具有抗炎活性的发酵鹿茸提取物的制备方法、由此得到的提取物及该提取物的用途.pdf

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1、10申请公布号CN104105492A43申请公布日20141015CN104105492A21申请号201280058853X22申请日20121019102011010759720111020KRA61K35/32200601A61P29/0020060171申请人株式会社美莱德可利亚地址韩国大田市申请人郑昌晖72发明人郑昌晖崔学柱金东熙74专利代理机构北京德崇智捷知识产权代理有限公司11467代理人王金双54发明名称具有抗炎活性的发酵鹿茸提取物的制备方法、由此得到的提取物及该提取物的用途57摘要本发明涉及一种具有抗炎活性的发酵鹿茸提取物的制备方法及该提取物的用途，尤其涉及一种包括下列步骤。

2、的由鹿茸制造鹿茸发酵提取物的方法、由此得到的提取物及如此得到的提取物的用途步骤1在细切的鹿茸添加精制水并进行热水提取及过滤；步骤2在步骤1中得到的液相成分上添加芽孢杆菌菌株培养液并予以发酵而得到第一发酵提取液；及步骤3在步骤1中得到的鹿茸渣滓上添加精制水后，添加曲霉菌株培养液并予以发酵而得到第二发酵提取液。本发明利用最接近大自然的发酵方法提取鹿茸，能够减少鹿茸的生理活性物质的破坏、增加有效成分的含量、提高生产性，因此该方法可以有效地作为各种领域中所使用的鹿茸提取物制备方法。尤其是，由于本发明系统性地阐释了抗炎活性而非常适合广泛地应用在食品、化妆品等处。30优先权数据85PCT国际申请进入国家阶。

3、段日2014052986PCT国际申请的申请数据PCT/KR2012/0085882012101987PCT国际申请的公布数据WO2013/058594KO2013042551INTCL权利要求书2页说明书9页附图3页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书9页附图3页10申请公布号CN104105492ACN104105492A1/2页21一种由鹿茸制造鹿茸发酵提取物的方法，其包括下列步骤步骤1，在细切的鹿茸添加精制水并进行热水提取及过滤；步骤2，步骤1中得到的液相成分，对细切的鹿茸每100重量份添加10到30重量份的芽孢杆菌菌株培养液，在30到40发酵2到3天后。

4、得到第一发酵提取液；及步骤3，在步骤1中得到的鹿茸渣滓上添加精制水后，对细切的鹿茸每100重量份添加10到30重量份的曲霉菌株培养液，在50到70发酵2到3天后得到第二发酵提取液。2根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括下列步骤，在选自上述第一发酵提取液、第二发酵提取液、第一发酵提取液及第二发酵提取液的混合物所构成的群之一个以上添加包合配合物，然后搅拌而予以分子胶囊化。3根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在上述步骤1中，在细切的鹿茸每100重量份添加200到500重量份的精制水，在80到100进行热水提取。4根据权利要求1所述的方法，其特征在于，芽孢杆菌菌株培养液包含乳酪芽孢杆菌。

5、BACILLUSCASEI。5根据权利要求1所述的方法，其特征在于，曲霉菌株培养液包含酪曲霉ASPERGILLUSCASEI。6根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在选自第一发酵提取液、第二发酵提取液、第一发酵提取液及第二发酵提取液的混合物所构成的群之一个以上，对该混合物每100重量份添加20到30重量份的包合配合物后，在60到70搅拌，将其缓缓冷却到常温而实现分子胶囊化。7根据权利要求8所述的方法，其特征在于，包合配合物选自环糊精、冠醚、聚氧化烯、PROPHORINE、聚硅氧烷、PHOPHAZENE及沸石所组成的群。8一种配合物，其特征在于，由对细切鹿茸进行热水提取后得到的液相成分上添加芽。

6、孢杆菌菌株培养液并发酵而得到的发酵提取液与包合配合物形成。9一种配合物，其特征在于，由对细切鹿茸进行热水提取后得到的固形鹿茸粉上添加曲霉菌株培养液并发酵而得到的发酵提取液与包合配合物形成。10一种配合物，其特征在于，由对细切鹿茸进行热水提取后得到的液相成分上添加芽孢杆菌菌株培养液并发酵而得到的发酵提取液、对细切鹿茸进行热水提取后得到的固形鹿茸粉上添加曲霉菌株培养液并发酵而得到的发酵提取液的混合物、及包合配合物所形成。11根据权利要求8到权利要求10之任何一项所述的配合物，其特征在于，包合配合物选自环糊精、冠醚、聚氧化烯、PROPHORINE、聚硅氧烷、PHOPHAZENE及沸石所组成的群。12。

7、一种鹿茸发酵提取物，其特征在于，其为由权利要求2得到的生成物或将权利要求10到权利要求12中任一项所述的配合物予以高压灭菌后得到的液相型的鹿茸发酵提取物。权利要求书CN104105492A2/2页313一种鹿茸发酵提取物，其特征在于，其为由权利要求2得到的生成物或将权利要求10到权利要求12中任一项所述的配合物予以高压灭菌并将其冻干而得到的粉末型鹿茸发酵提取物。14根据权利要求8或权利要求10之任何一项所述的配合物，其特征在于，上述芽孢杆菌菌株培养液所含发酵菌株是选自乳酪芽孢杆菌BACILLUSCASEI，受托编号KACC91310P、枯草芽孢杆菌BSUBTILIS、纳豆芽孢杆菌BNATTO、。

8、短芽孢杆菌BBREVIS中的某一个。15根据权利要求9或权利要求10之任何一项所述的配合物，其特征在于，上述曲霉菌株培养液所含发酵菌株是选自酪曲霉ASPERGILLUSCASEI、米曲霉AORYZAE、黑曲霉ANIGER、灰绿曲霉AGLAUCUS，尤其是黑曲霉ASPERGILLUSNIGER中的某一个。16一种功能性健康食品，其特征在于，把选自权利要求1或权利要求2所制造的鹿茸发酵提取物、权利要求8到权利要求10之任一项的配合物、通过权利要求2得到的生成物、或将权利要求10到权利要求12之任一项的配合物予以高压灭菌而得到的液相型鹿茸发酵提取物、及通过权利要求2得到的生成物、或将权利要求10到权。

9、利要求12之任一项的配合物予以高压灭菌并予以冻干后得到的粉末型鹿茸发酵提取物的一个以上作为有效成分而包含。17一种功能性化妆品，其特征在于，把选自权利要求1或权利要求2所制造的鹿茸发酵提取物、权利要求8到权利要求10之任一项的配合物、及通过权利要求2得到的生成物、或将权利要求10到权利要求12之任一项的配合物予以高压灭菌并予以冻干后得到的粉末型鹿茸发酵提取物的一个以上作为有效成分而包含。权利要求书CN104105492A1/9页4具有抗炎活性的发酵鹿茸提取物的制备方法、由此得到的提取物及该提取物的用途技术领域0001本发明涉及一种鹿茸提取物的制造方法、由此得到的提取物及该提取物的用途，尤其是，。

10、一种利用发酵提取制造鹿茸提取物的制造方法、由此得到的提取物及该提取物的用途。背景技术0002鹿茸CERVIPARVUMCORUN指的是一般鹿角，其具体指称雄鹿的下述角，该角开始生长不到2个月并且没有进行角质化而用手触摸时能稍微感到柔软，组织柔软并且均匀地分布有毛。柔软的角到了秋天会角质化而变硬，这是为了在发情期为占有雌鹿而战斗时使用，经过角质化的角则成为效用低于鹿茸的鹿角。该鹿角错过收获时期而进行钙化后由于硬化而自然掉落的则称为落角。0003根据东医宝鉴等文献的记载，鹿茸具有强壮作用、补血作用、强精作用、镇痛作用、造血作用、生长发育促进作用、心功能不全的治疗作用及机能亢进作用等功效，此外，还具。

11、有恢复疲劳,增强身体活力及加强肾脏利尿功能等众多效能。0004传统中医药所使用的鹿茸服用方法主要包括下列两种把鹿茸与各类草药剂混合并加以粉碎后，以水为溶剂进行加热提取并服用其滤液的方法；把草药剂加以粉碎制成粉末后，以丸剂方式服用的方法。上述两种方法各有其优缺点，提取后服用的方法虽然较易吸收鹿茸的有效成分，却会浪费掉提取渣滓中所含有的有效成分。提取鹿茸后浓缩使用时，固形粉含量达到20以上时会出现凝胶化问题而难以应用到产品。丸剂型虽然具有能够摄取鹿茸本身的优点，但很难在体内完全吸收有效成分。0005韩国公开专利第1020030073134号揭示的鹿茸提取方法在细切的鹿茸上添加水并加热减压提取后，把。

12、滤液加以浓缩、喷雾干燥后予以粉末化，该方法针对传统中医药所使用的热水提取法进行了局部改善并且为了服用便利而将提取液粉末化，却没有解决现有问题，亦即，无法利用提取渣滓中所含大量有效成分而予以废弃。韩国公开专利第1020050090041号揭示的鹿茸提取方法则将鹿茸或鹿角粉碎后进行温水提取、蛋白分解酶处理及盐酸分解处理，该方法为了克服温水提取法的界限而另外进行处理及盐酸分解处理，但其工序包含很多步骤而繁复耗时，由于使用强酸而破坏了对人体有益的生理活性物质。而且，如此得到的现有鹿茸提取物大部分具有令人不快的味道与颜色而较难应用到食品或化妆品，只有很少一部分能够作为原料使用。0006解决的技术课题00。

13、07为了解决现有鹿茸提取方法的问题，本发明的目的是提供一种鹿茸发酵提取物的制造方法，本发明为了避免破坏鹿茸固有的生理活性物质而在低温仅仅使用发酵方法2次却能顺畅地提取，从而得以在短时间内充分地分解而制成有效成分含量高的鹿茸发酵提取物。0008而且，本发明的另一个目的是提供一种凭借本发明的制备方法得到的提取物及配说明书CN104105492A2/9页5合物。0009而且，本发明的再一个目的是提供一种功能性健康食品及化妆品，该功能性健康食品及化妆品为了提高如此得到的鹿茸发酵提取物的稳定性而利用分子胶囊化技术设计出对光线、空气、热及酸稳定的剂型而且还能在流通期限内维持抗炎活性。0010解决课题的技术。

14、方案0011为了达到上述目的，本发明提供一种包括下列步骤的由鹿茸制造鹿茸发酵提取物的方法0012步骤1，在细切的鹿茸添加精制水并进行热水提取及过滤；0013步骤2，在步骤1中得到的液相成分上添加芽孢杆菌菌株培养液并予以发酵而得到第一发酵提取液；及0014步骤3，在步骤1中得到的鹿茸渣滓上添加精制水后，添加曲霉菌株培养液并予以发酵而得到第二发酵提取液。0015根据本发明，优选地，还包括下列步骤，在选自上述第一发酵提取液、第二发酵提取液、第一发酵提取液及第二发酵提取液的混合物所构成的群之一个以上添加包合配合物，然后搅拌而予以分子胶囊化。0016根据本发明，在上述步骤1中，在细切的鹿茸每100重量份。

15、添加200到500重量份的精制水，在80到100进行热水提取较佳。0017根据本发明，在上述步骤2中，在细切的鹿茸每100重量份添加10到30重量份的芽孢杆菌菌株培养液，在30到40的温度发酵2到3天较佳。0018根据本发明，芽孢杆菌菌株培养液包含乳酪芽孢杆菌BACILLUSCASEI较佳。0019根据本发明，在上述步骤3中，在细切的鹿茸每100重量份添加10到30重量份的曲霉菌株培养液，在50到70的温度发酵2到3天较佳。0020根据本发明，曲霉菌株培养液包含酪曲霉ASPERGILLUSCASEI较佳。0021根据本发明，在选自第一发酵提取液、第二发酵提取液、第一发酵提取液及第二发酵提取液的。

16、混合物所构成的群之一个以上对该混合物每100重量份添加20到30重量份的环糊精CYCLODEXTRIN后，在60到70搅拌，将其缓缓冷却到常温而实现分子胶囊化较佳。0022根据本发明，包合配合物选自环糊精、冠醚、聚氧化烯、PROPHORINE、聚硅氧烷、PHOPHAZENE及沸石所组成的群较佳。0023而且，本发明提供一种配合物，该配合物由对细切鹿茸进行热水提取后得到的液相成分上添加芽孢杆菌菌株培养液并发酵而得到的发酵提取液与包合配合物形成。0024而且，本发明提供一种配合物，该配合物由对细切鹿茸进行热水提取后得到的固形鹿茸粉上添加曲霉菌株培养液并发酵而得到的发酵提取液与包合配合物形成。002。

17、5而且，本发明提供一种配合物，该配合物由对细切鹿茸进行热水提取后得到的液相成分上添加芽孢杆菌菌株培养液并发酵而得到的发酵提取液、对细切鹿茸进行热水提取后得到的固形鹿茸粉上添加曲霉菌株培养液并发酵而得到的发酵提取液的混合物、及包合配合物所形成。0026根据本发明，包合配合物选自环糊精、冠醚、聚氧化烯、PROPHORINE、聚硅氧烷、PHOPHAZENE及沸石所组成的群较佳。说明书CN104105492A3/9页60027而且，本发明提供通过本发明的制备方法制造的生成物或将本发明的配合物予以高压灭菌而得到的液相型的鹿茸发酵提取物。0028而且，本发明提供通过本发明的制备方法制造的生成物或将本发明的。

18、配合物予以高压灭菌并冻干后得到的粉末型鹿茸发酵提取物。0029而且，本发明提供一种功能性健康食品及功能性化妆品，其把选自通过本发明的制备方法制造的鹿茸发酵提取物、本发明的配合物及液相型及粉末型鹿茸发酵提取物的至少一个作为有效成分而包含。0030有益效果0031本发明仅仅通过利用芽孢杆菌及曲霉菌株的发酵提取方法就能在短时间内提取足够的鹿茸有效成分，因此能够解决现有热水提取或利用强酸、酶的水解法对生理活性物质的破坏问题，还能凭借分子胶囊化方法实现生理活性物质含量高的鹿茸发酵提取物的高稳定性。附图说明0032图1是示出鹿茸的分子量大小随着发酵时间而变化的照片。0033图2是图示了各提取方法的神经节苷。

19、脂类热稳定性试验的图形。0034图3是图示了各提取方法的神经节苷脂类酸稳定性试验的图形。0035图4是图示了LPS同时处理后发酵鹿茸分子胶囊对于在血清生产IL6所发挥出来的效果的图形。0036图5是图示了LPS同时处理后发酵鹿茸分子胶囊对于在血清生产MCP1所发挥出来的效果的图形。0037图6是图示了LPS同时处理后发酵鹿茸分子胶囊对于在血清生产IL1B所发挥出来的效果的图形。0038图7是图示了LPS同时处理后发酵鹿茸分子胶囊对于在血清生产TNFA所发挥出来的效果的图形。具体实施方式0039本发明的第一形态提供由鹿茸制造鹿茸发酵提取物的方法。尤其是，本发明提供包括下列步骤的由鹿茸制造鹿茸发酵。

20、提取物的方法步骤1，在细切的鹿茸添加精制水并进行热水提取及过滤；步骤2，在步骤1中得到的液相成分上添加芽孢杆菌菌株培养液并予以发酵而得到第一发酵提取液；及步骤3，在步骤1中得到的鹿茸渣滓上添加精制水后，添加曲霉菌株培养液并予以发酵而得到第二发酵提取液。0040下面按照各步骤详细说明本发明的鹿茸发酵提取物的制备方法。0041热水提取步骤0042在步骤1中，在细切的鹿茸添加精制水并进行热水提取及过滤。更具体地说，在被干燥并细切的鹿茸100重量份添加精制水200到500重量份，添加300到40重量份则较佳。在80到100提取该混合液2到5小时并过滤。精制水的量小于或大于上述所记载的范围时会降低提取效。

21、率或导致稀释，从而在后续的发酵步骤中引起经济性问题。0043凭此，把得到的生成物区分成液相成分及鹿茸粉。在此，鹿茸粉指的是凭借热水提说明书CN104105492A4/9页7取得到的物质中液相成分以外的其余固形粉，是含有较多角质而无法溶解在水的固形粉。0044第一次发酵提取步骤0045步骤2针对上述步骤所得到的液相成分添加芽孢杆菌菌株培养液并发酵而得到第一发酵提取液。尤其是，本步骤在上述步骤所得到的液相成分上对细切的鹿茸每100重量份添加芽孢杆菌菌株培养液10到30重量份，优选地，添加20到25重量份，然后在30到40，优选地，在35到37发酵2天到3天。0046本发酵提取步骤使用芽孢杆菌菌株培。

22、养液，其所含发酵菌株以乳酪芽孢杆菌BACILLUSCASEI，受托编号KACC91310P、枯草芽孢杆菌BSUBTILIS、纳豆芽孢杆菌BNATTO、短芽孢杆菌BBREVIS较适合。0047作为一例，本发明的芽孢杆菌菌株培养液是在月示蛋白胨PROTEOSEPEPTONENO33100G、牛肉提取物100G、酵母提取物50G、右旋糖DEXTROSE200G、吐温8010G、柠檬酸铵AMMONIUMCITRATE20G、乙酸钠50G、硫酸镁01G、硫酸锰005G、磷酸氢二钾DIPOTASSIUMPHOSPHATE20G接种干乳酪杆菌LACTOBACILLUSCASEIKACC91310P并培养一个。

23、晚上后的液体。0048在该第一次发酵提取步骤，如果发酵温度小于或大于上述所记载的温度范围则无法进行发酵或者菌株失去活性而无法进行发酵。0049经过了第一次发酵提取步骤后，可以进行过滤以清除未反应固形粉。过滤方面，则使用01到3M过滤器过滤1次以上较佳。过滤器的气孔尺寸小于01M时由于过滤器超精密、价格超高超滤法而降低了经济性，超过3M时，则不具备除菌能力而使得真菌或细菌被包含在最终提取物，从而很可能在流通过程中被污染。0050凭此，通过本步骤的第一次发酵提取步骤得到第一发酵提取液。0051第二次发酵提取步骤0052在步骤3中，在上述步骤1中得到的鹿茸渣滓添加精制水后添加曲霉菌株培养液10到30。

24、重量份，优选地，添加20到25重量份，在50到70，优选地，在60到65发酵2天到3天。鹿茸渣滓的发酵由于角质成分较多而在相对较低的发酵温度条件无法完全发酵，因此在较高温度发酵较适合。0053本发酵提取步骤使用曲霉菌株培养液，其所含发酵菌株为酪曲霉ASPERGILLUSCASEI、米曲霉AORYZAE、黑曲霉ANIGER、灰绿曲霉AGLAUCUS，其中以黑曲霉ASPERGILLUSNIGER较适合。0054作为一例，本发明的曲霉菌株培养液可以如下所述地制造把黑曲霉KK2菌株接种到PDAPOTATODEXTROSEAGAR斜面培养基并且在28培养7天后，添加01TWEEN80溶液将孢子予以悬浮。。

25、把孢子悬液每10ML含35107孢子10ML接种到含有90ML麦芽提取物MALTEXTRACT的250ML的三角烧瓶后，在28的振荡培养器以200RPM进行种菌培养SEEDCULTURE48小时。在121、在15气压下对含有本培养基475ML的250ML三角烧瓶进行灭菌20分钟，然后进行了种菌。接种25ML并且在28的振荡培养器以200RPM培养5天。本培养基由25的稻草RICESTRAW，03MM以下的尺寸、125的麦麸WHEATBRAN，04MM以下的尺寸、45的玉米浆CORNSTEEPLIQUOR、0125的工业酵母提取液INDUSTRIALYEASTEXTRACT、065的磷酸二氢钾P。

26、OTASSIUMPHOSPHATE,MONOBASIC、005的硫酸铜五水化物、001的硫酸钴七水化物构成，以5N说明书CN104105492A5/9页8氢氧化钠把PH调整成70。0055经过了第二次发酵提取步骤可以进行过滤以清除未反应固形物质。过滤方面，则使用01到3M过滤器过滤1次以上较佳。过滤器的气孔尺寸小于01M时由于过滤器超精密、价格超高超滤法而降低了经济性，超过3M时则不具备除菌能力而使得真菌或细菌被包含在最终提取物，从而很可能在流通过程中被污染。0056分子胶囊化步骤0057为了得到本发明的增强了稳定性的鹿茸发酵提取物，本发明的制备方法还包括下列步骤，亦即，在上述第一发酵提取液及。

27、/或第二发酵提取液的混合物添加包合配合物，然后搅拌而予以分子胶囊化。尤其是，在上述第一发酵提取液及/或第二发酵提取液的混合液100重量份投入环糊精20到30重量份后并且在60到70搅拌4小时而把生理活性物质予以分子胶囊化。为了让分子胶囊进一步稳定化而缓缓冷却到常温后制成稳定性高的胶囊。包合配合物以环糊精、冠醚、聚氧化烯、PROPHORINE、聚硅氧烷、PHOPHAZENE或沸石较佳，环糊精则更佳。凭此，形成了由第一鹿茸发酵提取液及第二鹿茸发酵提取液的混合物与包合配合物所形成的配合物。0058如此制造的本发明的提取物或配合物包括了进行高压灭菌后得到的液相及将其冻干的粉末产品。优选地，高压灭菌在1。

28、21进行30分钟。0059如此得到的第一发酵提取液及第二发酵提取液混合的鹿茸提取物、及/或将其予以分子胶囊化后得到的配合物、及/或液相型或粉末型鹿茸发酵提取物可以作为有效成分应用于功能性健康食品及化妆品等。0060本发明所得到的发酵提取液在低温利用发酵方法2次二提取，不仅不会破坏生理活性物质而且提取液所含鹿茸成分多于利用现有提取方法得到的提取液，而且可以凭籍分子胶囊化提到稳定性而得以设计出对光线、空气、热及酸稳定的剂型，因此可以作为功能性健康食品及化妆品的有效成分使用。0061除了本发明鹿茸提取物以外，需要添加的健康食品及化妆品的赋型剂及其它添加剂的种类与量可由本领域的技术人员轻易地选择，本说。

29、明书将不对此予以限制。0062下面结合具体实施例更详细地说明本发明。但不能利用下述实施例局限本发明的范畴，在本发明所属领域中具有通常知识者可以在本发明的技术思想范畴与权利要求书的均等范围内进行各种变形及修改。0063具体实施方式0064发酵鹿茸分子胶囊的制备00651把干燥并细切的鹿茸10KG添加到精制水35并且在90提取4小时后，通过过滤把鹿茸渣滓予以分离后获得滤液。00662为了得到第一阶段发酵物，在所获得的滤液添加枯草芽孢杆菌BACILLUSSUBTILIS培养液1KG后在37发酵2天。之后，使用1M过滤器进行过滤而清除了未反应固形粉。00673为了得到第二阶段发酵物，把上述1项中分离的。

30、鹿茸渣滓添加到精制水60KG，在此添加黑曲霉ASPERGILLUSNIGER培养液1KG后在60发酵2天。之后，使用1M过滤器进行过滤而清除了未反应固形粉。00684把上述发酵及过滤后的第一阶段、第二阶段鹿茸发酵物予以混合，通过琼脂过说明书CN104105492A6/9页9滤将该混合液过滤。在该滤液添加环糊精25KG并且在60搅拌4小时而把生理活性物质予以分子胶囊化。为了让分子胶囊进一步稳定化而缓缓冷却到常温后制成稳定性高的胶囊。0069把如此制成的组合物予以冻干并进行粉末化。此时得到的经过冻干的粉末达到了33KG以上。0070与此相关地，为了测量所获得的上述上述第一阶段、第二阶段鹿茸发酵物的。

31、分子量尺寸而进行了电泳实验。其结果如图1所示。从图1得知，分子量尺寸随着发酵进度而变小，进而变成容易被人体吸收的尺寸。0071利用酶制备鹿茸水解物0072利用粉碎机粉碎干燥的鹿茸1。在粉碎的鹿茸粉末1添加木瓜蛋白酶PAPAIN10G及蒸馏水5后，在70反应8小时，然后水解鹿茸粉末。把水解后的溶液予以过滤清除未反应固形粉。此时，第一次过滤使用2M过滤器，第二次过滤使用045M过滤器，第三次过滤则使用02M过滤器。0073利用热水提取制备鹿茸提取物0074利用粉碎机粉碎干燥的鹿茸1。把粉碎的鹿茸粉末1添加到蒸馏水5L后在100提取7小时，然后过滤。此时，第一次过滤使用2M过滤器，第二次过滤使用04。

32、5M过滤器，第三次过滤则使用02M过滤器。0075生理活性物质的分析00761氮总量及氨基酸0077针对上述实施例1及比较例1、2中最后得到的鹿茸提取物的氮总量进行了分析。结果如下列表1所示。0078表10079项目氨基酸分析结果0080实施例1比较例1比较例20081氮总量8780780150082氮总量及氨基酸分析0083如上述表1所示，与现有方法得到的鹿茸提取物比较例1及2相比，本发明的发酵鹿茸分子胶囊的氮总量与氨基酸含量增加了几倍到几十倍。00842生理活性物质分析0085蛋白质定量分析0086在100UG/ML的标准牛血清白蛋白BSA溶液取出20、40、60、80、100UL后混合适。

33、当量的蒸馏水各为780、760、740、720、700UL及200UL的蛋白质验证染料后制成1ML，在595NM利用UV分光光度计对其测量了吸收度。把试料溶解到蒸馏水并混合蛋白质验证染料制成1ML，在595NM利用UV分光光度计对其测量吸收度并且以对于BSA的含有量计算后决定含量。0087糖羰酸定量分析CARBAZOLEASSAY0088把D葡萄糖醛酸内酯作为标准物使用并且凭借咔唑CARBAZOLE反应在530NM利用UV分光光度计测量了吸收度。0089把试料溶解在蒸馏水并且凭借咔唑反应在530NM利用UV分光光度计测量吸收度，说明书CN104105492A7/9页10以对于D葡萄糖醛酸内酯的。

34、含有量计算后决定含量。0090葡萄糖胺聚糖GLYCOSAMINOGLYCAN定量分析CARBAZOLEASSAY0091把NZP硫酸软骨素作为标准物使用并且凭借咔唑反应在530NM利用UV分光光度计测量了吸收度。0092把试料溶解在蒸馏水并且凭借咔唑反应在530NM利用UV分光光度计测量吸收度，以对于NZP硫酸软骨素的含有量计算后决定含量。0093唾液酸定量分析WARRENASSAY0094把N乙酰神经氨酸作为标准物使用并且凭借WARREN方法在549NM利用UV分光光度计测量了吸收度。0095在80以01N硫酸水解试料1小时，然后凭借WARREN方法在549NM利用UV分光光度计测量吸收度，。

35、以对于N乙酰神经氨酸的含有量计算后决定含量。0096利用酶分解硫酸软骨素0097把源于普通变形杆菌PROTEUSVULGARIS的软骨素酶ABCCHONDROITINASEABCC2905,SIGMA溶入50MMTRISHCL60MM乙酸钠缓冲剂PH80而成为1U/ML。以NZPCS作为标准物使用，把标准物与样品溶解成10MG/ML后与缓冲剂混合，添加酶30MU，在37让其反应12小时并分析硫酸软骨素的含有量。0098EGF的分析0099为了分析EGF，针对鹿茸热水提取物、水解物、发酵提取物进行了人的EGF特异ELISA。为了制作标准曲线而在250PG/ML0PG/ML浓度区段通过线性回归分析。

36、选择具备先线性性的浓度区段，在该区段把3种试料各自适用于试验后进行了吸收度分析。并且凭此分析了基于标准EGF的浓度的试料EGF。0100神经节苷脂的定量分析ZIGZAGTLCSCANNER0101把神经节苷脂标准物SIGMACO溶解在甲醇后，通过TLC法展开后利用ZIGZAGTLC扫描器在波长550NM扫描得到RF039与042的最大积分值，凭此制作校正曲线。0102之后，按照和标准品方法相同的方法施于各试料并且从RF039与042的最大积分值对各试料的神经节苷脂类进行了定量分析。0103利用上述分析法针对热水提取、水解、发酵提取分子胶囊进行了生理活性物质的分析并且将其结果列在下述表2。010。

37、4表20105成分试料蛋白质唾液酸GAG糖羰酸硫酸软骨素EGFG/G神经节苷脂0106热水提取522002358302452560000245830107水解684001526701713532670108发酵鹿茸分子胶囊758003293503747860000579350109各鹿茸提取物的生理活性物质分析单位MG/G0110如上述表2所示，相比于热水提取、水解的鹿茸提取物，通过发酵提取并将其分子胶囊化时含有大量生理活性物质。0111神经节苷脂的稳定性试验0112针对作为鹿茸的代表性生理活性物质的神经节苷脂进行了热、酸稳定性试验。但，由于上述表2中基于水解的神经节苷脂含量最低而在比较实验中。

38、排除在外，在实施例1、比说明书CN104105492A108/9页11较例2及实施例1中针对以没有进行分子胶囊发酵提取方法制造的鹿茸在80保管4星期的温度严酷条件及在PH1保管4星期的酸严酷条件下测量了神经节苷脂的变化量。图2与图3是其结果。0113从图2的结果得知，以高温进行热水提取的鹿茸会随着时间经过而大幅减少神经节苷脂含量，提取温度相对较低的发酵则比热水提取具有较高的神经节苷脂含量，但也会减少。然而，分子胶囊化的鹿茸的神经节苷脂含量则即使经过了较长时间其含量依然与初始状态没有多少差异。0114从图3的结果得知，以高温进行热水提取的鹿茸在强酸条件下随着时间经过而大幅减少神经节苷脂含量，提取。

39、温度相对较低的发酵则比热水提取具有较高的神经节苷脂含量，但也会减少。然而，分子胶囊化的鹿茸的神经节苷脂的含量则即使经过了较长时间其含量依然与初始状态没有多少差异。0115发酵鹿茸分子胶囊的抗炎活性试验01161试料发酵鹿茸分子胶囊01172动物0118实验动物方面，让采购自大韩实验动物中心的BALB/C系小鼠在实验室环境适应1星期后应用于实验。动物饲育室的条件采取了通常的系统，在222条件下，在一天中的12小时利用200300LUX照明，12小时则遮蔽一切光线。为动物供应了足够的固形饲料粗蛋白质221以上，粗脂肪80以下，粗纤维50以下，粗灰分80以下，钙06以上，磷04以上，三养社，没有添加。

40、抗生素与水。01193试剂及设备0120在本实验所用试剂中，脂多糖类LPS使用SIGMASIGMACO,USA产品，生理盐水使用JW制药产品，IL1,IL6,TNF,MCP1ELISAKIT使用MILLIPORE公司USA产品，其它试剂则使用优级纯。本实验所用设备则使用了离心分离器BECKMANCO,USA、滚轮混合器GOWONSCIENTICTECHNOLOGYCO,KOREA、涡流混合器VORTEXMIXERVISIONSCIENTICCO,KOREA、LUMINEXMILLIPORE,CO,USA等。01214实验方法INVIVO实验0122在源于脂多糖类LPS的炎症小鼠模型及细胞因子测。

41、量用正常组，每只口服投药盐水200UL，发酵鹿茸分子胶囊剂量组则利用口服用针ORALZONDE按照一天一次的方式对每只小鼠口服投药200MG、100MG/KG共7天。7天后，把脂多糖类LPS1/注射到腹腔并且在60分钟后利用乙醚麻醉，以心脏穿刺法采血。采血后分离血清并且以ELISA法测量IL1、IL6、TNF、MCP1的生成量。在各个孔WELL分注小鼠血清100L稀释1/100后，处理抗体蛋白生物素BIOTIN结合CONJUGATE的100L，在室温放置2小时后，利用清洗缓冲溶液清洗2次后处理抗体抗生物素蛋白HRP结合CONJUGATE的100L，在室温放置2小时后重新清洗。在这里各自分注TM。

42、B底物100L并且放置于母牛30分钟，然后处理100L的STOP溶液后利用ELISA判读器在450NM测量吸收度ABSORBANCE。01235统计处理0124通过各种实验得到的结果则以平均标准偏差予以记录，显著性验证则利用学生检验STUDENTSTTEST分析方法决定。说明书CN104105492A119/9页1201256结果012661IL60127在7天内为BALB/C小鼠投入发酵鹿茸分子胶囊，然后从源于LPS的急性炎症模型分离血清后测量IL6的结果为，正常组为1232357PG/ML，对照组为5446371PG/ML，发酵鹿茸分子胶囊100剂量组为3016567PG/ML，发酵鹿茸分。

43、子胶囊200剂量组为212298PG/ML，对照组相比于正常组显著地增加，在发酵鹿茸分子胶囊剂量组则相比于对照组呈浓度依赖性地显著P001，P0001减少。图4是其结果。012862MCP10129在7天内为BALB/C小鼠投入发酵鹿茸分子胶囊，然后从源于LPS的急性炎症模型分离血清后测量MCP1的结果为，正常组为1241252PG/ML，对照组为4182881PG/ML，发酵鹿茸分子胶囊100剂量组为2148311PG/ML，发酵鹿茸分子胶囊200剂量组为1982226PG/ML，对照组相比于正常组显著地增加，在发酵鹿茸分子胶囊剂量组则相比于对照组呈浓度依赖性地显著P005，P001减少。图。

44、5是其结果。013063IL1B0131在7天内为BALB/C小鼠投入发酵鹿茸分子胶囊，然后从源于LPS的急性炎症模型分离血清后测量IL1B的结果为，正常组为25656PG/ML，对照组为116886PG/ML，发酵鹿茸分子胶囊100剂量组为612111PG/ML，发酵鹿茸分子胶囊200剂量组为51692PG/ML，对照组相比于正常组显著地增加，在发酵鹿茸分子胶囊剂量组则相比于对照组呈浓度依赖性地显著P001，P0001减少。图6是其结果。013264TNFA0133在7天内为BALB/C小鼠投入发酵鹿茸提取粉末，然后从源于LPS的急性炎症模型分离血清后测量TNFA的结果为，正常组为13143。

45、60PG/ML，对照组为3970911PG/ML，发酵鹿茸分子胶囊100剂量组为3114545PG/ML，发酵鹿茸分子胶囊200剂量组为1432325PG/ML，对照组相比于正常组显著地增加，在发酵鹿茸分子胶囊剂量组则相比于对照组呈浓度依赖性地显著P0001减少。图7是其结果。0134产业上的用途0135本发明利用最接近大自然的发酵方法提取鹿茸，能够减少鹿茸的生理活性物质的破坏、增加有效成分的含量、提高生产性，因此该方法可以有效地作为各种领域中所使用的鹿茸提取物制备方法。尤其是，由于本发明系统性地阐释了抗炎活性而非常适合广泛地应用在食品、化妆品等用途。说明书CN104105492A121/3页13图1图2说明书附图CN104105492A132/3页14图3图4说明书附图CN104105492A143/3页15图5图6图7说明书附图CN104105492A15。