一种溶菌酶检测试剂及其制备方法.pdf

本发明属生物化学分析领域，具体涉及一种溶菌酶检测试剂及其制备方法。本发明溶菌酶检测试剂含有灭活微球菌和明胶。本发明检测试剂采用新的灭活微球菌的方法，同时利用明胶作为分散菌体的介质和稳定剂，制备高度稳定的菌悬液作为溶菌酶检测试剂。本发明经过4小时以上长时间的静置，吸取的菌悬液的吸光度无明显改变，表明所得试剂具有很好的稳定性，可用于各种检测需要，能用于全自动生化分析，实现溶菌酶活性的批量、自动化检测。

1、  一种溶菌酶检测试剂，其特征在于含有灭活微球菌和明胶，其中明胶作为分散菌体的介质和稳定剂。

2、  按权利要求1所述的溶菌酶检测试剂的制备方法，其特征在于通过以下步骤制备，
①采用营养琼脂培养微球菌48～72小时，
②在无菌状态下，用生理盐水冲洗菌苔，
③用活性氯灭活，时间为15～30分钟，
④将灭活后的微球菌纱布过滤，去除混入的琼脂碎块；用生理盐水洗涤菌体后，用0.125～0.0625mol/L pH6.0磷酸盐缓冲液洗涤，
⑤用含1.3～1.7‰明胶、1‰叠氮钠的磷酸盐缓冲液悬浮，相同缓冲液调整菌悬液为1cm光径、650nm波长吸光度约为1.5A，得应用菌悬液，4℃保存。

3、  按权利要求1或2所述的溶菌酶检测试剂，其特征在于所述灭活微球菌的活性氯浓度为1000～3000ppm。

4、  按权利要求1或2所述的溶菌酶检测试剂，其特征在于所述试剂菌悬液含明胶1.5‰。

5、  按权利要求2所述的溶菌酶检测试剂，其特征在于步骤④所述磷酸盐缓冲液洗涤液为0.0625mol/L pH6.0。

一种溶菌酶检测试剂及其制备方法
技术领域
本发明属生物化学分析领域，具体涉及一种溶菌酶检测试剂及其制备方法
背景技术
溶菌酶分析通常用于各种体液的检测。其意义是通过体液中溶菌酶的测定、分析，对疾病的变化、严重程度进行判断。根据Pesce A.J.和Kaplan L.A.主编的权威著作《Methods in Clinical Chemistry》(林其燧  文庆成主校译)，目前用于临床溶菌酶分析的方法的主要是平板法和比浊法。其中平板法进行试剂标准化比较困难，操作繁琐，需要经过特定的培训才能掌握，而且试验结果易受操作者主观误差的影响；比浊法全部为手工操作，手工比浊法所用菌悬液静置后菌体将下沉，因而在操作中必须不断摇动菌悬液，以保持每个测试时所吸取菌悬液浓度的一致性，增加了操作的难度，并且所得试剂稳定性不好。难以适应现代医学批量标本的检测要求和自动化分析的发展趋势，并且其灵敏度较低。
综上所述，目前临床医学检验迫切需要一种具有稳定性能的溶菌酶检测试剂，并且能方便的用于自动化分析检测的要求。
发明内容
本发明的目的是提供一种性能稳定地溶菌酶检测试剂，本试剂能用于全自动生化分析，实现溶菌酶活性的批量、自动化检测。
本发明的另一目的是提供所述检测试剂的制备方法。
本发明溶菌酶检测试剂含有灭活微球菌和明胶。本发明检测试剂采用新的灭活微球菌的方法，同时利用明胶作为分散菌体的介质和稳定剂，制备高度稳定的菌悬液作为溶菌酶检测试剂。本发明经过4小时以上长时间的静置，吸取的菌悬液的吸光度无明显改变，表明所得试剂具有很好的稳定性，可用于各种检测需要，使得用于自动生化分析仪成为可能。
本发明溶菌酶检测试剂通过下述方法和步骤制备，
1、采用常规培养方法营养琼脂培养微球菌48～72小时，
2、在无菌条件下，用生理盐水洗下菌苔，
3、用活性氯进行灭活，浓度为1000～3000ppm，时间为15～30分钟，
4、将灭活后的微球菌用纱布进行过滤，去除混入的琼脂碎块；用生理盐水洗涤菌体，然后用0.125～0.0625mol/L pH6.0磷酸盐缓冲液洗涤，
5、用含1.3～1.7‰明胶、1‰叠氮钠的磷酸盐缓冲液进行悬浮，并用相同缓冲液调整菌悬液为1cm光径、650nm波长吸光度约为1.5A，得应用菌悬液。置于4℃保存，即得本发明溶菌酶测试试剂。
所制备的试剂可供各类带试剂冷藏槽的自动生化分析仪应用，用于测试各种体液中的溶菌酶活性。本发明所能达到的最低检测限为0.5μg/ml，完全可以满足临床体液标本测试的要求。
本发明涉及的微球菌购自中科院微生物所菌种库。
所涉及的溶菌酶标准品比活性为20000u/mg蛋白(华美生物工程公司)，将此溶菌酶用含30％甘油的0.9％NaCl溶液配成浓度为1mg/ml的酶溶液，作为标准品工作液，分装后置于-40℃冰箱中保存备用。
所涉及的其它化学试剂均为AR以上纯级，购自上海化学试剂商店。
所涉及的生化分析仪为HITACHI 7060型全自动生化分析仪，(日本)。
附图说明
图1  线性范围图。
图2  胸水标本测试数据分布示意图。
具体实施方式
实施例1  制备溶菌酶测试试剂
1、采用常规培养方法营养琼脂培养微球菌48小时，
2、在无菌条件下，用生理盐水洗下菌苔，
3、用活性氯进行灭活，浓度为1000ppm，时间为30分钟，
4、将灭活后的微球菌用纱布进行过滤，去除混入的琼脂碎块；用生理盐水洗涤菌体，然后用0.125mol/L pH6.0磷酸盐缓冲液洗涤，
5、用含1.3‰明胶、1‰叠氮钠的磷酸盐缓冲液进行悬浮，并用相同缓冲液调整菌悬液为1cm光径、650nm波长吸光度约为1.5A，得应用菌悬液。置于4℃保存，即得本发明溶菌酶测试试剂。
实施例2  制备溶菌酶测试试剂
采用常规培养方法营养琼脂培养微球菌72小时，在无菌条件下，用生理盐水洗下菌苔，用浓度为2000ppm活性氯进行灭活15分钟，将灭活后的微球菌纱布过滤，去除混入的琼脂碎块；用生理盐水洗涤菌体，然后用0.0625mol/L pH6.0磷酸盐缓冲液洗涤，用含1.5‰明胶、1‰叠氮钠的磷酸盐缓冲液进行悬浮，并用相同缓冲液调整菌悬液为1cm光径、650nm波长吸光度约为1.5A，得应用菌悬液。置于4℃保存，即得本发明溶菌酶测试试剂。
实施例3  临床检验
取成人体检血清标本50例；胸水标本共44例。癌性胸水为21例，均经细胞学检查证实，其中19例为肺腺癌，1例疑为腺癌，1例为乳腺癌术后；结核性胸水23例。标本采集后，置-40℃冻存。检测时，置室温下令复融，颠倒混匀，离心取上清备检。
利用HITACHI 7060全自动生化分析仪建立溶菌酶活性的自动分析法。方法：终点法；波长：340/623nm；试剂量：250μl；样品量：30μl；测量点：31点。将溶菌酶标准品配制成15.6μg/ml的溶液作为定标液，作5点定标。
将所用溶菌酶标准品在0.1μg/ml-50μg/ml之间作15个阶度稀释，作为样品上机测试，得到反应曲线。显示，上限直至50μg/ml仍保持满意的线性，可满足临床标本的测试需要。下限自0.6μg/ml以下不能有效测定(读数紊乱)；取生理盐水作为“0”标本，测试5次，计算X+3SD＝0.28+3×0.084＝0.532μg/ml，作为检测下限，所建立的检测系统的最低检测限为0.6μg/ml，检测上限至少可达50μg/ml。
用含20％混合人血清的生理盐水，添加溶菌酶标准品，配制成高、中、低三种溶菌酶浓度的样品，分装，-40℃冻存，作为重复性试验的样品。
取上述高、中、低三种浓度的样品上机连续测定，分别计算批内变异系数为1.7％，1.3％，和3.1％，天间变异系数分别为3.9％，4.7％，和8.7％。
采用2种方法进行回收试验，即不同胸水标本中添加相同量的LZM标准品和同一个胸水标本中添加不同量的LZM标准品，按公式：回收率＝(回收量/加入量)×100％，计算回收率为90.4％～101.3％
临床标本测试结果显示，其中50例血清标本浓度分布范围为3.1~8.8μg/ml，X±SD＝4.71±0.92(μg/ml)，44例胸水标本，其中结核性胸水23例，癌性胸水21例。
以肺癌组胸水LZM测定值X+2SD作为cut off值：X+2SD＝3.94+0.93×2＝5.8μg/ml，则结核组有21例高于此值，敏感性为91.3％，癌性组仅有1例高于此值，特异性为95.2％。
上述两组资料经X²检验，P＜0.001，表明结核组与肺癌组胸水LZM活性有极显著差异，结核组胸水LZM活性高于肺癌组。