冻存自体角膜缘干细胞的无饲养层构建角膜上皮方法.pdf

本发明公开了一种冻存自体角膜缘干细胞的无饲养层构建角膜上皮方法，将自体角膜缘干细胞体外长期保存，可以满足在不同的实验条件下，对角膜缘干细胞的运输、保存和增殖的要求。并用保存的角膜缘干细胞采用无饲养层的方法构建角膜上皮植片，实现临床上角膜缘干细胞缺损后的角膜上皮自体重建；本发明能够成功构建的人工角膜上皮植片，自体移植到角膜缘干细胞缺失的角膜表面，复明效果明显。在临床上具有广泛的应用潜力。

1.  冻存自体角膜缘干细胞的无饲养层构建角膜上皮方法，其特征在于，将自体角膜缘干细胞体外长期保存，并用保存的角膜缘干细胞采用无饲养层的方法构建角膜上皮植片，实现临床上角膜缘干细胞缺损后的角膜上皮自体重建；包括以下步骤：
1)首先采用dispase冷消化角膜缘上皮组织，使之与上皮基底膜很好地分离，获取含较多角膜缘干细胞的角膜上皮细胞，在铺有明胶的六孔塑料培养板上培养扩增出角膜缘干细胞，对角膜缘干细胞的分子标记进行免疫组化检测：当CK19、P63和PCNA阳性，CK3/K12阴性时，证明所获得的细胞为角膜缘干细胞；
2)将角膜缘干细胞用酶消化后，加入冷冻保护液后置于不同的环境温度中冻存，保护液配方：DMEM/F12+10％DMSO+10％FBS，冻存时记录角膜缘干细胞的来源，以便进行对应的角膜自体移植，冻存后的角膜缘干细胞仍具有角膜缘干细胞特性，体外可继续扩增；
3)将已去上皮的人羊膜粘附到一个特制的支架上，放入六孔板中，37℃干燥30min～60min后，使羊膜与六孔板底和支架粘附牢固，取冻存的角膜缘干细胞解冻后制备成浓度为1×10⁶个细胞/ml的角膜缘上皮细胞悬液，用微量吸管仔细滴加到羊膜上皮基底膜上，加入无饲养层的角膜上皮培养液，角膜上皮培养液配方为：DMEM/F12基础培养液，添加20％FBS，20ng/mlEGF，5ug/ml insulin，0.5％DMSO和100Iu/ml青霉素100ug/ml链霉素，移入CO2培养箱培养，培养至8～10天，将支架从培养板底剥离，继续悬浮培养5～7天，待细胞成复层生长即停止培养，即得到准备移植的人工角膜上皮植片。

2.  如权利要求1所述的冻存自体角膜缘干细胞的无饲养层构建角膜上皮方法，其特征在于，所述冻存角膜缘干细胞的不同环境温度保存时间为：4℃条件下冰箱保存时间为12-48h；-20℃条件下冰箱保存时间为7d，-80℃条件下冰箱保存时间1-1.5个月，-196℃液态条件下保存时间大于6个月。

冻存自体角膜缘干细胞的无饲养层构建角膜上皮方法
技术领域
本发明属于干细胞与组织工程技术领域，具体涉及体外分离克隆角膜缘干细胞，并在体外不同条件下保存，解冻后用于角膜上皮及人工角膜的无饲养层构建的方法。
背景技术
正常的眼球表面覆盖有角膜、角膜缘、结膜三种上皮，它们在细胞表型上完全不同，与其前表面的泪膜构成了完整的眼表。其中，角膜缘上皮基底层的角膜缘干细胞不仅在保持角膜上皮完整性方面具有重要的作用，而且具有如下特征：(1)可增殖性；(2)自我更新能力；(3)可产生大量的终未分化状态和功能的子代细胞；(4)在组织受损后具有再生更新能力(1.CotsarelisG et al.Cell，1989；57：201.2.Kruse FE，et al.Eye.1994；8：170.3.Schemer，et al.J.Cell Biol，1986；103：49-62)，。
在临床上，各种化学或热烧伤，stevens-Johnson综合症，眼表类天疱疮，佩带角膜接触镜以及严重的微生物感染等都可导致角膜缘干细胞完全缺失，破坏角膜上皮完整性而致盲。目前的治疗措施是根据角膜缘干细胞理论的指导，手术移植带有角膜缘干细胞的组织来补充和更新角膜缘干细胞(4.Kenyon，KR.Et al.ophthalmology.1989；96：709. 5.Tseng，SC.Mol.Biol，Rep，1996；23：47-58.6.Dua HS.Et al.Br，J，ophthalmology2000；84：273.)。手术时要求切取供体角膜的2～3个钟点位跨度的角膜缘组织，才能有足够数量的角膜缘干细胞用于角膜上皮的重建。这样的取材有造成供体眼角膜缘干细胞缺失的危险，加之在异体角膜缘组织的移植中，要求应用免疫抑制药物来防止移植后的免疫排斥反应，对病人有一定程度的毒副作用。使得眼科医生将目光转向自体角膜缘干细胞体外大量扩增培养后用于移植的研究上。目的在于实现从一小片活体角膜缘组织材料中获得少量细胞经体外培养扩增后获得大量细胞的愿望，并将之与支架材料一同移植用于角膜上皮重建与治疗。(7.Friend J，et al.Invest ophthalmol Vis Sci，1982；23：41-49.8.He YG.Et al.Curr Eye Res.1991；9：85-63.9.Lindberg K，et al.Invest ophthalmol Vis Sci，1993；34：2672-2679.10.Koizumi N，et al.Archophthalmol 2001；119：298-300.11.Tsai RT，et al.N.Engl J.Med.2000；343：86-93.12.Koizumi N，et al.Invest ophthalmol Vis Sci，2002；43：2114-2121.)。以上工作为那些角膜缘干细胞缺失而导致的眼表疾病的治疗提供了一个新的措施，但是，培养的角膜缘干细胞及其移植片只能培养结束后就立即应用于临床，需要患者的身体状况与培养结束后细胞的最佳生长状态相吻合，否则，就会导致整个操作和手术失败。如果能够将患者的自体角膜缘干细胞在体外保存一定时间，并保证其增殖能力不衰退，在需要的时候可以继续培养用于角膜上皮的重建，将极大地有利于其临床应用。另外，目前用于角膜缘干细胞体外扩增培养的是一个被称为3T3的培养系统，在这一系统中，能保持角膜缘干细胞克隆化生长并处于一种相对不分化状态中(13.Pellegrini G.et al.J cell Biol，1999；145：769-782.14.TsengSC，et al，Curr Eye Res 1996；15：973-984.)。但是，在采用3T3细胞做饲养层培养和构建角膜缘上皮植片时，由于3T3细胞是来自胎鼠的成纤维细胞，其在临床应用有将异种动物疾病传播给人类的危险，由于患者的顾虑大而限制其广泛使用。因此，如果体外能够保存自体角膜缘干细胞并将体外保存的自体角膜缘干细胞无饲养层构建角膜上皮植片，能够很好地解决上述矛盾，在组织工程角膜上皮的临床应用上具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种冻存自体角膜缘干细胞无饲养层构建角膜上皮的方法，将自体角膜缘干细胞体外长期保存，并用保存的角膜缘干细胞采用无饲养层的方法构建角膜上皮植片，实现临床上角膜缘干细胞缺损后的角膜上皮自体重建。
实现上述发明目的的技术方案是，冻存自体角膜缘干细胞的无饲养层构建角膜上皮方法，其特征在于，将自体角膜缘干细胞体外长期保存，并用保存的角膜缘干细胞采用无饲养层的方法构建角膜上皮植片，实现临床上角膜缘干细胞缺损后的角膜上皮自体重建；包括以下步骤：
1)首先采用dispase冷消化角膜缘上皮组织，使之与上皮基底膜很好地分离，获取含较多角膜缘干细胞的角膜上皮细胞，在铺有明胶的六孔塑料培养板上培养扩增出角膜缘干细胞，对角膜缘干细胞的分子标记进行免疫组化检测：当CK19、P63和PCNA阳性，CK3/K12阴性时，证明所获得的细胞为角膜缘干细胞；
2)将角膜缘干细胞用酶消化后，加入冷冻保护液后置于不同的环境温度中冻存，保护液配方：DMEM/F12+10％DMSO+10％FBS，冻存时记录角膜缘干细胞的来源，以便进行对应的角膜自体移植，冻存后的角膜缘干细胞仍具有角膜缘干细胞特性，体外可继续扩增；
3)将已去上皮的人羊膜粘附到一个特制的支架上，放入六孔板中，37℃干燥30min～60min后，使羊膜与六孔板底和支架粘附牢固，取冻存的角膜缘干细胞解冻后制备成浓度为1×10⁶个细胞/ml的角膜缘上皮细胞悬液，用微量吸管仔细滴加到羊膜上皮基底膜上，加入无饲养层的角膜上皮培养液，角膜上皮培养液配方为：DMEM/F12基础培养液，添加20％ FBS，20ng/mlEGF，5ug/ml insulin，0.5％DMSO和100Iu/ml青霉素100ug/ml链霉素，移入CO2培养箱培养，培养至8～10天，将支架从培养板底剥离，继续悬浮培养5～7天，待细胞成复层生长即停止培养，即得到准备移植的人工角膜上皮植片。
上述不同的环境温度下冻存角膜缘干细胞保存时间为：4℃条件下冰箱保存时间为12-48h；-20℃条件下冰箱保存时间为7d，-80℃条件下冰箱保存时间1-1.5个月，-196℃液态条件下保存时间大于6个月。
采用本发明构建的人工角膜上皮植片，自体移植到角膜缘干细胞缺失的角膜表面，可成功重建角膜缘干细胞缺损地角膜上皮，在临床上用于角膜上皮缺损重建与康复，具有广泛的应用潜力。
附图说明
图1为山羊角膜缘干细胞图；
图2为解冻后培养的山羊角膜缘干细胞图；
图3为解冻后培养的人角膜缘干细胞图；
图4为细胞在形成与在体时相似的3～5层细胞结构图；
图5为在羊膜上的角膜缘干细胞间形成完整的桥粒结构图；
图6为人工角膜上皮植片图；
图7为角膜缘干细胞缺失的病理模型图；
图8为角膜上皮植片移植后复明效果明显的图片。
具体实施方式
以下结合附图和发明人依照上述技术方案完成的实施例对本发明作进一步的详细描述。
实施例1：
角膜缘干细胞的保存与无饲养层构建角膜上皮(以关中奶山羊为例)
关中奶山羊兽用846合剂(解放军农牧大学兽药厂)2.4ml麻醉，双抗生理盐水(自制)冲洗结膜囊和角膜表面，盐酸利多卡因5ml(上海禾丰制药有限公司)5ml，布比卡因(上海禾丰制药有限公司)5ml球后麻醉。铺无菌洞巾，开睑器(江苏六六视觉有限公司)开睑，在眼科手术显微镜(江苏六六视觉有限公司)下，无菌切取上侧角膜缘上皮(带少量角膜缘基质)，置1.2IU dispase(Gibco Lot No.1126857)中冷消化14-16h，移入DMEM/F12(Gibco Lot No.1107011)+10％NBS(北京元亨圣马生物技术研究所产品)培养液中终止消化，将已消化好的上皮层与基底层剥离，上皮层用吸管反复吹打离散细胞，1000r/min离心两次，每次5min，收集细胞。
细胞以1×10⁵个细胞/ml接种于铺有0.1％明胶(Sigma，Lot50K02505)的六孔塑料板(CELLSTAR Lot02030151)中，加入含有20％FBS，20ng/mlEGF(表皮细胞生长因子，Sigma，Number E 9644)，5ug/ml insulin(胰岛素，购自北京鼎国生物技术有限责任公司，Sigma分装，原产品编号为15500)，0.5％DMSO和100Iu/ml青霉素(哈药集团制药总厂，批号B01124412)100ug/ml链霉素(华北制药股份有限公司，批号01072)的DMEM/F12培养液，5％CO2，饱和湿度CO₂培养箱(WTB CO₂培养箱，美国)37℃培养，每2天换一次培养液，培养至7～9天，形成密集的单层(图1)。传代应在80％～90％细胞开始汇合时进行，用0.125％胰蛋白酶(1∶250，华美生物工程公司)+0.01％EDTA(乙二胺四乙酸，Invitrogen，LOT1120193)消化细胞，以1×10⁵个细胞/ml的浓度传代。本发明所用的冻存细胞为2～4代角膜缘干细胞，加入冷冻保护液(DMEM/F12+10％DMSO+10％ FBS)，分别在4℃，-20℃、-80℃冰箱和-196℃液态氮中保存。冻存时记录好角膜缘干细胞的来源，以便于以后进行对应的角膜自体移植。
在不同时间内解冻上述条件下保存的细胞，台盼蓝染色检测细胞的活力，那些有85％细胞仍然存活的，经体外可继续扩增，细胞形态与冻存前基本相似的细胞(图2)，免疫组化检测角膜缘干细胞分子标记CK19(角蛋白19，Sigma，sigma-aldrich.com，Product Number C 6930)、P63(Santa CruzBiotechnology，Inc.4A4：sc-8431)、PCNA(武汉博士德生物工程有限公司SA2024)、CK3/K12(United States Biological Inc.Lot No 3051563)，具体操作按北京中山生物试剂有限公司免疫组化染色试剂盒(SP-9000/9001/9002)说明书进行。那些细胞分子标记仍为CK19、P63和PCNA阳性，CK3/K12阴性的细胞，可以认为仍具有角膜缘干细胞特性。在4℃可保存12-48h、-20℃保存1-7d、-80℃保存1-1.5个月、-196℃液态氮保存至少6个月以上，设想可长期保存。可以满足在不同的实验条件下，对角膜缘干细胞的运输、保存和增殖的要求。
将已去上皮的羊膜粘附到一个特制的支架(硝酸纤维素膜Sigma，sigma-aldrich.com改制而成)上，放入六孔板中，37℃干燥30min～60min，使羊膜和支架与六孔板底粘附牢固后，取上述任一条件下保存的角膜缘干细胞制备成浓度为1×10⁶个细胞/ml角膜缘上皮细胞悬液，用微量吸管仔细滴加到羊膜上皮基底膜上，勿使细胞流出羊膜表面，37℃恒温操作台上静止20min，加入少量培养液(DMEM/F12基础培养液添加20％FBS，20ng/mlEGF，5ug/ml insulin，0.5％DMSO和100Iu/ml青霉素100ug/ml链霉素)，移入CO₂培养箱中过夜，第二天待细胞粘附于羊膜上开始增殖时，再向每孔加入2ml培养液培养。隔日换一次培养液，培养至8～10天，轻轻将支架从培养板底剥离，加入培养液使羊膜与支架悬浮于培养液中。继续培养5～7天，细胞成复层生长，表面有细胞开始脱落时，停止培养。固定后，用于组织学和电镜检查，结果组织学检查可见羊膜上细胞形成与在体时相似的3～5层细胞结构(如图4)，PAS染色未见杯状细胞，透射电镜观察可见细胞间形成较完整的桥粒结构(如图5)，细胞与羊膜间形成半桥粒结构，说明细胞在羊膜上已建立基底膜。
将解冻后的细胞在人羊膜支架上扩增培养后，移植构建的人工角膜上皮植片(如图6)到角膜缘干细胞缺失的病理模型(如图7)山羊角膜表面后，复明效果明显(如图8)。说明本发明所构建的组织工程角膜上皮在临床上具有广泛的应用潜力。
实施例2：
人的角膜缘干细胞的保存与无饲养层构建角膜上皮
取患有角膜缘缺损病人同侧或对侧2-4mm²大小的角膜缘上皮，在200×10^-3U/L青霉素和质量浓度为200mg/L链霉素生理盐水中浸泡15-20min，带入无菌室。PBS(-)冲洗数遍。体视显微镜(Leica公司)下，进一步板层分离角膜上皮后，置1.2IU dispase中冷消化12-14h，放入PBS(-)洗一遍，移入DMEM/F12+10％NBS培养液中终止消化，用细胞刮刀(Nunc.Inc.USA)轻轻刮下已消化好的上皮层，吸管反复吹打离散细胞。1000r/min离心两次，每次5min，收集细胞。
以后的实施方法与实施1相同。图3为冻存后的人角膜缘干细胞。