，且特别优选98或更高同源性的多核苷酸彼此杂交，而具有比它要低的同源性的多核苷酸彼此不杂交的条件。具体地，这类条件可以包括在约45在6XSSC氯化钠/柠檬酸钠中杂交，继之以在02XSSC和01SDS中于50至65的一次或两次或更多次清洗。0069增加从二羟基丙酮磷酸和天冬氨酸半醛产生3氨基4羟基苯甲酸的活性的修饰0070本发明的细菌可以是经修饰以增加从二羟基丙酮磷酸DHAP和天冬氨酸半醛ASA产生3氨基4羟基苯甲酸3,4AHBA的活性的细菌。这类修饰可通过例如将本发明的细菌用掺入编码蛋白质的DNA的重组。
28、载体转化来实现，所述蛋白质具有从DHAP和ASA形成3,4AHBA的活性。具有从DHAP和ASA形成3,4AHBA的活性的蛋白质不受具体限制，只要该蛋白质有助于从DHAP和ASA形成3,4AHBA，且包括例如具有催化DHAP和ASA之间说明书CN104169415A6/18页9的碳碳键形成的酶活性下文中有时缩写为“醛缩酶活性”和具有催化通过形成DHAP和ASA之间的碳碳键而获得的C7化合物环化的酶活性下文中有时缩写为3氨基4羟基苯甲酸合酶活性的蛋白质。在下文中，上述两种活性有时称为生物合成3,4AHBA的能力。0071编码具有催化DHAP和ASA之间的碳碳键形成的酶活性的蛋白质的基因可以包括源。
29、自灰色链霉菌的GRII基因或GRII基因同源物GRII基因和GRII基因同源物两者有时一起简称为GRII基因。GRII基因同源物指源自另一种微生物，与源自灰色链霉菌的上述基因展现出高同源性，且编码具有醛缩酶活性的蛋白质的基因。这类基因可通过BLAST搜索来搜寻。其例子可以包括源自STREPTOMYCESMURAYAMAENSIS的NSPI基因SEQIDNO14和15，源自弗兰克氏菌FRANKIASP的果糖双磷酸醛缩酶登录号YP_483282和果糖双磷酸醛缩酶登录号YP_481172，源自疮痂病链霉菌STREPTOMYCESSCABIES的果糖双磷酸醛缩酶HTTP/WWWSANGERACUK/C。
30、GIBIN/BLAST/SUBMITBLAST/S_SCABIES，源自伯克氏菌BURKHOLDERIASP383的果糖双磷酸醛缩酶登录号Q39NQ9，源自詹氏甲烷球菌METHANOCOCCUSJANNASCHII的果糖双磷酸醛缩酶登录号NP_247374，和源自大肠杆菌的DHN基因登录号NC_000913JOURNALOFBIOCHEMISTRYVOL281，NO48，PP3694436951，补充数据。0072编码具有催化通过形成DHAP和ASA之间的碳碳键获得的C7化合物环化的酶活性的蛋白质的基因可以包括源自灰色链霉菌的GRIH基因或GRIH基因同源物GRIH基因和GRIH基因同源物两者。
31、有时一起简称为GRIH基因。GRIH基因同源物指源自另一种微生物，展现出与源自灰色链霉菌的基因的高同源性，且编码具有3氨基4羟基苯甲酸合酶活性的蛋白质的基因。这类基因可通过BLAST搜索来搜寻。其例子可以包括源自STREPTOMYCESMURAYAMAENSIS的NSPH基因SEQIDNO16和17，源自弗兰克氏菌的3脱氢奎宁酸DEHYDROQUINATE合酶登录号YP_483283和3脱氢奎宁酸合酶登录号YP_481171，源自伯克氏菌383的3脱氢奎宁酸合酶登录号YP_366552和3脱氢奎宁酸合酶登录号YP_366553，源自疮痂病链霉菌的3脱氢奎宁酸合酶，和源自詹氏甲烷球菌的3脱氢奎宁。
32、酸合酶登录号NP_248244JOURNALOFBIOCHEMISTRYVOL281，NO48，PP3694436951，补充数据。0073可在本发明中使用源自任何生物体的GRII和GRIH或GRII基因和GRIH基因。例如，它们可以源自微生物如上文描述的细菌或放线菌ACTINOMYCETE，而且优选地可以源自放线菌。放线菌的例子可以包括属于链霉菌属的微生物。属于链霉菌属的微生物的例子可以包括灰色链霉菌、STREPTOMYCESMURAYAMAENSIS、变铅青链霉菌STREPTOMYCESLIVIDANS和疮痂病链霉菌。GRII和GRIH或GRII基因和GRIH基因可以源自相同的微生物或不同。
33、的微生物。0074期望包含与作为由上述GRII基因编码的蛋白质的氨基酸序列的SEQIDNO5或14具有70或更高，优选80或更高，更优选90或更高，仍更优选95或更高，特别优选98或99或更高同一性的氨基酸序列，且具有醛缩酶活性的蛋白质作为GRII同源物。其例子可以包括专利文献2中的SEQIDNO9，11，13，15，17，19和21。还期望包含与作为GRII基因的核苷酸序列的SEQIDNO6或15具有70或更高，优选80或更高，更优选说明书CN104169415A7/18页1090或更高，仍更优选95或更高，特别优选98或99或更高同一性的核苷酸序列，且编码具有醛缩酶活性的蛋白质的核苷酸序列。
34、作为GRII基因同源物。其例子可以包括专利文献2中的SEQIDNO8，10，12，14，16，18和20。0075期望包含与作为由上述GRIH基因编码的蛋白质的氨基酸序列的SEQIDNO7或16具有70或更高，优选80或更高，更优选90或更高，仍更优选95或更高，特别优选98或99或更高同一性的氨基酸序列，且具有3氨基4羟基苯甲酸合酶活性的蛋白质作为GRIH同源物。其例子可以包括专利文献2中的SEQIDNO23，25，27，29，31，33和35。还期望包含与作为GRIH基因的核苷酸序列的SEQIDNO8或17具有70或更高，优选80或更高，更优选90或更高，仍更优选95或更高，特别优选98或。
35、99或更高同一性的核苷酸序列，且编码具有3氨基4羟基苯甲酸合酶活性的蛋白质的核苷酸序列作为GRIH基因同源物。其例子可以包括专利文献2中的SEQIDNO22，24，26，28，30，32和34。0076对于本领域技术人员来说，氨基酸序列中对活性无影响的突变的氨基酸残基位置是明显的，但可以参照序列比对进一步制备蛋白质突变体。具体地，本领域技术人员能1比较多个同源物蛋白质的氨基酸序列，2证明相对保守的区域和相对不保守的区域，然后3从相对保守区域和相对不保守区域分别预测出能起功能性重要作用的区域和不能起功能性重要作用的区域，如此识别结构和功能的相关关系。专利文献2披露了上文GRII基因同源物的氨基酸。
36、序列的比对专利文献2中的图1和2，上文GRIH基因同源物的氨基酸序列的比对专利文献2中的图3和4，及其共有共同序列专利文献2中的SEQIDNO36和37。上文GRII基因同源物包括编码专利文献2中由SEQIDNO36所示氨基酸序列的基因，而上文GRIH基因同源物包括编码专利文献2中由SEQIDNO37所示氨基酸序列的基因。0077可以如上文描述的那样测定氨基酸序列之间和核苷酸序列之间的同源性例如同一性或相似性。0078GRII基因或GRIH基因的核苷酸序列可以随微生物的物种和微生物菌株而不同。如此，GRII基因和GRIH基因仅必需能够通过将其在大肠杆菌中表达例如提升其表达增强在大肠杆菌中产生3。
37、,4AHBA的能力。例如，期望在由GRII基因编码的蛋白质的氨基酸序列SEQIDNO5或14中的一个或多个位置处包含一个或几个氨基酸取代、缺失、插入、添加等，且具有醛缩酶活性的蛋白质作为由GRII基因编码的蛋白质。其例子可以包括专利文献2中的SEQIDNO9，11，13，15，17，19和21。期望在由GRIH基因编码的蛋白质的氨基酸序列SEQIDNO7或16中的一个或多个位置处包含一个或几个氨基酸取代、缺失、插入、添加等，且具有3氨基4羟基苯甲酸合酶活性的蛋白质作为由GRIH基因编码的蛋白质。其例子可以包括专利文献2中的SEQIDNO23，25，27，29，31，33和35。本文中，“几个”。
38、根据蛋白质三维结构中的氨基酸残基的类型或位置而变化，但优选指1至50，更优选1至20，仍更优选1至10且特别优选1至5。这类氨基酸取代、缺失、插入、添加等包括基于具有GRII基因或GRIH基因的微生物的个体差异或物种差异从天然存在的突变突变体或变体得到的那些。所述取代优选为保守取代，其为功能未被改变的中性取代。保守取代如上文所述。0079另外，GRII基因和GRIH基因的简并性根据导入这类基因的宿主而变化。如此，可说明书CN104169415A108/18页11以用大肠杆菌中可用的密码子替换密码子。类似地，GRII基因和GRIH基因可以是编码在N端侧和/或C端侧延伸或截短的蛋白质的基因，只要该。
39、基因具有增强在大肠杆菌中产生3,4AHBA的能力的功能。例如，延伸或截短的残基的长度为50或更少，优选20或更少，更优选10或更少，特别优选5或更少个氨基酸残基。更具体地，所述基因可以是编码其中已延伸或截短N端侧的50至5个氨基酸残基或C端侧的50至5个氨基酸残基的蛋白质的基因。0080可以如下获得这类与GRII基因或GRIH基因同源的基因，即例如通过定点诱变修饰编码氨基酸序列的基因，从而在所编码蛋白质的特定位置处的氨基酸残基可以包含取代、缺失、插入或添加。这类同源基因还可以通过常规已知的突变处理如下获得。用羟胺等体外处理GRII基因或GRIH基因的方法和用紫外线或突变剂如一般用于突变处理的N。
40、甲基N硝基N亚硝基胍NTG或乙基甲磺酸盐EMS处理携带该基因的微生物的方法，易错PCRCADWELL，RCPCRMETHAPPL2，281992，DNA改组STEMMER，WPNATURE370，3891994，和STEPPCRZHAO，HNATUREBIOTECHNOL16，2581998可用作突变处理。利用这些处理，可以通过基因重组人工地将突变引入GRII基因或GRIH基因中以获得编码具有高活性的酶的基因。0081所述GRII基因还可以是在严格条件下与和GRII基因或其同源物基因的核苷酸序列例如专利文献2中的SEQIDNO6或15，或SEQIDNO8，10，12，14，16，18或20互补。
41、的核苷酸序列杂交，且编码具有醛缩酶活性的蛋白质的DNA。所述GRIH基因还可以是在严格条件下与和GRIH基因或其同源物基因的核苷酸序列例如专利文献2中的SEQIDNO8或17，或SEQIDNO22，24，26，28，30，32或34互补的核苷酸序列杂交，且编码具有3氨基4羟基苯甲酸合酶活性的蛋白质的DNA。“严格条件”与上文的描述相同。0082将关于上述基因同源物和保守取代的描述以相同方式应用于本文描述的其他基因。0083这些GRII基因和GRIH基因及其同源物基因是否编码增强产生3,4AHBA的能力的蛋白质可通过将这些基因引入具有编码反馈抑制被消除的突变天冬氨酸激酶的基因的细菌等中，并检查形。
42、成3,4AHBA的活性是否增强来确认。在此类情况中，可通过使用依照例如SUZUKI等的方法JBIOCHEM，281，8238332006的反相层析量化3,4AHBA来更清楚地确认该影响。0084重组载体0085可以通过将期望基因引入表达载体来获得可在本发明中使用的重组载体。例如，当使用GRII和GRIH两者时，可将它们在分别用于转化的分开的重组载体中携带，或可经由适宜的间隔区连接并在同一重组载体中携带以用于转化，只要它们分别以可表达状态包含在转化体中。GRII基因和GRIH基因可源自相同的微生物或不同的微生物。当GRII基因和GRIH基因源自相同的微生物且在染色体上极其紧密定位时，可将包含GR。
43、II和GRIH两者的DNA片段切出并在载体中携带。0086用于本发明的重组载体一般具有启动子，本发明的前述DNA例如GRII和GRIH，和基因在大肠杆菌中表达必需的、在适宜位置处使得其能起作用的调控区操纵基因和终止子。0087可用作重组载体的表达载体不受具体限制，仅必需能在大肠杆菌中起作用，且可说明书CN104169415A119/18页12以是那些在染色体外自身复制如质粒，或者可以整合到细菌中的染色体中的表达载体。具体地，表达载体的例子可以包括PSTV例如PSTV28，PUC例如PUC18，PUC19，PBR例如PBR322，PHSG例如PHSG298，PHSG299，PHSG399，PHS。
44、G398，PACYC例如PACYC177，PACYC184，PMW例如PMW118，PMW119，PMW218，PMW219，PQE例如PQE及其衍生物。0088可用于本发明的启动子不受具体限制，且可以使用一般用于在大肠杆菌中产生外来蛋白质的启动子。其例子可以包括有力的启动子如T7启动子、LAC启动子、TRP启动子、TRC启动子、TAC启动子、LAMBDA噬菌体的PR启动子和PL启动子、T5启动子等。0089转化体0090本发明的细菌不受具体的限制，只要这是经修饰以具有产生3氨基4羟基苯甲酸和降低N羟基芳基胺O乙酰基转移酶NHOA活性的能力的大肠杆菌，且优选地是转化体。本发明的转化体优选通过用。
45、重组载体转化获得，在所述重组载体中已经引入编码具有从二羟基丙酮磷酸和天冬氨酸半醛形成3氨基4羟基苯甲酸的活性的蛋白质的DNA。0091用作宿主的大肠杆菌优选为能有效供应作为3氨基4羟基苯甲酸型化合物生物合成底物的二羟基丙酮磷酸和天冬氨酸半醛的菌株。大肠杆菌具有为非偶联酶并单独起作用的天冬氨酸激酶IIIAKIII。大肠杆菌中的AKIII最初经历通过赖氨酸的反馈抑制。本发明的大肠杆菌优选具有如下的AKIII基因，其具有能消除赖氨酸的反馈抑制的突变。0092已对源自多种微生物如大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌和粘质沙雷氏菌SERRATIAMARCESCENS的天冬氨酸激酶报告了能消除氨基酸如赖氨酸的反馈抑制的。
46、突变。例如，在位置250的谷氨酸到赖氨酸的突变E250K、在位置318的甲硫氨酸到异亮氨酸的突变M318I、在位置344的苏氨酸到甲硫氨酸的突变T344M、在位置345的丝氨酸到亮氨酸的突变S345L、和在位置352的苏氨酸到异亮氨酸的突变T352I已报告为能消除大肠杆菌的AKIII中的赖氨酸反馈抑制的突变参见例如KIKUCHI等，FEMSMICROBIOLOGYLETTERS173，2112151999，和FALCO等，BIOTECHNOLOGY13，5775821995。因此，具有其中已引入这类突变的AKIII基因的大肠杆菌可用于本发明中。几个氨基酸残基随AKIII来源的大肠杆菌菌株而不同。
47、，即使在野生型AKIII中，而且可以使用这类等位突变体。可以鉴定出等位突变体中要修饰以用于消除反馈抑制的位置，其通过进行本领域技术人员公知的序列比对进行。可以通过本领域技术人员已知的方法来实现消除AKIII中的反馈抑制的修饰，例如通过获得对赖氨酸类似物如2氨乙基半胱氨酸具有抗性的突变体菌株，或通过利用同源重组的基因替换引入位点特异性突变。还有，可通过用包含其中消除反馈抑制的突变AKIII基因的质粒转化大肠杆菌来获得具有提升的其中反馈抑制被消除的突变AKIII的活性的大肠杆菌。0093在具有其中反馈抑制被消除的突变AKIII的大肠杆菌中，可以进一步增加丙酮酸羧化酶基因的表达。0094依照本领域中。
48、已知的方法，可用掺入编码以下蛋白质的DNA的重组载体来转化大肠杆菌，所述蛋白质具有从二羟基丙酮磷酸和天冬氨酸半醛形成3氨基4羟基苯甲酸的活性。例如，可以使用原生质体方法GENE，39，2812861985、电穿孔方法BIO/TECHNOLOGY，7，106710701989等。当进行用于消除AKIII中的反馈抑制的转化时，可以首先实施赋予形成3,4AHBA活性的转化或用于消除AKIII中的反馈抑制的转化。0095用于产生3氨基4羟基苯甲酸型化合物和包含其作为组分的聚合物的方法说明书CN104169415A1210/18页130096本发明还提供一种用于产生3氨基4羟基苯甲酸型化合物的方法，包括。
49、培养本发明的细菌的步骤。0097本发明中的3氨基4羟基苯甲酸型化合物包括具有以下结构的3氨基4羟基苯甲酸下文有时缩写为“3,4AHBA”以及其衍生物和盐。0098化学物200990100在3氨基4羟基苯甲酸的衍生物中，1选自下组的至少一个基团是衍生化的在位置1的羧基基团，在位置3的氨基基团和在位置4的羟基基团，2保留在位置1的羧基基团、在位置3的氨基基团和在位置4的羟基基团，且在从位置2、5和6的碳原子选择的至少一个碳原子上的氢原子被其他原子或基团取代，或3组合1和2。上文2中其他原子或基团的例子可以包括卤素原子例如氟原子、溴原子、氯原子、碘原子、烃基ALKYL基团例如具有1至6个碳原子的烃基基团，如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基和己基、羟基基团、烷氧基ALKOXYL基团烃基模块与上文的描述相同、氨基基团、单烃基氨基或双烃基氨基基团烃基模块与上文的描述相同、氰基基团、硝基基团、磺酰基基团和羧基基团。具体地，上文1中衍生物的例子可以包括其中位置1的羧基基团被衍生化的衍生物例如3氨基4羟基苯醛，其中3氨基4羟基苯甲酸中的羧基基团是醛化的，其中位置3的氨基基团被如上述烃基基团的基团衍生化的衍生物例如3烃基氨基衍生物，和其中位置4的羟基基团被如上述烃基基团衍生化的衍生。