一种高效的聚乙二醇活化工艺及活化物的蛋白质修饰应用.pdf

本发明提供一种高效的聚乙二醇(PEG)末端羟基的活化工艺及其活化产物与蛋白质等带亲核基团的生物活性分子的修饰反应方法和反应产物。其特征是：(1)将PEG和甲苯加热到140℃共沸除去PEG中的水份。(2)无水PEG和2－氟－1－甲基吡啶鎓甲苯－4－磺酸盐在无水极性有机溶剂中进行反应。(3)反应过程中滴加有机碱维持pH在8－9。(4)用乙醚沉淀PEG活化产物，用异丙醇重结晶法纯化活化产物。(5)PEG活化产物在缓冲水溶液中与蛋白质等带有亲核基团的生物活性分子反应，得到PEG与该分子的偶联物。本发明提供的PEG的活化工艺具有产物活化率高(95％)，产物纯度高(99％)，修饰速度可控性好，修饰产物的化学稳定性好等特点。本发明的活化PEG尤其适用于多肽和蛋白质的修饰。

1.  一种聚乙二醇(PEG)末端羟基的高效活化工艺，其特征在于：(1)利用水和甲苯在140℃共沸的性质将PEG溶解在甲苯中，然后加热到140℃共沸除去PEG中的水份(PEG水份含量＜50ppm)；(2)无水PEG和2-氟-1-甲基吡啶鎓甲苯-4-磺酸盐在无水的极性有机溶剂(水份含量＜50ppm)中进行反应；(3)反应过程中滴加叔胺或者吡啶等有机碱维持溶液的pH在8～9之间；(4)利用乙醚沉淀的方法分离PEG活化产物；利用异丙醇重结晶的方法纯化PEG活化产物。

2.  一种如权利要求1所述的聚乙二醇(PEG)末端羟基的高效活化工艺，其特征在于，活化产物的活化率达95％；产物纯度达99％；产物化学稳定性好，在中性和酸性条件条件下能稳定保存6个月以上。

3.  一种如权利要求1所述的工艺制备的PEG的纯净活化产物，其特征是PEG末端的羟基被1-甲基-2-吡啶基取代，结构式如下图所示。
CH₂CH₂(OCH₂CH₂)_n-OR      (R为H或烃基)

4.  一种如权利要求1所述的聚乙二醇(PEG)末端羟基的高效活化工艺，其特征在于聚乙二醇的分子量为1,000～30,000，优选为2,000～20,000。

5.  一种如权利要求2所述的聚乙二醇(PEG)纯净活化产物对带亲核基团的生物活性分子的修饰(偶联)工艺，其特征在于PEG活化产物与带亲核基团的被修饰分子在pH7～10的缓冲液中直接反应。

6.  一种如权力要求5所述的修饰工艺制备的PEG活化产物与带亲核基团的生物活性分子的偶联(偶联)产物，其特征在于PEG末端的C原子与亲核基团直接以共价键结合，其结构式为：RO-(CH₂CH₂O)_nCH₂CH₂-AH-P或RO-(CH₂CH₂O)_nCH₂CH₂-B-P(A、B为亲核基团，P为带亲核基团的分子)

7.  一种如权利要求5所述的聚乙二醇(PEG)纯净活化产物对带亲核基团的生物活性分子的修饰(偶联)工艺，其特征在于带亲核基团的生物活性分子为血红蛋白。

8.  一种如权利要求5所述的聚乙二醇(PEG)纯净活化产物对带亲核基团的生物活性分子的修饰(偶联)工艺，其特征在于带亲核基团的生物活性分子为人体内粒细胞集落刺激因子。

9.  一种如权利要求5所述的聚乙二醇(PEG)纯净活化产物对带亲核基团的生物活性分子的修饰(偶联)工艺，其特征在于带亲核基团的生物活性分子为干扰素。

一种高效的聚乙二醇活化工艺及活化物的蛋白质修饰应用
                          发明领域
本发明属于蛋白质化学领域，特别涉及蛋白质修饰剂及其制备方法和用途。
                          背景技术
聚乙二醇(PEG)化学修饰蛋白质作为一种提高蛋白质在医药和生物技术领域应用的方法，正引起人们越来越多的关注。经过适当的化学修饰，蛋白质的很多特征会发生变化，同时有效地保持其主要的生物功能，如酶活性或受体识别能力。通过PEG修饰可掩饰蛋白质的表面并增加其分子体积，从而降低被肾小球过滤的几率；还可防止抗体、抗原、酶等的靠近，减少被蛋白酶类的降解。PEG还可将自身的理化性质赋予蛋白质，例如改变蛋白质的生物体内的分布及溶解性[i]，实现蛋白质药物的靶向给药。
许多实验已证明，蛋白质经PEG修饰后免疫原性与抗原性大大降低。例如经PEG修饰的牛血清蛋白(BSA)不与BSA抗血清发生沉淀，经PEG修饰的BSA免疫血清既不与BSA反应，也不与经PEG修饰的BSA反应，可见BSA丧失了免疫原性和抗原性[ii]。蛋白质经PEG修饰后其循环半衰期也有不同程度提高，如超氧化物歧化酶(SOD)经PEG化后，在体内的半衰期(T_1/2)从0.667h延长到5.09h[iii]。另外，经PEG共价修饰后蛋白质的稳定性也往往有不同程度的提高，许多不溶性药物经PEG修饰后给药更为容易[iv]。
目前，至少有2种PEG修饰的蛋白药物(PEG-L-天冬酰胺酶，PEG-腺苷脱氨酶)由FDA批准上市，有5种以上处于临床实验阶段。据不完全统计，有27种酶处于研究阶段。可见，PEG化学修饰技术是生化药物研究开发的重要手段，如果与基因重组技术相结合，将有更好的发展前景。
另外，由于PEG可改变蛋白质的可溶性、生物相容性、药代动力学等性质，在应用生物技术领域也具有很大潜力。例如，在有机相中不可溶的酶经PEG修饰后变为可溶且酶活性得到保留，这对生物催化及制药技术的发展具有重大意义。
PEG简介
PEG是一种线性的或分支的中性聚合物，溶于水及其他很多有机溶剂，其分子式为HO-(CH₂CH₂O)n-CHCH₂OH；用于蛋白质修饰的聚乙二醇多为单甲氧基聚乙二醇(mPEG)，分子式为HO-(CH₂CH₂O)n-CHCH₂O-CH₃。mPEG分子只有一个羟基用于偶联反应，另一端的羟基被甲基化，避免了偶联反应中蛋白质分子的相互交联。
PEG化学修饰蛋白质在生物技术及生物医药领域引起人们很大兴趣有以下几个原因：
(1)PEG没有毒性，已经被FDA批准用于体内服用^{[v，vi，vii]}。
(2)静脉注射到人体内的游离PEG很容易通过肾排出^[viii]。
(3)PEG的免疫原性很小。
(4)在蛋白质适当的部位共价偶联上PEG后，活性不会完全丧失，某些蛋白质还有活性升高的情况。并且能消除一些异体蛋白质的免疫原性，能延长蛋白质药物在体内的半衰期^[ix]。
(5)水溶液中PEG存在的条件下它能有效地排除其它聚合物，这一性质已经应用到双水相萃取的研究中。
PEG与蛋白质偶联后，PEG可以稳定被修饰的蛋白质分子；降低或消除蛋白质的免疫原性及提高耐受性；降低蛋白质被肾脏清除的速率；提高蛋白质对细胞膜的穿透力；改善药物动力学。
PEG活化技术
单甲氧基聚乙二醇的一端羟基被甲基封闭，可以避免蛋白质的交联；另一端的羟基化学反应活性较低，只能在较激烈的条件下直接与其它基团反应，而这样的条件常为蛋白质所不能耐受。因此需要用一定的方法改造PEG的末端羟基，即连接特定的活泼基团之后才能在温和的条件下，以较高的反应速率与蛋白质相偶联。这便是PEG的活化技术(activation)。
PEG修饰的位点可以是蛋白质表面的氨基，也可以是巯基或其它特殊基团，但大多数是修饰氨基。因为蛋白质分子表面的游离氨基，具有较高的亲核反应活性，使之成为蛋白质化学修饰中最常用的被修饰基团。
几种用于偶联蛋白质分子的mPEG的常用的活化方法在文献以及专利中都有报道。下图列出了常用的PEG活化方法，即mPEG的活性中间体的制备。mPEG的活性中间体含有能和蛋白质分子上的氨基或其它活性基团相反应的功能基团，与蛋白质分子的反应条件必须足够温和，以维持蛋白质的天然构象。同时，为达到此目的，应使用以水为溶剂的缓冲液以及接近中性的pH值。

在DAVIS及其最初合作者的研究工作中，三聚尿氰(1、2)和PEG上的醇羟基反应，以使三聚尿氰(或称三氯均嗪)环上的卤原子只有一个被取代，其它地卤原子可和蛋白质分子上的氨基反应(三氯均嗪，第一个Cl在4℃就可以反应，第二个在25℃，第三个在80℃才反应)。这一方法已被很多研究者所采用及改进，至今仍是最常用的方法之一。虽然这种活化只需一步即可完成，但因三卤均嗪衍生物的毒性以及过强的反应活性而使反应速度难以控制，因而使其应用受到限制。事实上，尿嗪卤化物被认为是蛋白质修饰最不合适的试剂。用其修饰的蛋白质常伴随生物活性的较大损失。
用N-羟基琥珀酰亚胺与其它化学试剂(3～8)联合对PEG活化的方法和修饰产物，实施可行性好、活性高，是近年来常被采用的方法和修饰剂，但这些修饰剂存在着容易水解、储存性能不稳定的缺点，而且对某些蛋白质反应活性过高，不利于控制修饰度和修饰位点。
1986年That T.Ngo在US4,582,875中公开了一种用2-氟-1-甲基吡啶鎓甲苯-4-磺酸盐(2-Fluoro-1-methylpyridinium toluene-4-sulfonate)活化固体载体聚合物羟基的方法，如多糖介质等。该试剂也可以用于PEG或mPEG羟基的活化。用2-氟-1-甲基吡啶鎓甲苯-4-磺酸盐活化的PEG或mPEG与前述方法的活化产物相比具有抗水解能力强的优点，因此特别适合于在水性溶液中对多肽或者蛋白质等生物活性分子进行活化修饰。但是That T.Ngo提供的活化方法并不特别适合于PEG或mPEG的活化，主要因为(1)该专利所公开的工艺是针对不溶于活化用溶剂的固体载体，而PEG或mPEG溶解于活化用溶剂，因此，包括原料处理、活化条件、产物分离、产物纯化等工艺将不同；(2)用于生物活性分子化学修饰的活化PEG或mPEG都有很高的要求，例如活化产物的活化率要高(＞95％)，活化产物的纯度要高(＞99％)等等。但是，很可惜用That T.Ngo提供的活化方法得到的活化PEG或mPEG并不能满足这些要求，因为它们的活化度较低(＜30％)，产物的纯度较低(＜75％)。用这样的活化PEG或mPEG对蛋白质进行化学修饰显然是不理想的，因为活化率低势必要用很高浓度的修饰剂，而修饰剂浓度过高对蛋白质的生物活性保护是不利的；修饰剂纯度低的话其含有的一些杂质也会对蛋白质的生物活性造成伤害。
为此，本发明提供一种高效的聚乙二醇(PEG)末端羟基的活化工艺及其活化产物在蛋白质修饰中的应用。其特征是：(1)利用水和甲苯在140℃共沸的性质将PEG溶解在甲苯中，然后加热到140℃共沸除去PEG中的水份(PEG水份含量＜50ppm)。(2)无水PEG和2-氟-1-甲基吡啶鎓甲苯-4-磺酸盐在无水的极性有机溶剂(水份含量＜50ppm)中进行反应，例如乙腈、二甲基甲酰胺(DMF)、丙酮等。(3)反应过程中滴加叔胺或者吡啶等有机碱维持溶液pH在8～9之间。(4)利用乙醚沉淀的方法分离PEG活化产物；利用异丙醇重结晶的方法纯化PEG活化产物。(5)纯净的PEG活化产物在缓冲水溶液中与蛋白质等带有亲核基团的生物活性分子反应，得到PEG与该分子的偶联物。本发明提供的PEG的活化方法与US4,582,875中公开的方法相比具有以下的优点：产物活化率高(95％vs 30％)；产物纯度高(99％vs 75％)。另外，还具有活化产物的化学稳定性好；修饰反应条件温和；修饰速度可控性好；修饰产物的化学稳定性好；修饰产物的生物活性保留值高等优点。所以本发明的活化PEG能应用于各种带亲核基团的分子的修饰，尤其适用于各种带氨基和巯基的生物活性分子，例如多肽和蛋白质的修饰，以达到降低其免疫原性、降低其被体内酶分解的速度、增加其分子量和溶解度、改善其在体内的药物动力学性质等目的。
蛋白质修饰技术
本发明提供的高纯度PEG修饰剂对三种蛋白质药物进行了修饰，即血红蛋白、重组人粒细胞集落刺激因子(rh G-CSF)以及重组人a-干扰素(rhIFN-a)。
血液最重要的生物学功能是通过血红蛋白实现的。将从动物血液或人体血液中提取的血红蛋白再输入人体，可以期望获得血红蛋白的携氧功能。首次报告使用血红蛋白作为红细胞替代物是在1898年，Von Stark用血红蛋白治疗一个贫血病人。尽管做了许多尝试，结果存在着：(1)血红蛋白很快从肾脏排泄出去，(2)肾毒性，(3)血压升高等现象；经人们研究发现：快速从肾脏排除是由于血红蛋白分子太小，肾毒性是由于血红蛋白进入血液后分解成二聚体，二聚体具有肾毒性；血压升高则是因为”血管活性”效应。血红蛋白由于有上述缺陷，因而不能直接用作血液替代品。一个解决的办法就是对血红蛋白用聚乙二醇或其它大分子进行化学修饰。这方面的研究在60-70年代作出了几个非常重要的发现。然而，真正努力开发用于人体的修饰血红蛋白是由于受到公众对于捐献血液中存在的HIV和丙肝及其它病毒的关注在80年代才开始的。
人体内粒细胞集落刺激因子(G-CSF)由单核巨噬细胞、血管内皮细胞、纤维母细胞和骨髓间质细胞产生，其功能是：(1)作用于中性粒细胞的前体细胞，促进多功能干细胞进入细胞周期，刺激其增殖和分化，加速粒细胞的生成；(2)感染时G-CSF的分泌增加，可促进中性粒细胞向炎症部位移动，增强其对病原微生物的吞噬和杀伤力；(3)加强中性粒细胞依赖细胞介导的细胞毒作用，增强其抗肿瘤能力；(4)活化单核巨噬细胞功能；(5)诱导某些白血病细胞分化和成熟。自从1986年Seuza等报道人粒细胞集落刺激因子基因在大肠杆菌中重组成功，表达并制备出重组蛋白以来，世界上一些药业公司相继对这一产品进行了开发、报批和批量生产，为这一产品的临床研究和应用创造了条件。然而其在人体内的循环半衰期却很短，主要是由于注入人体后，免疫系统会识别G-CSF并发生免疫反应将其清除，同时体内的蛋白水解酶也会将其水解一部分，肾小球将其作为小分子物质滤出。综上原因可见，G-CSF实际在体内的利用率是很低的，这无疑是一种极大的浪费。通过将PEG等大分子与G-CSF偶联的方法就可以达到以下的目的：(1)降低G-CSF的免疫原性，使其不因体内的免疫反应而被清除；(2)增强其抗蛋白酶水解能力；(3)增大G-CSF的分子量，大大降低肾小球对G-CSF的过滤速度。同时G-CSF的热稳定性、抗酸碱能力及抗变性能力都会有所增强，最终目的就是要延长G-CSF在体内的循环半衰期，提高利用率。
干扰素是一种细胞因子，它是机体感染病毒时，宿主细胞通过抗病毒应答反应而产生的一组结构类似、功能相近的低分子糖蛋白。干扰素是1957年英国科学家发现的。干扰素有多种亚型，其中最大的一类亚型是α-干扰素。α-干扰素具有三大功能：(1)抗病毒作用：这是干扰素最重要的也是应用最广的作用。干扰素通过抑制病毒复制和调节机体免疫功能，从而发挥抗病毒作用。(2)抗肿瘤作用：α-干扰素是临床上应用最广的治疗肿瘤的细胞因子。它通过直接抗肿瘤细胞增殖和调节机体免疫功能发挥抗肿瘤作用。(3)免疫调节作用：α-干扰素通过调节机体的免疫功能，从而间接地发挥抗病毒作用和抗肿瘤作用。丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)感染呈全球分布，易慢性化，其中20％的慢性患者将发展为肝硬化等终末期肝病，而HCV感染引起的肝硬化又是肝细胞癌变的重要相关因素。迄今为止，干扰素是唯一相对有效的治疗药物，然而，仅30％左右的干扰素治疗者可保持长期的丙氨酸氨基转移酶正常，即使在干扰素治疗中合并使用病毒唑，其长期效果也仅仅达到40％。干扰素单剂或干扰素联合病毒唑治疗丙型肝炎的低反应率主要与病毒因素、宿主因素以及治疗制剂因素三个方面有关。干扰素药代动力学过程对有效性的影响与HCV的复制特性有关。干扰素吸收后很快并分布到全身，肾脏清除率高，由于其这一特性，天然的干扰素或基因工程干扰素半衰期都很短，在血清中仅持续6h(4h～8h)。将聚乙二醇与干扰素偶联通过以下几个方面的机制来延长蛋白质药物在体内的半衰期，从而达到增强其生物学活性的作用：(1)蛋白质与聚乙二醇偶联后，分子质量增大，皮下注射后吸收缓慢；(2)聚乙二醇的甲基中含有大量的氢原子，其氢键可与水分子结合，因此，增加了聚乙二醇-蛋白质偶联物的水溶性；(3)聚乙二醇-蛋白质偶联物的分子质量增大，减少了肾脏的排泄。一般分子质量在68kD以下的蛋白质常由肾小球滤过经尿排出，聚乙二醇-蛋白质偶联物质量增大，同时流体半径加大，导致肾小球滤过减少。聚乙二醇链的复杂程度也会影响聚乙二醇-蛋白质偶联物被肾脏的清除，所以，偶联分支链PEG的蛋白质比偶联线性PEG的蛋白质肾脏清除率更低，半衰期更长。(4)PEG干扰了细胞清除机制，减少了蛋白质的细胞清除；(5)聚乙二醇与蛋白质的偶联物在血液循环中能抵抗被蛋白酶与肽酶的降解，这一特性可能与PEG包裹了蛋白质，阻断蛋白质与蛋白酶的接触有关。此外，血液循环中的胰蛋白酶的作用位点位于赖氨酸与精氨酸之间，而聚乙二醇与蛋白质分子偶联的主要位点也是赖氨酸，该位点与聚乙二醇的偶联妨碍了蛋白酶进入活性位点；(6)结合于组氨酸的PEG结合位点往往位于蛋白质三级结构核心，保证了聚乙二醇化的稳定性，(7)PEG本身并不具备抗原性，当蛋白质与聚乙二醇偶联后，PEG遮盖了蛋白的抗原决定族，从而降低了蛋白的抗原性。
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                          发明内容
本发明提供一种高效的聚乙二醇(PEG)末端羟基的活化工艺及其活化产物与蛋白质等带亲核基团的生物活性分子的修饰反应方法和反应产物。其特征是：(1)利用水和甲苯在140℃共沸的性质将PEG溶解在甲苯中，然后加热到140℃共沸除去PEG中的水份(PEG水份含量＜50ppm)。(2)无水PEG和2-氟-1-甲基吡啶鎓甲苯-4-磺酸盐在无水的极性有机溶剂(水份含量＜50ppm)中进行反应，例如乙腈、二甲基甲酰胺(DMF)、丙酮等。(3)反应过程中滴加叔胺或者吡啶等有机碱维持溶液pH在8～9之间。(4)利用乙醚沉淀的方法分离PEG活化产物；利用异丙醇重结晶的方法纯化PEG活化产物。(5)纯净的PEG活化产物在缓冲水溶液中与蛋白质等带有亲核基团的生物活性分子反应，得到PEG与该分子的偶联物。本发明提供的PEG的活化方法具有以下的优点：产物活化率高；产物纯度高。另外，还具有活化产物的化学稳定性好；修饰反应条件温和；修饰速度可控性好；修饰产物的化学稳定性好；修饰产物的生物活性保留值高等优点。所以本发明的活化PEG能应用于各种带亲核基团的分子的修饰，尤其适用于各种带氨基和巯基的生物活性分子，例如多肽和蛋白质的修饰，以达到降低其免疫原性，降低其被体内酶分解的速度，增加其分子量和溶解度，改善其在体内的药物动力学性质等目的。
本发明提供的高效活化工艺、高纯度活化产物及其与带亲核配基的分子的偶联方法和偶联产物可以带来以下效应：
1.本发明提供的高效活化工艺及其与带亲核基团的分子的偶联方法可用于带羟基的分子的活化，微球、药物载体、膜等表面的活化及其与带亲核基团的分子的连接。
2.各种带氨基或巯基的蛋白质、多肽、核酸的修饰，以达到降低蛋白质等的免疫原性，提高蛋白质和多肽的分子量，避免蛋白质被酶分解，提高蛋白质、多肽、核酸等药物在体内的半衰期，改变蛋白质、多肽、核酸等分子在各种溶剂中的溶解度等目的。
3.各种带亲核基团的低分子化合物的修饰，以达到提高低分子化合物的分子量，提高低分子药物在体内的半衰期，改变低分子化合物在各种溶剂中的溶解度等目的。
4.带羟基的各种低分子化合物的活化，以达到在低分子化合物上连接其它分子的目的。
附图说明
图1聚乙二醇的活化及其与带亲核基团分子的偶联反应示意图。
图2(A)和(B)是FMP-mPEG分别在0.5NHCl和0.5NNaOH溶液中的紫外-可见光吸收光谱。
图3(A)和(b)分别为m-PEG和FMP-mPEG的红外光谱。
图4FMP-mPEG修饰蛋白质(血红蛋白、G-CSF、α-干扰素)的SDS-PAGE电泳图。
具体实施方案
本发明包括一种高效的聚乙二醇(PEG)末端羟基的活化方法及其高纯度活化产物与蛋白质等带亲核基团的生物活性分子的偶联方法和偶联产物。PEG的活化流程以及活化产物与带亲核基团的分子的偶联反应流程如图1所示，其中TEA表示三乙胺，P-AH₂和P-SH表示带有亲核基团的分子。
具体方法和步骤说明如下：
1)聚乙二醇(PEG)的预处理：
利用水和甲苯在140℃共沸的性质将PEG溶解在甲苯中，然后加热到140℃共沸除去PEG中的水份。然后用PEG的非溶剂，例如乙醚将PEG从甲苯溶液中沉淀出来，并在真空干燥器中将乙醚完全除去得到干燥的PEG固体(PEG水份含量＜50ppm)。
2)聚乙二醇(PEG)的活化：
将预处理后的聚乙二醇溶解在无水的极性有机溶剂中，然后加入2-氟-1-甲基吡啶鎓甲苯-4-磺酸盐(FMP)进行反应，反应过程中滴加叔胺或者吡啶等有机碱维持溶液pH在8～9之间。
上述反应所使用的极性溶剂包括乙氰、二甲基甲酰胺(DMF)、丙酮以及四氢呋喃等。叔胺包括三乙胺或三丁胺等。反应条件为常温常压，反应时间为15分钟左右。聚乙二醇的分子量范围为1000-30000d。
3)聚乙二醇活化产物(FMP-PEG)的分离提纯：
用PEG的非溶剂，例如乙醚、乙酸乙酯等，将FMP-PEG从极性有机溶剂中沉淀出来，然后过滤除去溶剂。再将沉淀物溶于异丙醇中，并加热到55℃使固体完全溶解，然后在搅拌的条件下自然降温直到固体重新完全沉淀出来。再过滤除去异丙醇。最后用真空干燥器进一步除去溶剂得到干燥的FMP-PEG白色固体。
4)聚乙二醇活化产物(FMP-PEG)与带亲核基团的生物活性分子的偶联(修饰)：
将FMP-PEG与带亲核基团的分子在水性缓冲液(pH7-10)或极性有机溶剂中混合，使两者反应得到结构为RO-(CH₂CH₂O)_nCH₂CH₂-AH₂-P或RO-(CH₂CH₂O)_nCH₂CH₂-B-P(A、B为亲核基团)的偶联产物。
偶联反应的可以在不同的温度和pH条件下，在水溶液或极性有机溶剂中进行。反应条件根据反应试剂的敏感性和实际操作难易程度来确定。
带亲核基团的分子包括带伯氨、仲胺或巯基等基团的分子。任何可以取代PEG上1-甲基-2-吡啶基的基团都可以用作被修饰的分子。因此，被修饰分子可以包含任何的脂肪基、芳香基、杂环基或芳香杂环基或者任何包含前述基团组合的分子，只要该分子含有可以被偶联的功能基团。尤其是具有生物活性的分子，如包括酶、抗原或抗体在内的蛋白质分子；氨基酸；聚氨基酸；多肽；硫醇化合物；辅因子；核苷；多聚核苷酸；半抗原等。
实施例1
用2-氟-1-甲基吡啶鎓甲苯-4-磺酸盐(FMP)活化单甲氧基聚乙二醇5000(mPEG5000)
将250ml甲苯和50g mPEG5000加到1000ml的圆底烧瓶中，在圆底烧瓶上依次接上分水器、回流冷凝管和干燥塔，然后加热甲苯溶液到140℃。保持回流状态两个小时。然后将回流装置改为减压蒸馏装置，蒸出200ml甲苯。再向圆底烧瓶中加入500ml乙醚，在搅拌的条件下自然降温，直到固体完全沉淀出来。然后过滤除去乙醚，并将沉淀物放到真空干燥器中把残余的乙醚除去。得到干燥的无水mPEG5000。然后用卡氏水分测定仪测定干燥后无水mPEG5000中的水分含量，要求水分含量低于50ppm。
用量筒称量干燥25ml乙腈倒入500ml的圆底烧瓶中，将567mg FMP溶解于乙腈中。然后向烧瓶中加入10g分子量为5000的单甲氧基聚乙二醇(mPEG)。搅拌溶液的同时缓慢地向烧瓶中滴加三乙胺以维持溶液pH值在8～9之间。在常温常压的条件下反应15分钟。反应结束后向乙腈溶液中加入足量的乙醚，直到没有白色固体生成为止。用漏斗过滤乙醚和乙腈的混合溶液，并用300ml乙醚洗涤沉淀物。然后，将白色的固体重新溶于250ml异丙醇中，并加热到55℃完全溶解固体。在搅拌的条件下自然降温，直到固体完全沉淀出来。然后过滤除去异丙醇，并将沉淀物放到真空干燥器中干燥3个小时把残余的异丙醇除去。得到蓬松的白色固体。
使用紫外-可见光吸收光谱和红外光谱两种方法鉴定mPEG的活化产物的结构。将mPEG的活化产物(FMP-mPEG5000)分别溶于0.5N HCl溶液和0.5NNaOH溶液，对这两种溶液分别进行紫外-可见光的全波长扫描检测。图2是FMP-mPEG5000分别在这两种溶液中的特征吸收图谱。对比图2(A)和(B)可知，FMP-PEG的活性末端在酸性溶液中稳定，而在碱性溶液中发生水解，末端从PEG上脱落下来，吸光峰2从280nm移到297nm。另用傅利叶变换红外光谱鉴定活化产物的基团，图3(a)和(b)分别是mPEG-5000及其活化产物FMP-mPEG5000的红外光谱图。比较(a)和(b)可知，PEG经活化后，在3500cm^-1附近的O-H特征峰基本消失，而在1600cm^-1附近出现吡啶环的特征峰。将不同浓度的FMP溶于氨水中水解，然后用在229nm下测定的吸光值作标准曲线。同样，将活化的FMP-PEG溶于氨水并测定其在229nm下的吸光值。根据标准曲线可以计算出产物的活化率(95％)。根据活化率可以进一步计算得到产物的纯度(99％)。
实施例2
用FMP-mPEG5000偶联重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)
将G-CSF溶于0.1M硼酸-硼砂缓冲液，pH值为8.6，浓度为2.3mg/ml。取40ml溶液倒入200ml的锥形瓶并放到25℃的恒温振荡器中振荡。然后向锥形瓶中加入0.98克FMP-mPEG5000。反应持续30分钟后将反应体系的pH值调到4.0以终止偶联反应。然后用凝胶过滤色谱除去未反应的FMP-mPEG，将收集到的偶联产物用SDS-PAGE分析其分子量变化情况，结果如图4所示，用FMP-mPEG修饰后的产物分子量增大，表明FMP-mPEG与G-CSF生了偶联反应，得到了偶联产物。
实施例3
用FMP-mPEG5000偶联重组人α-干扰素(rhα-Interferon)
将α-干扰素溶于0.1M硼酸-硼砂缓冲液，pH值为7.6，浓度为3.5mg/ml。取40ml溶液倒入200ml的锥形瓶并放到25℃的恒温振荡器中轻轻振荡。然后向锥形瓶中加入3.1克FMP-mPEG5000。反应持续30分钟后将反应体系的pH值调到4.0以终止偶联反应。然后用凝胶过滤色谱除去未反应的FMP-mPEG，将收集到的偶联产物用SDS-PAGE分析其分子量变化情况。结果如图4所示，用FMP-mPEG修饰后的产物分子量增大，表明FMP-mPEG与α-干扰素生了偶联反应，得到了偶联产物。
实施例4
用FMP-mPEG5000修饰牛血红蛋白(BHb)
将血红蛋白(Hemoglobin)溶于0.1M的磷酸盐缓冲液，pH值为7.6，浓度为2.5mg/ml。取40ml溶液倒入200ml的锥形瓶并放到4℃的恒温振荡器中轻轻振荡。然后向锥形瓶中加入3.1克FMP-mPEG5000。反应持续30分钟后将反应体系的pH值调到4.0以终止偶联反应。然后用凝胶过滤色谱除去未反应的FMP-mPEG，将收集到的偶联产物用SDS-PAGE分析其分子量变化情况。结果如图4所示，用FMP-mPEG修饰后的产物分子量增大，表明FMP-mPEG与血红蛋白发生了偶联反应，得到了偶联产物。
前面所述几个实施方案的目的是为了更好地说明本发明，而不是为了限制本发明的范围。但是很明显，对于本领域的技术人员来讲对本方法和材料的任何改进或改变都不超出本发明的范围和精神。例如，使用其他分子量的mPEG或者其他的生物大分子。