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1、10申请公布号CN104120180A43申请公布日20141029CN104120180A21申请号201410336435322申请日20140715C12Q1/6820060171申请人江苏伟禾生物科技有限公司地址225300江苏省泰州市经济开发区药城大道一号新药创制基地二期D幢大楼912室72发明人陈炤源王浩74专利代理机构南京正联知识产权代理有限公司32243代理人卢霞54发明名称一种人类ALDH2基因型检测试剂盒57摘要本发明提供了一种人类ALDH2基因型检测试剂盒，包括PCR扩增引物、DNA聚合酶和反应缓冲液，所述的DNA聚合酶为经聚乙二醇（PEG）修饰的可耐受血液中PCR反应抑。
2、制物的热启动TAQ聚合酶，还提供了PCR扩增引物的核苷酸序列。本发明具有如下技术效果1）DNA聚合酶为经聚乙二醇（PEG）修饰的可耐受血液中PCR反应抑制物的热启动TAQ聚合酶，能够实现对人类全血（无需进行核酸提取）的PCR扩增，直接经血液进行PCR扩增；2）实现对样本ALDH2基因型的检测。51INTCL权利要求书1页说明书6页附图1页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书6页附图1页10申请公布号CN104120180ACN104120180A1/1页21一种人类ALDH2基因型检测试剂盒，包括PCR扩增引物、DNA聚合酶和反应缓冲液，其特征在于，所述的DNA。
3、聚合酶为经聚乙二醇PEG修饰的可耐受血液中PCR反应抑制物的热启动TAQ聚合酶，所述的PCR扩增引物的核苷酸序列如下还包括一对内对照引物，核苷酸序列如下5TGCATCTGGACATGCTTGCT35TGGCTGGAGGAGACTCCAAA32根据权利要求1所述的人类ALDH2基因型检测试剂盒，其特征在于，所述的反应缓冲液的组成及各组分含量如下018MM脱氧核苷酸DNTP，18MM氯化镁MGCL2，603MM氯化钾KCL，189MM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐TRISHCL，甘油GLYCEROL06V/V，作为PCR反应增强剂及稳定剂的二甲基亚砜DMSO5V/V、甲酰胺25V/V和甜菜碱5V/V。3根。
4、据权利要求1所述的人类ALDH2基因型检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还包括DNALOADINGDYE。权利要求书CN104120180A1/6页3一种人类ALDH2基因型检测试剂盒技术领域0001本发明涉及一种人类ALDH2基因型检测试剂盒，属于基因工程技术领域。背景技术0002乙醛脱氢酶ALDEHYDEDEHYDROGENASEGENE,ALDH是一种四联体蛋白，催化乙醛和其他脂肪族醛氧化。人体器官和组织中，ALDH有19种同工酶，常见的有ALDH1ALDH4，其中ALDH2位于线粒体内，而ALDH1、ALDH3及ALDH4位于胞液内。根据底物特异性和亚单位组成，认为只有ALDH1和。
5、ALDH2是人体肝脏内的两种主要同工酶，且只有ALDH2表现出遗传多态性。0003ALDH2基因位于人类第12号染色体，目前已发现了近百个SNP位点，主要多态性是RS671位点，即ALDH2基因在外显子12处发生点突变GLU487LYS，使具有催化活性的野生型等位基因ALDH21变为催化能力丧失的突变型等位基因ALDH22，从而使ALDH2失去酶的活性。由于遗传，在人群中该酶基因型出现3种情况具有正常催化活性的野生纯合子型ALDH21/1；催化活性下降的杂合子型ALDH21/2；催化活性丧失的突变纯合子型ALDH22/2。在亚洲人群中，ALDH22是频率最高且最重要的突变型，其中研究显示中国人。
6、ALDH22的频率达18。0004舌下含服硝酸甘油片是治疗冠心病心绞痛急性发作的常规首选方法，然而，该药的临床有效性常因人而异，部分病人舌下含服硝酸甘油不能迅速有效地缓解心绞痛，使心肌严重缺血加重，甚至死亡。研究发现，硝酸甘油的舒血管作用是通过释放一氧化氮NO所介导，而ALDH2与硝酸甘油转化为NO密切相关。有研究报道，野生型ALDH2酶对硝酸甘油的催化活性大约是突变型的10倍，ALDH21基因型的患者硝酸甘油治疗心绞痛的疗效明显优于ALDH22患者，且前者迅速起效率也明显高于后者。由此可见，ALDH2基因检测可指导临床正确使用硝酸甘油，减少用药无效情况。0005饮酒后，乙醇通过胃肠道完全吸收。
7、入血，经乙醇脱氢酶ALCOHOLDEHYDROGENASE,ADH代谢为乙醛，代谢过程涉及多个器官和酶系统。紧接着，乙醛主要被ALDH进一步代谢为乙酸，最终氧化成二氧化碳和水排出体外。研究已证实，ALDH2是唯一存在于线粒体内，且与亚洲人的饮酒行为密切相关的酶。突变型基因ALDH22的存在可引起该酶活性降低10倍以上，严重阻碍酒精在体内的代谢过程，导致大量乙醛滞留在体内。加之高频饮酒易引发酒精依赖现象，进一步加重了肝脏的受累程度，引起ALD。ALD是由于长期大量饮酒导致的肝脏疾病，初期常表现为脂肪肝，进而可发展成酒精性肝炎、肝纤维化和肝硬化，是我国常见的肝脏疾病之一，严重危害人民健康，近几年发。
8、病呈显著上升趋势。对ALDH2基因型的检测将有助于揭示个体酒精代谢能力，指导检测者正确饮酒，预防酒精性肝病。0006摄入人体的乙醇有90以上是在肝脏内完成代谢过程的，但其在摄入过程中与消化道上皮细胞的直接接触也不容忽视。在饮酒人群中,尤其是重度饮酒者，由于其上消化道长期与大量酒精直接接触，该区域出现癌变食道癌、口咽癌等的几率较高。研究显示，说明书CN104120180A2/6页4ALDH22基因型者与饮酒人群患食道癌和口腔癌的风险之间具有明显联系。0007乙醛具有明显的致癌作用，ALDH2的生理意义在于对乙醛的解毒作用。而ALDH22等位基因由于缺乏ALDH酶活性，导致饮酒后血液中乙醛的蓄积。。
9、研究发现，携带ALDH22基因型者大量饮酒将显著增加患肝癌的危险性。0008除此之外，ALDH22基因型者也是冠心病、心肌梗死等疾病的高危人群。对ALDH2基因的检测将有助于揭示重大疾病的高危倾向，对指导检测者的日常生活大有益处，也将有助于医生提出个体化指导意见，对相关疾病的预防、治疗及预后具有重大意义。0009综上所述，ALDH2基因检测将为硝酸甘油的用药、饮酒指导及相关高风险重大疾病的提示提供有效的参考依据。0010目前市场上常用的ALDH2基因检测方法为基因芯片法，基本方法是首先提取血液基因组DNA，接着进行PCR扩增，将产物放入杂交仪中进行杂交，最后取出芯片，放入生物芯片识读仪中分析结。
10、果。基因芯片法最大的优点是高通量，同时也存在着许多不足之处，包括技术成本昂贵、操作复杂、检测灵敏度较低及重复性差等。PCRRFLP即PCR限制性片段长度多态性技术也曾应用于ALDH2基因检测，但由于其操作繁琐、耗时多、结果可性度低等缺点，未能普及。因此，本领域亟需一种成本低、操作简便、耗时少、灵敏度高且结果准确性好的ALDH2基因型检测试剂。发明内容0011本发明的目的是克服现有技术的不足之处，提供一种不需经核酸提取而直接由人类全血样本进行PCR反应的人类ALDH2基因型检测试剂盒。0012本发明的人类ALDH2基因型检测试剂盒，包括PCR扩增引物、DNA聚合酶和反应缓冲液，所述的DNA聚合酶。
11、为经聚乙二醇PEG修饰的可耐受血液中PCR反应抑制物的热启动TAQ聚合酶，所述的PCR扩增引物的核苷酸序列如下00130014同时为保证实验结果更准确，易判读，设计了一对扩增产物大小为600BP的内对照引物，核苷酸序列如下00155TGCATCTGGACATGCTTGCT35TGGCTGGAGGAGACTCCAAA30016所述的人类ALDH2基因型检测试剂盒中，所述的反应缓冲液的组成及各组分含量如下018MM脱氧核苷酸DNTP，18MM氯化镁MGCL2，603MM氯化钾KCL，189MM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐TRISHCL，甘油GLYCEROL06V/V，作为PCR反应增强剂及说明书CN10。
12、4120180A3/6页5稳定剂的二甲基亚砜DMSO5V/V、甲酰胺25V/V和甜菜碱5V/V。0017所述的人类ALDH2基因型检测试剂盒中，还包括DNALOADINGDYE。0018本发明提供了一种由人类全血样本直接进行PCR聚合酶链式反应扩增以检测样本ALDH2基因型的方法及其试剂盒，此方法不但成本低、结果准确可靠，且前期无需对血液样本进行核酸提取操作，减少实验室污染风险，降低实验成本且减少实验操作时间。0019本发明针对ALDH2的不同亚型基因，设计出两对特异性的基因扩增引物，并冻干在PCR反应板的底部，并且，提供了一套特殊的PCR反应体系，此体系中涵盖经聚乙二醇PEG修饰的可耐受血液。
13、中PCR反应抑制物的热启动TAQ聚合酶，并在反应缓冲液中添加二甲基亚砜DMSO、甲酰胺和甜菜碱作为PCR反应增强剂及稳定剂，以保证实验过程的稳定和实验结果的准确。0020本发明具有如下技术效果00211DNA聚合酶为经聚乙二醇PEG修饰的可耐受血液中PCR反应抑制物的热启动TAQ聚合酶，能够实现对人类全血无需进行核酸提取的PCR扩增，直接经血液进行PCR扩增；00222实现对样本ALDH2基因型的检测。附图说明0023图1为以EDTA抗凝人血为模板的PCRSSP检测ALDH2基因型的电泳图；0024图2为以DNA为模板的PCRSSP检测ALDH2基因型的电泳图。具体实施方式0025实施例100。
14、261原料和设备002711试剂盒内含物002818孔200LPCR反应板，每2孔检测一个样本002922对ALDH2不同亚型基因的特异性上下游引物，在每2孔中，第一个孔中添加引物A，第二个孔中添加引物B，且每孔均添加一对内对照引物，所有引物均冻干在PCR反应板底部。0030引物A和引物B的核苷酸序列如下00310032内对照引物，核苷酸序列如下0033说明书CN104120180A4/6页65TGCATCTGGACATGCTTGCT35TGGCTGGAGGAGACTCCAAA300343PCR反应体系0035DNA聚合酶经聚乙二醇PEG修饰的可耐受血液中PCR反应抑制物的热启动TAQ聚合酶；。
15、0036反应缓冲液组成及各组分含量如下018MM脱氧核苷酸DNTP，18MM氯化镁MGCL2，603MM氯化钾KCL，189MM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐TRISHCL，甘油GLYCEROL06V/V，作为PCR反应增强剂及稳定剂的二甲基亚砜DMSO5V/V、甲酰胺25V/V和甜菜碱5V/V。0037DNALOADINGDYE。003812样本的来源0039以EDTA抗凝管收集的新鲜或冷冻保存未经反复冻融的全血样本。004013所需实验设备0041基因扩增仪、电泳仪及配套电泳槽、不同量程的移液器、小型台式离心机含8联管水平头。00422检测过程004321PCR反应体系的配置0044以一次进行4个。
16、样本的基因型检测为例，反应体系如表1所示0045表1PCR反应体系00460047每个PCR反应孔板中预先冻存有04L10UM内对照引物和04L10UM特异性引物A或引物B。0048将PCR混合母液4人份混匀，然后8联管的每个反应孔均加入16L的混合液；最后，每孔加入相应全血样品4L，每两孔检测一个样本，盖上8联管盖或膜，放入基因说明书CN104120180A5/6页7扩增仪。004922PCR反应程序0050PCR反应程序如表2所示0051表2PCR反应程序0052005323实验结果分析0054将PCR反应产物，加样到2的琼脂糖凝胶上，以200V的电压电泳57分钟，读取结果；对照判定标准，。
17、推出样品ALDH2基因型。0055凝胶成像判定标准每两孔检测一个样本00561两孔均有内对照，大小约为600BP的DNA片段00572阳性反应会另有大小约为150BP的DNA片段00583若只有第一个孔出现阳性条带，提示样本为ALDH2野生纯合子型；若只有第二个孔出现阳性条带，提示样本为ALDH2突变纯合子型；若两孔均出现阳性条带，提示样本为ALDH2杂合型。0059结果如图1所示，结合判定标准，实验结果分析如下00601样本1只有第一个孔出现阳性条带，则为ALDH2野生纯合子型；00612样本2两孔均出现阳性条带，则为ALDH2杂合型；00623样本3和样本4均只有第二个孔出现阳性条带，则为。
18、ALDH2突变纯合子型。0063同时，将上述四种血液样本，进行基因组DNA提取，测量到DNA浓度为10NG/UL。然后配置PCR反应体系，PCR反应体系如表3所示。0064表3PCR反应体系0065说明书CN104120180A6/6页80066每个PCR反应孔板中预先冻存有04L10UM内对照引物和04L10UM特异性引物A或引物B。0067将PCR混合母液4人份混匀，然后8联管的每个反应孔均加入10L的混合液；最后，每孔加入相应DNA样品2L，盖上8联管盖或膜，放入基因扩增仪，以与全血直接扩增一样的PCR反应程序进行扩增，扩增完后，进行电泳分析。电泳结果如图2所示。0068与全血扩增的实验结果比对，根据上述的凝胶成像判定标准，推出样本1为ALDH2野生纯合子型，样本2为ALDH2杂合型，样本3和样本4均为ALDH2突变纯合子型，与全血扩增结果相同。0069结论整个实验流程仅需15小时，操作方便快捷，且能正确判别实验样本的ALDH2基因型别，可为硝酸甘油的用药、饮酒指导及相关高风险重大疾病的提示提供有效的参考依据。说明书CN104120180A1/1页9图1图2说明书附图CN104120180A。