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1、10申请公布号CN104316500A43申请公布日20150128CN104316500A21申请号201410485961622申请日20140922G01N21/64200601C09K11/06200601C08B37/0820060171申请人东南大学地址210008江苏省南京市玄武区四牌楼2号72发明人吴富根贾浩然王宏银74专利代理机构南京苏高专利商标事务所普通合伙32204代理人沈振涛54发明名称一种长时间细胞膜成像试剂及其制备方法57摘要本发明公开了一种长时间细胞膜成像试剂，其特征在于由组分A和组分B组成；所述组分A为侧链含有生物素和疏水单元的乙二醇壳聚糖GLYCOLCHITO。
2、SAN高分子；所述组分B为接枝有异硫氰酸荧光素FITC的亲和素分子。本发明提供的细胞膜成像试剂生物相容性好、成像效果优良，且能长时间保持在细胞膜上而不被内吞，可作为新一类细胞膜成像试剂。51INTCL权利要求书1页说明书4页附图3页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书4页附图3页10申请公布号CN104316500ACN104316500A1/1页21一种长时间细胞膜成像试剂，其特征在于由组分A和组分B组成；所述组分A为侧链含有生物素和疏水单元的乙二醇壳聚糖高分子；所述组分B为接枝有荧光分子的亲和素分子。2根据权利要求1所述的一种长时间细胞膜成像试剂，其特征在于。
3、所述生物素占组分A的乙二醇壳聚糖重复单元数的530；所述疏水单元占组分A的乙二醇壳聚糖高分子重复单元数的530。3根据权利要求1中所述的一种长时间细胞膜成像试剂，其特征在于所述乙二醇壳聚糖分子量在10000以上，优选10000100000。4根据权利要求1中所述的一种长时间细胞膜成像试剂，其特征在于所述生物素包括生物素N琥珀酰亚胺基酯；所述生物素通过与氨基反应接枝在壳聚糖高分子上。5根据权利要求1中所述的一种长时间细胞膜成像试剂，其特征在于所述疏水单元包括胆固醇、磷脂分子、烷烃和维生素E；所述疏水单元通过聚乙二醇高分子链接到乙二醇壳聚糖的氨基上；所述其中聚乙二醇高分子分子量在500以上。6根据。
4、权利要求1中所述的一种长时间细胞膜成像试剂，其特征在于所述荧光分子包括异硫氰酸荧光素或磺基罗丹明B磺酰氯，其通过与氨基反应接枝在亲和素分子表面。7一种长时间细胞膜成像试剂的制备方法，其特征在于包括以下步骤1将生物素、疏水单元和乙二醇壳聚糖分别溶于PBS缓冲液中，混匀，室温反应；产物透析、冻干，即得组分A；2将异硫氰酸荧光素和亲和素溶液混匀使反应；产物透析、冻干，即得组分B。权利要求书CN104316500A1/4页3一种长时间细胞膜成像试剂及其制备方法技术领域0001本发明属于生物技术领域，特别涉及了一种长时间细胞膜荧光成像试剂，还涉及该试剂的制备方法。背景技术0002细胞膜不仅在结构上作为细。
5、胞的边界，为细胞提供一个相对稳定的内环境，同时对细胞与外界环境之间的物质运输、能量转换和信息传递过程也起着至关重要的作用。细胞膜成像技术作为一种有力的研究手段，利用荧光染料对细胞膜进行标记和示踪，揭示了包括胞饮、胞吐、细胞分裂及凋亡在内的许多重要的生物学过程。0003然而，传统的一些亲脂性染料很快会发生内吞现象，成像时间短，给研究带来很大的局限。如目前市售的荧光染料DII、DIO及DID等，有效成像时间只有10分钟左右，染料会逐渐进入细胞质并将整个细胞染色，从而失去了研究细胞膜的效果。为了延长有效染色时间，减少染料内吞，已有公司研制出新型染料分子，如CELLMASKTMORANG、DEEPRE。
6、D系列，主要利用带有负电荷的亲脂性基团起锚定作用延长细胞膜染色时间，但染色时间也只局限在30分钟至90分钟。为了更好地对细胞膜的结构和功能进行研究，开发一种长时间细胞膜成像试剂就显得尤为重要。发明内容0004发明目的本发明的目的是提供一种成像时间长的细胞膜成像试剂。0005技术方案一种长时间细胞膜成像试剂，其特征在于由组分A和组分B组成；所述组分A为侧链含有生物素BIOTIN和疏水单元的乙二醇壳聚糖GLYCOLCHITOSAN；所述组分B为接枝有荧光分子的亲和素AVIDIN分子。组分A选用乙二醇壳聚糖作为连接生物素和疏水单元的骨架是由于它在任何PH值的水溶液中均有很好的溶解性，并且具有低免疫原。
7、性、生物相容性、生物可降解性、生物活性等特点。组分A中的疏水单元可通过疏水相互作用以多位点的方式插入到细胞膜上的磷脂双分子层的疏水尾部区域，从而将壳聚糖高分子和生物素分子锚定到细胞膜上。组分B中的亲和素通过与生物素特异性结合，将荧光分子引入到高分子侧链，进而实现长时间细胞膜成像。作为优选，所述生物素占乙二醇壳聚糖的重复单元数的530；所述疏水单元占乙二醇壳聚糖的重复单元数的530。0006作为另一种优选，所述乙二醇壳聚糖的分子量在10000以上，优选10000100000。0007作为另一种优选，所述生物素包括生物素N琥珀酰亚胺基酯NHSBIOTIN，CAS号35013720；所述生物素通过与。
8、氨基反应接枝在壳聚糖高分子上，用于与接枝有荧光素分子的亲和素分子特异性结合即BITOIN与AVIDIN的特异性识别。0008作为另一种优选，所述疏水单元包括胆固醇、磷脂分子、烷烃以及维生素E，用于细胞膜的锚定；所述疏水单元通过聚乙二醇高分子PEG链接到乙二醇壳聚糖的氨基上，以增加水溶性；所述其中聚乙二醇高分子PEG分子量在500以上。0009作为另一种优选，所述荧光分子包括异硫氰酸荧光素或磺基罗丹明B磺酰氯，其说明书CN104316500A2/4页4通过与氨基反应接枝在亲和素分子表面。0010本发明还提供了上述长时间细胞膜成像试剂的制备方法，包括以下步骤00111将生物素、疏水单元和乙二醇壳聚。
9、糖分别溶于PBS缓冲液中，混匀，室温反应；产物透析、冻干，即得组分A；00122将异硫氰酸荧光素和亲和素溶液混匀使反应；产物透析、冻干，即得组分B。0013有益效果本发明提供的细胞膜成像试剂生物相容性好、成像效果优良，且能长时间保持在细胞膜上而不被内吞，可作为新一类细胞膜成像试剂。0014具体而言，本发明相对于现有技术，具有以下突出的优势00151本发明提供的试剂生物相容性好、成像效果优良，且能长时间保持在细胞膜上而不被内吞，其利用胆固醇修饰壳聚糖高分子侧链进行多位点锚定，形成一层高分子成像基底，再利用生物素与亲和素的特异性结合引入荧光分子，从而实现长达18小时的高质量细胞膜成像。00162本。
10、发明采用胆固醇修饰壳聚糖高分子侧链，由于胆固醇在细胞膜上可以进行插入，起到对高分子锚定的作用，多个胆固醇分子更是增加了锚定的效率。因此组分A作为成像基底可以很快将细胞膜包围，将接枝在壳聚糖高分子上的多个生物素分子暴露出来，用于之后与带荧光分子的亲和素分子结合，实现细胞膜的成像。这种“多位点锚定”并结合“双重包覆”的策略，可以极大地提高成像质量和成像时间；实验显示，该成像试剂对细胞染色18小时后也没有明显内吞现象发生。00173本发明采用生物素与亲和素之间的高特异性稳固结合，使荧光分子得以长时间包围在细胞膜表面而不被内吞。此外，由于生物素与亲和素的结合效率极高，可大大节省了染色时间。亲和素作为生。
11、物大分子也在一定程度上保证了荧光分子不易被内吞。00184本发明试剂的组成成分壳聚糖、PEG、生物素以及亲和素都具备良好的生物相容性，而且起锚定作用的胆固醇更是动物细胞的细胞膜固有成分，因此该试剂对细胞的毒性低。组分A在100G/ML以下，组分B在200G/ML以下，MTT实验显示该成像试剂对细胞活力几乎无影响，从而证明了该试剂良好的生物相容性。00195本发明试剂的壳聚糖高分子上剩余的氨基带有的正电荷，会与带负电荷的细胞膜发生静电相互作用，增加与细胞膜的亲和力，因而进一步延长了染料在细胞膜上的保持时间。00206本发明试剂可作为一种细胞膜长时间染色的应用平台，通过替换不同的荧光分子可以实现多。
12、种颜色的荧光成像。附图说明0021图1为本发明长时间细胞膜荧光成像试剂的分子结构图。0022图2为本发明的细胞膜荧光成像试剂对A549肺癌细胞生存活力的影响评价试验MTT试验，其中壳聚糖及组分A浓度均为100G/ML，组分B浓度为200G/ML；0023图3A、3B、3C分别为本发明的细胞膜荧光成像试剂对A549肺癌细胞细胞膜染色1小时、8小时及18小时后的效果图。具体实施方式说明书CN104316500A3/4页50024实施例10025长时间细胞膜荧光成像试剂组分ACHITOSAN10CHOLESTEROL10BIOTIN以及组分BAVIDINFITC的设计、合成和细胞膜荧光染色方法如下0。
13、026试剂的设计所述成像试剂的分子结构图见图1，该试剂由两种组分构成组分A以乙二醇壳聚糖高分子GLYCOLCHITOSAN为骨架，侧链含有10的聚乙二醇2000胆固醇PEG2000CHOLESTEROL疏水单元和10的生物素分子BIOTIN；组分B由接枝有异硫氰酸荧光素FITC的亲和素AVIDIN构成。所述的乙二醇壳聚糖高分子，具有良好的生物相容性和水溶性。所述的胆固醇疏水侧链，通过分子量在500以上的PEG2000连接到壳聚糖氨基上，即NHSPEG2000CHOLESTEROL，增加水溶性。所述的FITC荧光分子，经过与氨基反应连接到亲和素分子上。胆固醇疏水单元可通过疏水相互作用多位点地插入。
14、细胞膜，将高分子骨架锚定在细胞膜上；随后，通过生物素与亲和素高亲和力的牢固结合将荧光分子接枝在高分子上，作为荧光成像单元。0027试剂的合成，包括以下步骤00281组分A的制备以N羟基琥珀酰亚胺聚乙二醇2000胆固醇NHSPEG2000CHOLESTEROL、生物素N琥珀酰亚胺基酯NHSBIOTIN以及分子量大于10000的乙二醇壳聚糖高分子为原料，合成疏水单元占壳聚糖重复单元数的百分比为10、生物素分子占壳聚糖重复单元数的百分比为10的组分A，即CHITOSAN10CHOLESTEROL10BIOTIN。具体为分别称取16MGNHSPEG2000CHOLESTEROL、152MGGLYCOL。
15、CHITOSAN聚合度大于400；分子量约80000以及25MGNHSBIOTIN，将三者分别溶于PBS缓冲液PH74,50MM，迅速混合均匀后，在摇床中室温下反应过夜；反应结束后用截留分子量为10K的透析袋透析3天进行纯化，最后在冻干机中冻干制成组分ACHITOSAN10CHOLESTEROL10BIOTIN；00292组分B的制备将5MG的AVIDIN溶于25MLPH95的碳酸钠碳酸氢钠缓冲溶液；取FITC并溶于二甲基甲酰胺DMF中，配制成浓度2MG/ML的FITC溶液；向AVIDIN溶液中加入250L的FITC溶液，混合均匀后，于4冰箱中反应过夜；反应结束后，用截留分子量2K的透析袋透析。
16、三天除去未反应的FITC进行纯化，最后在冻干机中冷冻干燥制得组分BAVIDINFITC。0030组分A及组分B均于20中冷冻保存。0031细胞膜染色成像实验将组分A与组分B分别溶于细胞培养用PBS制成1MG/ML的储存液，并用045M的无菌过滤头进行过滤除去细菌制得工作液。A549肺癌细胞在共聚焦培养板上培养12小时后，先吸去原有培养基，PBS清洗两次，再加入2ML新鲜DMEM完全培养基DMEM不完全培养基10胎牛血清1青霉素链霉素双抗。先加入组分A200L并放回二氧化碳培养箱孵育30分钟，随后吸出培养板中液体并PBS清洗1次，换入DMEM完全培养基；再加入400L组分B于培养箱中孵育10分钟。
17、，染色结束后PBS清洗3次，重新加入DMEM完全培养基并将细胞置于激光扫描共聚焦显微镜下观察并拍照，并每隔一定时间跟踪观察细胞膜染色情况。0032染色结果图3A、3B、3C分别为染色1小时、8小时及18小时后细胞膜成像图；可见细胞膜被均匀地标记上绿色荧光，随着染色时间的延长并没有发生明显内吞，实现了细胞膜长时间荧光成像。说明书CN104316500A4/4页60033实施例20034本实施例的实施方法与实施例1中的方法一致，只是选用的乙二醇壳聚糖高分子分子量约10000，NHSPEG2000CHOLESTEROL分子中的胆固醇疏水单元依次改成磷脂分子1,2肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺，DMPE、烷烃。
18、十八个碳原子，C18或者维生素E等疏水侧链，合成得到三种细胞膜荧光成像试剂。0035实施例30036为了实现其他颜色的细胞膜荧光成像，本实施例的实施方法与实施例1中的方法类似，只是选用的乙二醇壳聚糖高分子分子量约100000，将实施例1中的荧光分子FITC替换成为磺基罗丹明B磺酰氯荧光试剂，实施方法与实施例1中方法一致。0037实施例40038本实施例的实施方法与实施例1中的方法类似，只是成像试剂组分A中的锚定单元占壳聚糖重复单元数的百分比改为30，生物素单元占壳聚糖重复单元数的百分比改为5，所制得的成像试剂组成为CHITOSAN30CHOLESTEROL5BIOTIN。0039实施例50040本实施例的实施方法与实施例1中的方法类似，只是成像试剂组分A中的锚定单元占壳聚糖重复单元数的百分比改为5，生物素单元占壳聚糖重复单元数的百分比改为30，所制得的成像试剂组成为CHITOSAN5CHOLESTEROL30BIOTIN。说明书CN104316500A1/3页7图1图2说明书附图CN104316500A2/3页8图3A图3B说明书附图CN104316500A3/3页9图3C说明书附图CN104316500A。