一种多糖类纳米抗菌材料及其制备方法和用途 技术领域
本发明涉及一种以壳聚糖为基础原料，通过负载具有杀菌活性的金属离子的多糖类纳米抗菌材料及其制备方法和用途。
背景技术
壳聚糖是天然的高分子生物低聚物，其降解产物为具有弱碱性的氨基葡萄糖，对人体组织无毒、无害。它除具有优异生物相溶性外，还具有独特的生物活性，能调节动物机体免疫，抑制肿瘤细胞增殖，有较强的抑菌活性，并能调节动物体内胆固醇与脂质代谢。壳聚糖作为饲料添加剂、重金属螯合剂、吸附剂、药物缓释剂等多种功能性材料已应用于农业、工业及医药等领域。多种壳聚糖改性产物，如交联壳聚糖、壳聚糖微球、壳聚糖纳米粒子等也已得到较好应用。壳聚糖微球、珠状壳聚糖已被研究应用于抗癌药物与蛋白质的控释系统。制备珠状壳聚糖的方法有水油两相法、乳滴技术、喷雾干燥法等，通常这些制备过程复杂且需要使用有机溶剂与表面活性剂，由此制备的壳聚糖微球不适合物化性质表征观察。
Zhengrong Cui；Russell J Mumper.Chitosan-based nanoparticles fortopical genetic immunization.Journal of Controlled Release.2001，75(3)：409-419报道，CS(壳聚糖)-DNA纳米粒子通过CS与DNA在酸性溶液中凝聚作用制得，CS-DNA纳米粒子的粒径在100-250nm之间，合成的CS-DNA纳米粒子能应用于小鼠基因免疫。
Yong Hu；Xiqun Jiang，Yin Ding，et.al.Synthesis and characterizationof chitosan-poly(acrylic acid)nanoparticles.Biomaterials，2002，23：3193-3201报道，通过丙烯酸在壳聚糖溶液中模板聚合作用制备CS-PAA(多聚丙烯酸)纳米粒子，能够稳定分散于酸性介质中。但以上所制得的纳米粒子粒径通常较大，成品率较低，且形成的微粒粒径不均一。
纳米材料已作为抗菌材料应用于工业生产中。具有抗菌功能的纳米材料，根据杀菌机理的不同，可分为两类：一类为载有Ag+的纳米材料，利用Ag+可使细胞膜上的蛋白失活，从而杀死细胞；另一类为载有ZnO或TiO2等材质的纳米材料，它们在光照条件下，会产生导带电子和价带空穴，而后者是良好的氧化剂，具有很强的反应活性，可与表面吸附的H2O或OH-离子发生反应而形成具有强氧化性地羟基，从而借助羟基的强氧化性而杀死细胞，而且可穿透细胞膜，破坏膜结构，降解细胞产生的毒素《熊德鑫，梁明，崔德建.纳米材料对常见需氧致病菌最低抑菌浓度的测定.中华临床新医学。2002，3(10)：879-880》。在多孔性沸石微粒中用离子交换法将具有杀菌、抗菌活性的Ag、Cu、Zn等金属超微粒子吸附于孔中，然后加入纤维中，制成对大肠杆菌、葡萄状球菌、各种霉菌和水虫等有杀菌、抗菌性的纤维产品。但多孔性沸石微粒子晶体结构的耐酸性差，因此，在酸性条件下，Ag、Cu、Zn的离子交换条件及吸附效果的再现性是困难的。日本于1990年开发了具有抗菌性能的TiO2多孔微粒子以取代传统沸石，使固体纳米TiO2应用于杀菌材料《刘景春，黄海，左美祥等.纳米载银抗菌材料与促进健康.材料导报.2000，10(14)：300-301》。
壳聚糖与其它多糖一样，在其复杂的空间结构中含有高活性的功能基团，表现出类抗生素的特征，能够抑制多种细菌的生长与活性。具有生物相溶性可降解的壳聚糖由于其抗菌活性在制备抗菌有机纳米材料方面显现了很大前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种可作为抗菌、抗病毒药物或饲料添加剂应用的多糖类纳米抗菌材料及其制备方法。
本发明的多糖类纳米抗菌材料是载金属离子壳聚糖纳米粒子，粒径20-500nm，其中壳聚糖的分子量为2～80kDa，脱乙酰度为50～100％，金属离子重量含量为1～30％。
本发明的多糖类纳米抗菌材料的制备方法，有两种方案。
方案1，制备步骤如下：
在20-60℃搅拌下，于稀酸溶液中加入分子量为2～80kDa，脱乙酰度为50～100％壳聚糖，配置0.1％～5％壳聚糖酸溶液，然后向壳聚糖酸溶液加入0.1～5％交联剂溶液，反应过程中，同时加入浓度为100～1000mg/L金属离子溶液，反应完全后，离心分离，沉淀物蒸馏水洗涤至中性，冷冻干燥即得多糖类纳米抗菌材料。
方案2，制备步骤如下：
在20-60℃搅拌下，于稀酸溶液中加入分子量为2～80kDa，脱乙酰度为50～100％壳聚糖，配置0.1％～5％壳聚糖酸溶液，然后向壳聚糖酸溶液加入0.1～5％交联剂溶液，形成微乳液，离心分离，沉淀物蒸馏水漂洗至中性，冷冻干燥得壳聚糖纳米粒子，再将壳聚糖纳米粒子干粉置于浓度为100～1000mg/L金属离子溶液中，振荡吸附，将吸附后的壳聚糖纳米粒子置于烘箱烘干，即得多糖类纳米抗菌材料。
本发明中，所说的稀酸为乙酸、醋酸或盐酸；交联剂为阴离子交联剂，包括多聚磷酸钠、硫酸钠或柠檬酸钠等；金属离子溶液为铜离子、锌离子的硫酸盐、盐酸盐、硝酸盐水溶液或为银离子的硝酸盐水溶液。
本发明的优点：
1)本发明提供了一种在常温、常压下(即温和条件下)制备多糖类纳米抗菌材料方法。制备过程中，不使用任何有机试剂和表面活性剂，很好的解决了壳聚糖纳米微粒的分离和纯化问题。
2)本发明制得的多糖类纳米抗菌材料在相同制备条件下所得的纳米粒子粒径大小均匀(粒径约为20～500nm)，形态好。
3)本发明以具有杀菌活性的金属离子与壳聚糖为基质，通过引入多价阴离子交联剂制备纳米粒子，它能够作为抗菌、抗病毒药物或饲料添加剂广泛应用于畜牧业或作为抗菌药物应用于医药领域。
附图说明
图1为实例1制备得多糖类纳米抗菌材料透视电镜图，粒径约为30nm，放大倍数50000倍；
图2为实例2制备所得多糖类纳米抗菌材料原子力显微镜图，粒径约为60nm，其中，图a)是纳米抗菌材料原子力显微镜平面图，图b)是其立体图；
图3为实例3制备所得多糖类纳米抗菌材料低倍扫描电镜图(放大倍数2000倍)，粒径约为70nm；
图4为实例4制备所得多糖类纳米抗菌材料原子力显微镜图，粒径约为60nm；其中，图a)是纳米抗菌材料原子力显微镜平面图，图b)是其立体图；
图5为实例4制备所得多糖类纳米抗菌材料粒径分布图；
图6为实例5制备所得多糖类纳米抗菌材料原子力显微镜图，粒径约为50nm，图a)是纳米抗菌材料原子力显微镜平面图，图b)是其立体图；
图7为实例5制备所得多糖类纳米抗菌材料粒径分布图；
图8为实例6制备所得壳聚糖纳米粒子原子力显微镜图，其中，图a)是纳米抗菌材料原子力显微镜平面图，图b)是其立体图；纳米粒子为较规则球形结构，并呈较规则雪花状聚集状态，粒径约为40nm；
图9为实例8多糖类纳米抗菌材料药敏实验对沙门氏菌杀菌作用原子力显微镜图，其中，图a)是经纳米抗菌材料作用后沙门氏菌菌体细胞形态图，图b)是其立体图；沙门氏菌经多糖类纳米抗菌材料作用3h后，可以观察到沙门氏菌细胞体内容物外泻，仅残留细胞外形轮廓，纳米粒子通过细胞壁空洞进入沙门氏菌体内。
具体实施方式
下面结合具体实例进一步说明本发明。
实例1：
20℃磁力搅拌下，在0.5％乙酸溶液中加入分子量9kDa、脱乙酰度85％的壳聚糖，配置0.1％壳聚糖酸溶液，向壳聚糖乙酸溶液中加入0.1％多聚磷酸钠溶液，反应过程中，加入铜离子浓度为100mg/L硫酸铜溶液，反应完全后，3000rpm/min离心，沉淀物蒸馏水漂洗至中性后，冷冻干燥即得多糖类纳米抗菌材料。
上述方法制备的载铜纳米粒子平均粒径约为30nm，其中铜含量约为1％，透视电镜图显示纳米粒子为较规则球形结构(见图1)，能在pH值3～8内稳定保存。
实例2：
60℃磁力搅拌下，在0.5醋酸溶液中加入分子量10kDa、脱乙酰度84％的壳聚糖，配置5％壳聚糖酸溶液，向壳聚糖乙酸溶液中加入5％硫酸钠溶液，反应过程中，加入锌离子浓度为1000mg/L氯化锌溶液，反应完全后，9000rpm/min离心，沉淀物蒸馏水漂洗至中性后，冷冻干燥即得多糖类纳米抗菌材料。
上述方法制备的载锌纳米粒子平均粒径约为60nm，其中锌含量约为30％，原子力显微镜图显示纳米粒子为较规则球形结构(见图2)，能在pH值3～8内稳定保存。
实例3：
30℃磁力搅拌下，在1％盐酸溶液中加入分子量8kDa、脱乙酰度86％的壳聚糖，配置2％壳聚糖酸溶液，向壳聚糖乙酸溶液中加入1％柠檬酸钠溶液，反应过程中，加入铜离子浓度为800mg/L硝酸铜溶液，反应完全后，6000rpm/min离心，沉淀物蒸馏水漂洗至中性后，冷冻干燥即得多糖类纳米抗菌材料。
上述方法制备的载铜纳米粒子平均粒径约为70nm，其中铜含量约为10％，低倍扫描电镜图显示纳米粒子为不规则瘤状突起结构(见图3)，能在pH值3～8内稳定保存。
实例4：
35℃磁力搅拌下，在1％乙酸溶液中加入分子量9kDa、脱乙酰度100％的壳聚糖，配置1.5％壳聚糖酸溶液，向壳聚糖乙酸溶液中加入铜离子浓度为400mg/L硫酸铜溶液，反应过程中，同时加入0.5％柠檬酸钠溶液，反应完全后，3000rpm/min离心，沉淀物蒸馏水漂洗至中性后，冷冻干燥即得多糖类纳米抗菌材料。
上述方法制备的多糖类纳米抗菌材料平均粒径约为60nm，其中铜含量约为20％，原子力显微镜图显示纳米粒子为较规则球形结构(见图4)，其粒径分布见图5，能在pH值3～8内稳定保存。
实例5：
25℃磁力搅拌下，在0.5％乙酸溶液中加入分子量8kDa、脱乙酰度50％的壳聚糖，配置1％壳聚糖酸溶液，向壳聚糖乙酸溶液中加入0.5％柠檬酸钠溶液，形成微乳液，4000rpm/min离心分离，沉淀物蒸馏水漂洗至中性，冷冻干燥得壳聚糖纳米粒子，将壳聚糖纳米粒子干粉置于600mg/L锌离子溶液中，300rpm/min振荡吸附，吸附完全后，将吸附后壳聚糖纳米粒子置于烘箱60℃烘干，即得多糖类纳米抗菌材料。
上述方法制备的多糖类纳米抗菌材料平均粒径约为50nm，其中锌含量约为20％，原子力显微镜显示多糖类纳米抗菌材料为较规则球形结构(见图6)，其粒径分布见图7，，能在pH值3～8内稳定保存。
实例6：
30℃磁力搅拌下，在0.5％乙酸溶液中加入分子量80kDa、脱乙酰度84％的壳聚糖，配置2％壳聚糖酸溶液，向壳聚糖乙酸溶液中加入1％柠檬酸钠溶液，形成微乳液，6000rpm/min离心分离，沉淀物蒸馏水漂洗至中性，冷冻干燥得壳聚糖纳米粒子，将壳聚糖纳米粒子干粉置于800mg/L铜离子溶液中，400rpm/min振荡吸附，吸附完全后，将吸附后壳聚糖纳米粒子置于烘箱60℃烘干，即得多糖类纳米抗菌材料。
上述方法制备的多糖类纳米抗菌材料平均粒径约为40nm，其中铜含量约为10％，原子力显微镜图显示壳聚糖纳米粒子为较规则球形结构，并呈较规则雪花状聚集状态，多糖类纳米抗菌材料原子力显微镜图显示形态较好球形结构(见图8)，能在pH值3～8内稳定保存。
实例7：
应用本发明制备的多糖类纳米抗菌材料作为抗菌药物治疗由大肠杆菌感染引起的仔猪腹泻。以28日龄断奶仔猪为实验对象，分别以多糖类纳米抗菌材料、抗生素为试验材料设两个试验组，试验组分别下设添加、不添加大肠杆菌菌株两个分组，每个试验组设三个浓度梯度(浓度梯度的设定参考抑菌实验的结果)，每个浓度梯度设三个重复，另设一个对照组(饲喂基础日粮)。每日计录采食量，计算日增重与腹泻率。饲养结束时，分别计算各试验组死亡率，并检测十二指肠内容物中大肠杆菌数量以评定多糖类纳米抗菌材料对肠道菌群影响。
表1给出了多糖类纳米抗菌材料治疗仔猪腹泻实验效果。
实验结果表明，多糖类纳米抗菌材料能有效治疗由于大肠杆菌感染引起的仔猪腹泻，减少肠道内容物大肠杆菌数量，降低仔猪死亡率，增强仔猪免疫力。
实例8：
多糖类纳米抗菌材料药敏实验。将待测细菌在灭菌Mueller-Hinton(MH)肉汤琼脂平板上过夜培养，挑取菌落接种于灭菌试管中MH的内，37℃、180rpm/min过夜培养。将培养后的菌液稀释到2-7×105CFU/ml，向无菌的96孔平板中的第一到第十一孔各加入100微升的菌液，第十二孔不加菌液而加100微升MH肉汤。然后从第一孔到第十孔逐一加入相应的抗菌剂溶液，第十一孔作为扫描对照孔，不加抗菌剂，37℃、90rpm/min培养18-24小时，这样待测多糖类纳米抗菌材料的终浓度分别为128，64，32，16……2.5μg/ml。最小抑菌浓度MIC(Minimal Inhibitory Concentration)就是能阻止50％以上细菌生长的最小抗菌剂浓度。用酶标仪在490nm下对平板进行扫描，MIC的确定按照比对照孔(第十一孔)的浑浊程度低50％以上的最小浓度计算。从没有细菌生长的平板孔中的内容物中取10微升涂布到MH琼脂平板上，37℃下培养18小时，以此来确定抗菌剂的MBC值。最小杀菌浓度MBC(Minimal BactericidalConcentration)就是能抑制任何残余菌落生长的抗菌剂的最低浓度。
表2为多糖类纳米抗菌材料及阳性对照物壳聚糖药敏试验体外抑菌效果(ug/ml)。实验结果表明，多糖类纳米抗菌材料能够有效抑制革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌等有害菌的生长，最小抑菌浓度在1/32-1ug/ml之间；多糖类纳米抗菌材料溶剂对抑菌活性有较大影响，溶于0.5％醋酸溶液中具有显著的抑菌效果；多糖类纳米抗菌材料抑菌效果与溶液pH值(4.5-7.5)呈负相关。
表1多糖类纳米抗菌材料治疗仔猪腹泻实验效果
表2壳聚糖、CSN、CSN改性产物体外抑菌效果(ug/ml)
CS为壳聚糖阳性对照，CSM为根据本发明所述制备方法制备的多糖类纳米抗菌材料。