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1、10申请公布号CN104189921A43申请公布日20141210CN104189921A21申请号201410446245722申请日20140903A61K48/00200601A61P21/00200601A61P35/0020060171申请人中国医学科学院基础医学研究所地址100005北京市东城区东单三条5号72发明人朱大海于潇华张勇李婷婷74专利代理机构北京戈程知识产权代理有限公司11314代理人程伟韩文华54发明名称LINCRAM在治疗肌肉疾病中的用途57摘要本发明涉及LINCRAM在治疗肌肉疾病中的用途。具体地，本发明涉及LINCRAM在制备治疗肌肉疾病，特别是肌肉损伤和横纹。
2、肌肉瘤的药物中的用途。本发明还涉及LINCRAM制备促进肌肉干细胞分化的药物中的用途，制备促进成纤维细胞转变为成肌细胞试剂及药物中的用途。51INTCL权利要求书1页说明书13页附图10页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书13页附图10页10申请公布号CN104189921ACN104189921A1/1页21一种长链非编码RNA分子在制备治疗肌肉疾病的药物中的用途，所述长链非编码RNA分子选自LINCRAM。2根据权利要求1所述的用途，其中所述肌肉疾病选自肌肉损伤或横纹肌肉瘤。3根据权利要求1或2所述的用途，其中所述肌肉损伤为急性肌肉损伤。4一种长链非编码R。
3、NA分子在制备促进肌肉干细胞分化或促进成纤维细胞转分化或促进横纹肌肉瘤细胞分化的药物中的用途，所述长链非编码RNA分子选自LINCRAM。5一种含有编码LINCRAM的核苷酸的载体用于治疗肌肉疾病的药物中的用途。6根据权利要求5所述的用途，其中所述肌肉疾病选自肌肉损伤或横纹肌肉瘤。7根据权利要求5或6所述的用途，其中所述肌肉损伤为急性肌肉损伤。权利要求书CN104189921A1/13页3LINCRAM在治疗肌肉疾病中的用途技术领域0001LINCRAM是本发明人首次鉴定并对其功能和分子机制进行研究，本发明涉及LINCRAM在治疗肌肉疾病，特别是肌肉损伤和横纹肌肉瘤的作用。背景技术0002骨骼。
4、肌是人体最大的组织器官，约占体重的40，在生物体的生命活动中起着非常重要的作用。它不仅发挥运动和支持的功能，同时它也是一个重要的代谢器官。身体所摄取的糖和脂类物质大多在骨骼肌中代谢产生能量，这对维持整个身体的平衡状态起着非常重要的作用。骨骼肌的发生是一个有序和严格调控的过程，不仅受各种肌肉特异性转录因子的调控，同时受到NCRNAS以及染色质修饰和重塑等表观遗传的精细调控。0003在众多的肌肉疾病中，如周期性瘫痪、肌营养不良、肌炎等都存在不同程度的肌肉损伤，目前的治疗药物较少、副作用较大，效果较差。如杜氏肌营养不良症DMD，是一种性联隐性遗传病，又名为假性肥大型肌肉萎缩症，为症状最严重的肌肉萎缩。
5、症。由于基因突变缺陷导致肌肉细胞不能正常产生一种称为抗肌萎缩蛋白DYSTROPHIN的蛋白质，会使钙离子渗入细胞，引发瀑布反应，导致患者全身肌肉无力，又因肌肉细胞内缺少抗肌萎缩蛋白，导致细胞组织肌肉纤维变得无力且脆弱，其肌细胞不断地处于损伤修复过程中，经长期的伸展后该缺失肌肉细胞组织将产生机械性伤害等因素而破坏，最终导致肌肉细胞死亡。全球平均每3500个新生男婴中就有一人罹患此病，患者在学龄前就会因骨骼肌不断退化出现肌肉无力或萎缩，导致不便行走。大概在7岁到12岁时，会彻底丧失行走能力，通常到20多岁就会因为心肌、肺肌无力而死亡。目前针对该病，医学界尚无有效疗法。0004近年来，将成体干细胞植。
6、入DMD肌肉疾病的小鼠体内，取得显著治疗效果，参见BENCHAOUIRR,MEREGALLIM,FARINIA,DANTONAG,BELICCHIM,GOYENVALLEA,BATTISTELLIM,BRESOLINN,BOTTINELLIR,GARCIAL,TORRENTEYCELLSTEMCELLRESTORATIONOFHUMANDYSTROPHINFOLLOWINGTRANSPLANTATIONOFEXONSKIPPINGENGINEEREDDMDPATIENTSTEMCELLSINTODYSTROPHICMICE2007,1664657。但是成肌细胞移植治疗存在着排异反应以及差的细胞。
7、生存率等局限性，PARTRIDGETACELLSTHATPARTICIPATEINREGENERATIONOFSKELETALMUSCLEGENETHER2002,9117523。利用基因治疗将肌萎缩蛋白DYSTROPHIN导入患者体内，使之表达肌萎缩蛋白，具体实施非常困难，主要是因为携带DNA片段较大且要将它们置于大基因组的正确的位置，且外源DNA需先转录MRNA后再翻译为目的蛋白，此过程会受到体内各种机制的调节和影响。因而寻找到直接用于基因治疗的核酸类药物更容易治疗或缓解疾病的效果。0005此外，横纹肌肉瘤RHABDOMYOSARCOMA是发生自胚胎间叶组织的一种恶性肿瘤，其细胞类似于成肌。
8、细胞MYOBLAST，大多数的横纹肌肉瘤细胞表达生肌决定因子MYOGENICDIFFERENTIATION1，MYOD，然而横纹肌肉瘤细胞却不具备从增殖至终末分化的能力，因而无限增殖，形成恶性肿瘤。横纹肌肉瘤占儿童实体肿瘤的15，软组织肉瘤的说明书CN104189921A2/13页450。临床表现的多样性、病理改变的多重性以及发病部位的不同，使横纹肌肉瘤成为小儿肿瘤中最复杂的一种。横纹肌肉瘤分成以下4种亚型胚胎型、腺泡型、葡萄簇型和多形型。早期的根治性手术方法包括截肢、骨盆及眼眶肿瘤剜除术。在过去的几十年里，针对肿瘤的不同发生部位及其扩展的范围采用化疗、放疗与手术相结合的措施，患者的生存率有了。
9、显著地提高，由于横纹肌肉瘤的治疗具有特征性，即外科及放射的局部治疗往往达不到长期生存的目的，只有应用全身性化疗才能明显提高生存率，这种全身性的化疗对人体产生极大的危害。0006因此，寻找抑制横纹肌肉瘤细胞增殖，且降低对病人身体伤害的药物成为当今癌症治疗的研究热点，目前，已有报道表明ANTIMIR122在美国已经获准进入临床治疗肝癌，提示越来越多的核酸类药物进入临床应用的可能性，且核酸类药物因其自身的使用方便，容易大量生产，特异性强等特点，为临床用药的选择提供了潜能。0007长链非编码RNALONGNONCODINGRNA,LNCRNA广泛存在于各种生物体中，参见STEFANIG,SLACKFJ。
10、SMALLNONCODINGRNASINANIMALDEVELOPMENTNATREVMOLCELLBIOL2008,9321930。绝大多数由RNA聚合酶II转录并经可变剪接而来。LNCRNA是一类转录本长度超过200NT的RNA分子，它们并不编码蛋白，而是以RNA的形式在多种层面上，如表观遗传调控、参见MAZOA,HODGSONJW,PETRUKS,SEDKOVY,BROCKHWTRANSCRIPTIONALINTERFERENCEANUNEXPECTEDLAYEROFCOMPLEXITYINGENEREGULATIONJCELLSCI2007,120PT16275561；KATAYAMA。
11、S,TOMARUY,KASUKAWAT,WAKIK,NAKANISHIM,NAKAMURAM,ETALANTISENSETRANSCRIPTIONINTHEMAMMALIANTRANSCRIPTOMESCIENCE,2005,309574015646。转录调控以及转录后调控等调控基因的表达水平。0008最近的研究表明，一些LNCRNAS参与调控骨骼肌发育过程中重要的转录因子和信号分子的表达，从而调控骨骼肌细胞的增殖和分化。如，MYOSTAIN处理小鼠后，MALAT1在腓肠肌中的表达水平显著下调，进一步研究发现在C2C12细胞和原代骨骼肌细胞分化时MALAT1MRNA的表达上调，敲除MALAT1。
12、后，细胞增殖受到抑制，参见WATTSR,JOHNSENVL,SHEARERJ,HITTELDSMYOSTATININDUCEDINHIBITIONOFTHELONGNONCODINGRNAMALAT1ISASSOCIATEDWITHDECREASEDMYOGENESISAMJPHYSIOLCELLPHYSIOL2013,30410C9951001。类固醇受体RNA激活子SRA可转录为非编码SRANCRNA和编码的SRAP亚型，SRANCRNA能够增强骨骼肌细胞分化，同时SRANCRNA与MYOD结合后，能够增强MYOD介导的非骨骼肌细胞转分化为骨骼肌细胞，但是这种作用可被SRAP抑制，进一步研。
13、究发现，SRAP的抑制作用需要通过与SRANCRNA的相互作用得以实现，参见CARETTIG,SCHILTZRL,DILWORTHFJ,DIPADOVAM,ZHAOP,OGRYZKOV,FULLERPACEFV,HOFFMANEP,TAPSCOTTSJ,SARTORELLIVTHERNAHELICASESP68/P72ANDTHENONCODINGRNASRAARECOREGULATORSOFMYODANDSKELETALMUSCLEDIFFERENTIATIONDEVCELL2006,11454760；HUBF,VELASCOG,ROLLINJ,FURLINGD,FRANCASTELCSTE。
14、ROIDRECEPTORRNAACTIVATORPROTEINBINDSTOANDCOUNTERACTSSRARNAMEDIATEDACTIVATIONOFMYODANDMUSCLEDIFFERENTIATIONNUCLEICACIDSRES2011,39251325。0009目前，对于LNCRNAS调控骨骼肌发育的机制研究中，有研究者发现LNCRNAS能够说明书CN104189921A3/13页5调节MIRNAS的表达或与MIRNAS相互作用，从而进一步实现对骨骼肌发育的调控。如，YY1正调控骨骼肌相关的LINCRNAYAM1的表达，YAM1通过调节MIR715的表达抑制骨骼肌生成，参见LU。
15、L,SUNK,CHENX,ZHAOY,WANGL,ZHOUL,SUNH,WANGHGENOMEWIDESURVEYBYCHIPSEQREVEALSYY1REGULATIONOFLINCRNASINSKELETALMYOGENESISEMBOJ2013,3219257588。H19敲除的骨骼肌细胞和小鼠骨骼肌干细胞分化受到抑制，进一步研究发现，H19基因第一个外显子编码MIR6753P和MIR6755P两个MIRNA，两者随着分化逐渐被诱导表达，二者能够弥补由于H19敲除所造成的骨骼肌细胞分化和损伤修复抑制，参见DEYBK,PFEIFERK,DUTTAATHEH19LONGNONCODINGRN。
16、AGIVESRISETOMICRORNASMIR6753PANDMIR6755PTOPROMOTESKELETALMUSCLEDIFFERENTIATIONANDREGENERATIONGENESDEV2014MAR1；285491501。CESANA等通过分析MIR206和MIR133B的基因组结构发现一个骨骼肌细胞特异性表达且随着骨骼肌细胞分化表达上调的长链非编码RNALINCMD1，LINCMD1基因与MIR206和MIR133B的基因组序列重叠，机制研究发现，LINCMD1通过结合MIR133和MIR135，竞争性调节MIR133和MIR135与其靶基因MAML1和MEF2C结合，从而。
17、调控骨骼肌细胞分化，参见CESANAM,CACCHIARELLID,LEGNINII,SANTINIT,STHANDIERO,CHINAPPIM,TRAMONTANOA,BOZZONIIALONGNONCODINGRNACONTROLSMUSCLEDIFFERENTIATIONBYFUNCTIONINGASACOMPETINGENDOGENOUSRNACELL2011OCT14；147235869。提示，MIRNAS作为LNCRNAS与靶基因之间的桥梁，可能对探讨LNCRNAS的作用机制更显捷径。0010同样，在肌肉疾病中可以检测到一些LNCRNAS分子的异常表达，提示LNCRNAS参与肌肉疾。
18、病的生理病理进程。DMD基因座位鉴定出一系列LNCRNAS，提示这些LNCRNAS可能参与肌营养不良，参见BOVOLENTAM,ERRIQUEZD,VALLIE,BRIOSCHIS,SCOTTONC,NERIM,FALZARANOMS,GHERARDIS,FABRISM,RIMESSIP,GUALANDIF,PERINIG,FERLINIATHEDMDLOCUSHARBOURSMULTIPLELONGNONCODINGRNASWHICHORCHESTRATEANDCONTROLTRANSCRIPTIONOFMUSCLEDYSTROPHINMRNAISOFORMSPLOSONE2012,79E4。
19、5328。LINCMD1在杜氏肌细胞中表达下调，参见CESANAM,CACCHIARELLID,LEGNINII,SANTINIT,STHANDIERO,CHINAPPIM,TRAMONTANOA,BOZZONIIALONGNONCODINGRNACONTROLSMUSCLEDIFFERENTIATIONBYFUNCTIONINGASACOMPETINGENDOGENOUSRNACELL2011OCT14；147235869。面肩肱型肌营养不良症FSHD是常染色体显性遗传肌肉病，大部分患者存在4Q35的D4Z4重复序列的缺失，健康的受试者D4Z4募集PCG蛋白抑制4Q35基因，FSHD患者由于。
20、D4Z4的缺失，PCG复合体的沉默作用降低，导致产生染色质相关的非编码RNADBET,DBET募集ASH1L蛋白到FSHD位点，使H3K36去甲基化，染色质重塑，导致4Q35区域的基因转录激活，参见CABIANCADS,CASAV,BODEGAB,XYNOSA,GINELLIE,TANAKAY,GABELLINIDALONGNCRNALINKSCOPYNUMBERVARIATIONTOAPOLYCOMB/TRITHORAXEPIGENETICSWITCHINFSHDMUSCULARDYSTROPHYCELL2012,149481931，提示DBET参与面肩肱型肌营养不良症的发生发展。0011这。
21、些研究结果提示LNCRNAS参与骨骼肌细胞增殖、分化及骨骼肌发育的调控，并且在肌肉疾病的病理发生过程中发挥重要作用。MYOD是肌生成中重要的转录因子，其调节MYOGENIN等一系列肌生成相关基因的表达，MYOD敲除的小鼠肌肉损伤修复存在缺陷，参见YABLONKAREUVENIZ,RUDNICKIMA,RIVERAAJ,PRIMIGM,ANDERSONJE,NATANSON说明书CN104189921A4/13页6PTHETRANSITIONFROMPROLIFERATIONTODIFFERENTIATIONISDELAYEDINSATELLITECELLSFROMMICELACKINGMYOD。
22、DEVBIOL1999,210244055；且异位表达MYOD可将成纤维细胞转变为成肌细胞，参见TAPSCOTTSJ,DAVISRL,THAYERMJ,CHENGPF,WEINTRAUBH,LASSARABMYOD1ANUCLEARPHOSPHOPROTEINREQUIRINGAMYCHOMOLOGYREGIONTOCONVERTBROBLASTSTOMYOBLASTSSCIENCE1988,242487740511。因而寻找受MYOD调控且在骨骼肌细胞中特异表达的LNCRNAS可能在肌生成以及肌肉疾病的病理发生过程中发挥重要的作用。发明内容0012本发明人通过一系列实验首次鉴定一个受MYOD。
23、调控的长链非编码RNA2310015B20RIK，根据RACE实验结果，其5端增加四个碱基序列CAGT，遂全长变为447BP，因其在骨骼肌细胞中特异表达，其表达量在小鼠骨骼肌发育、C2C12细胞以及分离的原代成肌细胞的分化过程中逐渐上调，且在基因组中介于两个编码蛋白的基因之间，命名为LINCRAMLINCRNAACTIVATOROFMYOGENESIS。本发明人首次发现，LINCRAM受转录因子MYOD调控，显著促进骨骼肌细胞分化，在CTX诱导的急性肌肉损伤修复模型中显著促进骨骼肌损伤修复进程，LINCRAM单独或者协助MYOD将成纤维细胞转分化为成肌细胞。将小鼠的LINCRAM在胚胎型横纹肌。
24、肉瘤细胞系RD细胞中异位表达，LINCRAM显著抑制RD细胞增殖，并促进分化。并且，人LINCRAM在人类肌肉营养不良疾病中表达下调，提示可能在肌肉疾病中发挥作用。0013分子机制研究发现LINCRAM作为MYOD的共激活子调节肌源性基因的表达，进一步研究发现LINCRAM通过与MYOD结合，介导MYODBAF60CBRG1复合体的形成，从而使染色质重塑，调节下游肌源性基因的表达，并且这种作用是P38A依赖的。分子信号传导研究发现BFGF通过RAS/RAF/MEK/ERK1/2/MYOD信号通路调节LINCRAM的表达。0014我们的研究提示LINCRAM促进骨骼肌细胞分化，单独或者协助MYO。
25、D将成纤维细胞转分化为成肌细胞，促进RD细胞分化，在人类肌肉疾病治疗中具有潜在作用。0015因此，本发明提供一种长链非编码RNA分子在制备治疗肌肉疾病的药物中的用途，所述长链非编码RNA分子选自LINCRAM。0016在一个优选的实施方案中，所述肌肉疾病选自肌肉损伤或横纹肌肉瘤。0017在另一个优选的实施方案中，所述肌肉损伤为急性肌肉损伤。0018本发明另一方面提供一种长链非编码RNA分子在制备促进肌肉干细胞分化、成纤维细胞转分化、促进横纹肌肉瘤细胞分化的药物中的用途，所述长链非编码RNA分子选自LINCRAM。0019本发明进一步提供一种含有编码LINCRAM的核苷酸的载体用于治疗肌肉疾病，。
26、特别是肌肉损伤和横纹肌肉瘤用途。优选地，所述肌肉损伤为急性肌肉损伤。0020术语“肌肉损伤”是指在直接外力或间接外力的作用下引起的肌肉的挫伤、拉伤等，急性肌肉损伤是指肌肉的急性损伤。附图说明0021图1A显示LINCRAM在小鼠不同组织中的表达情况；图1B显示LINCRAM在小鼠说明书CN104189921A5/13页7胚胎115天的表达情况；图1C显示LINCRAM在小鼠骨骼肌不同发育阶段中的表达情况；图1D显示LINCRAM在C2C12细胞分化过程中的表达情况；图1E显示LINCRAM在小鼠原代成肌细胞的表达情况；图1F显示CHIPPCR检测MYOD在LINCRAM的启动子区具有结合位点；。
27、图1G显示荧光素酶报告基因检测MYOD通过结合LINCRAM启动子区域的EBOX调节LINCRAM的表达；1H显示异位表达MYOD的成纤维细胞中，LINCRAM被诱导表达；图1I显示LINCRAM在MYOD敲除的小鼠骨骼肌中的表达情况；图1J显示LINCRAM在细胞质和细胞核中的分布；图1K显示FISH检测LINCRAM在细胞质和细胞核中的分布。0022图2A显示利用慢病毒转染C2C12细胞构建LINCRAM敲低的细胞系，REALTIMEPCR检测LINCRAM的敲低倍数；图2B显示C2C12NC和C2C12LINCRAM敲低细胞分化60小时后MHC绿色免疫荧光染色结果，DAPI染色红色定位细。
28、胞核；图2C显示MHC阳性细胞数量统计结果；图2D显示C2C12NC和C2C12LINCRAM敲低的细胞分化60小时后MHC蛋白水平的检测结果；图2E显示利用慢病毒转染C2C12细胞构建LINCRAM高表达的细胞系，REALTIMEPCR检测LINCRAM的高表达倍数；图2F显示C2C12NC和C2C12LINCRAM高表达的细胞分化60小时后MHC绿色免疫荧光染色结果，DAPI染色红色定位细胞核；图2G显示MHC阳性细胞数量统计结果；图2H显示C2C12NC和C2C12LINCRAM高表达的细胞分化60小时后MHC蛋白水平的检测结果；图2I显示利用慢病毒转染C2C12细胞构建MYOD敲低的细。
29、胞系，REALTIMEPCR检测MYODMRNA敲低倍数；图2J显示LINCRAM高表达质粒转染MYOD敲低的C2C12细胞分化24H后，MYOGENIN绿色免疫荧光染色结果，DAPI染色红色定位细胞核；图2K显示MYOGENIN阳性细胞数量统计结果；图2L显示LINCRAM高表达质粒转染MYOD敲低的C2C12细胞分化24H后，检测MYOGENINMRNA的表达。0023图3A1和图3A2分别显示利用慢病毒转染C3H10T1/2细胞构建LINCRAM高表达和MYOD高表达的细胞系，REALTIMEPCR检测LINCRAM和MYOD的高表达倍数；图3B显示LINCRAM高表达和MYOD高表达的。
30、C3H10T1/2细胞分化3天后MHC绿色免疫荧光染色结果，DAPI染色蓝色定位细胞核；图3C1至图3C3显示REALTIMEPCR检测MYOD高表达的C3H10T1/2细胞分化3天后LINCRAM，MYOG和MHCMRNA的表达；图3D1至图3D3显示REALTIMEPCR检测LINCRAM高表达的C3H10T1/2细胞分化3天后LINCRAM，MYOG和MHCMRNA的表达；图3E显示MYOD高表达的C3H10T1/2细胞分别高表达和敲低LINCRAM后分化48小时，MHCMRNA的表达情况；图3F显示MYOD高表达的C3H10T1/2细胞分别高表达和敲低LINCRAM后分化48小时，MH。
31、C免疫荧光染色结果；图3G显示敲低LINCRAM分化48小时后，MHC阳性细胞数量统计结果；图3H显示敲低LINCRAM分化48小时后MHC阳性多核2个细胞数量统计结果；图3I显示收取处于增殖期和分化48小时LINCRAM和MYOD高表达的C3H10T1/2细胞，RNASEQ检测差异表达的基因，HEATMAP显示差异表达FOLD2的基因；图3J显示RTPCR检测成纤维细胞谱系和成肌细胞谱系相关基因在LINCRAM高表达和MYOD高表达的C3H10T1/2细胞分化过程中的表达变化。0024图4A1和图4A2显示CTX损伤24小时的胫骨前肌电转LINCRAM高表达质粒后，RTPCR检测LINCRA。
32、M的表达；图4B显示CTX损伤的胫骨前肌电转LINCRAM高表达质粒55和75天后，胫骨前肌横切面HE染色结果；图4C显示CTX损伤75天胫骨前肌肌纤维横切面面积统计；图4D1至图4D3显示CTX损伤35天，REALTIMEPCR检测MYOD，MYOG说明书CN104189921A6/13页8和MHCMRNA的表达。0025图5A显示利用慢病毒转染RD细胞构建小鼠LINCRAM高表达的细胞系，RTPCR检测LINCRAM的高表达倍数；图5B显示LINCRAM高表达的RD细胞分化72小时后MHC绿色免疫荧光染色结果，DAPI染色红色定位细胞核；图5C显示MHC阳性细胞数量统计结果；图5D1和图5。
33、D2显示REALTIMEPCR检测LINCRAM高表达的RD细胞分化3天后MYOD和MYOGMRNA的表达；图5E显示根据小鼠LINCRAM在基因组中的位置，通过同源线性区域分析人类基因组中HUMANLINCRAM，包括两种变体；图5F1至图5F4显示人类肌营养不良的样品中检测HUMANLINCRAM的表达，以及MYOD和MYOGMRNA的表达，其中HUMANLINCRAM包括两个变体，A代表正常的骨骼肌组织，B代表肌营养不良组织，3，5，6，7，8代表5个肌营养不良的病人。0026图6A显示LINCRAM高表达和敲低的C2C12细胞分化12小时，RNASEQ检测差异表达的基因，HEATMAP。
34、显示差异表达FOLD2的基因；图6B显示GO基因注释的结果；图6C显示MYOD和LINCRAM共同调节的基因；图6D显示MYOD和LINCRAM共同调节与肌细胞增殖，分化和结构相关的基因；图6E显示RTPCR进一步确定MYOD和LINCRAM共同调节的基因在LINCRAM高表达和敲低的C2C12细胞分化12小时后的表达变化；图6F显示不同剂量0，06UG，10UG的LINCRAM高表达质粒与04UGMYOD高表达质粒共转染C3H10T1/2细胞，荧光素酶报告基因检测MYOG启动子MYOG基因转录起始位点上游470BP103BP活性；图6G显示C3H10T1/2细胞分别转染MYOD和LINCRA。
35、M高表达质粒分化48小时后，REALTIMEPCR检测MYOG的表达；图6H1至图6H3显示甲醛固定LINCRAM高表达和敲低的C2C12细胞，超声破碎后分别加入MYOD，H3K4ME3和POLII抗体进行染色质免疫共沉淀实验，REALTIME分别检测这三种蛋白在MYOG启动子区域的富集程度；图6I1至图6I3显示甲醛固定LINCRAM高表达和敲低的C2C12细胞，超声破碎后分别用MYOD,H3K4ME3和POLII抗体染色质免疫共沉淀，REALTIME分别检测这三种蛋白在MIR206远端启动子区域的富集程度。0027图7A显示提取RNASEFREE的C2C12细胞裂解液，利用MYOD抗体免疫。
36、共沉淀，WESTERNBLOT检测MYOD蛋白水平，RTPCR检测LINCRAM水平；图7B显示提取RNASEFREE的C2C12细胞裂解液，分别利用MYOD，BAF60C和BRG1抗体免疫共沉淀，RTPCR检测LINCRAM水平；图7C1和图7C2显示REALTIMEPCR检测LINCRAM高表达和敲低的C2C12细胞中BAF60C和BRG1MRNA的表达量；图7D显示分别提取LINCRAM高表达和敲低的C2C12细胞RNASEFREE裂解液，利用MYOD抗体免疫共沉淀，WESTERNBLOT检测MYOD，BAF60C和BRG1蛋白水平；图7E1至图7E4显示甲醛固定LINCRAM高表达和敲。
37、低的C2C12细胞，超声破碎后分别用MYOD，BAF60C，BRG1和H3K9AC抗体染色质免疫共沉淀，REALTIMEPCR分别检测MYOD，BAF60C，BRG1和H3K9AC蛋白在MYOG启动子区域的富集程度；图7F显示10UMSB203580处理LINCRAM高表达的C2C12细胞分化36小时，MHC绿色免疫荧光染色结果，DAPI染色蓝色定位细胞核；图7G显示MHC阳性细胞数量统计结果；图7H显示10UMSB203580处理LINCRAM高表达的C2C12细胞分化36小时，MHCMRNA水平的检测结果；图7I显示10UMSB203580处理LINCRAM高表达的C2C12细胞分化18小。
38、时，LINCRAM的表达结果；图7J显示10UMSB203580处理LINCRAM高表达的C2C12细胞分化18小时，甲醛固定LINCRAM高表达的C2C12细胞，超生声破碎后用BRG1抗体染色质免疫共沉淀，说明书CN104189921A7/13页9REALTIME分别检测BRG1在MYOG启动子区域的富集程度。0028图8A1至图8A3显示10NG/MLBFGF处理C2C12细胞分化6、12、24小时后检测LINCRAM的表达情况；图8B显示C2C12细胞分别转染LINCRAM野生型和突变型启动子，即LINCRAMWT390BP80BP和LINCRAMMUTANT87和88位碱基突变，10N。
39、G/MLBFGF处理C2C12细胞分化24小时，荧光素酶报告基因检测LINCRAM启动子的活性，MYOD1KB和MYOGGBBS启动子作为阳性对照；图8C显示10UMPD98059预处理C2C12细胞1小时后再用BFGF处理C2C12细胞分化24小时检测PERK，TERK，PMEK，TMEK蛋白的表达情况；图8D1至图8D3显示PD98059预处理C2C12细胞1小时后再用BFGF处理C2C12细胞分化24小时检测MYOD，LINCRAM和MYOG的表达情况；图8E显示10UMPD98059预处理C2C12细胞1小时后再用BFGF处理C2C12细胞分化24小时，荧光素酶报告基因检测LINCRA。
40、MWT和LINCRAMMUTANT启动子的活性；图8F1至图8F3显示5UMFTA预处理C2C12细胞30分钟后再用BFGF处理C2C12细胞分化24小时，检测MYOD，LINCRAM和MYOG的表达情况；图8G1至图8G3显示25UMGW预处理C2C12细胞30分钟后再用BFGF处理C2C12细胞分化24小时后，检测MYOD，LINCRAM和MYOG的表达情况；图8H显示BFGF处理C2C12NC和C2C12LINCRAMOE细胞分化24，36小时后MYOGENIN和MHC绿色免疫荧光染色结果，DAPI染色红色定位细胞核；图8I显示MYOGENIN阳性细胞数量统计结果；图8J显示MHC阳性细。
41、胞数量统计结果。具体实施方式0029下面结合具体实施例详细说明本发明，这些实施例仅是用于阐明本发明而不以任何方式限制本发明。0030本发明所使用的LINCRAM由生物信息学分析得到，RTPCR检测LINCRAM的表达量。0031实施例1发现一个受MYOD调控并在骨骼肌细胞中特异表达的长链非编码RNA，命名为LINCRAM0032根据已经发表文章中的两套数据库，参见CAOY,YAOZ,SARKARD,LAWRENCEM,SANCHEZGJ,PARKERMH,MACQUARRIEKL,DAVISONJ,MORGANMT,RUZZOWL,GENTLEMANRC,TAPSCOTTSJGENOMEWID。
42、EMYODBINDINGINSKELETALMUSCLECELLSAPOTENTIALFORBROADCELLULARREPROGRAMMINGDEVCELL2010,18466274；TRAPNELLC,WILLIAMSBA,PERTEAG,MORTAZAVIA,KWANG,VANBARENMJ,SALZBERGSL,WOLDBJ,PACHTERLTRANSCRIPTASSEMBLYANDQUANTIFICATIONBYRNASEQREVEALSUNANNOTATEDTRANSCRIPTSANDISOFORMSWITCHINGDURINGCELLDIFFERENTIATION2010,285。
43、5115，利用生物信息学分析得到一系列受MYOD调控的LNCRNAS，RTPCR检测这些LNCRNAS在肌生成过程中的表达图谱，检测结果发现一个在骨骼肌中特异表达的LNCRNA2310015B20RIK，同时早期胚胎E115体节中也检测到其表达，2310015B20RIK位于小鼠10号染色体，介于CCDC6和SLC16A9两个编码蛋白基因之间，2310015B20RIK在核质中均有表达，且保守性较低，2310015B20RIK的表达量随着肌生成过程逐渐上调，命名为LINCRAM。0033通过NORTHERNBLOT检测LINCRAM在小鼠各组织中的分布；通过原位杂交检说明书CN10418992。
44、1A8/13页10测LINCRAM在胚胎期的表达情况。按照常规操作进行骨骼肌原代成肌细胞PRIMARYMYOBLASTS的分离与培养；提取C2C12细胞和骨骼肌组织中总RNA，RTPCR检测LINCRAM的表达量。0034结果如图1A至1E所示，LINCRAM在骨骼肌细胞中特异表达，小鼠胚胎115天检测LINCRAM表达。其表达量在骨骼肌发育，C2C12细胞分化以及原代成肌细胞中，随着肌生成过程逐渐上调。结果提示LINCRAM在肌细胞分化过程中发挥作用。0035MYOD在转录水平调节LINCRAM表达0036CHIPPCR检测MYOD在转录水平调节LINCRAM表达0037根据预测的MYOD在。
45、LINCRAM启动子区域的结合位点EBOX设计多组引物，RTPCR检测MYOD是否结合在LINCRAM的启动子区域。0038结果如图1F所示，MYOD在LINCRAM的启动子区域有结合位点，结果提示MYOD调节LINCRAM的表达。0039另外，本发明人将LINCRAM的启动子区域390BP80BP插入到PGL3BASIC载体，并将LINCRAM启动子区域的MYOD结合位点EBOX进行点突变87和88位碱基突变后插入到PGL3BASIC载体，荧光素酶报告基因实验结果如图1G表明MYOD通过结合在LINCRAM启动子区域的EBOX调节LINCRAM转录。异位转染MYOD高表达质粒的成纤维细胞中，。
46、MYOD诱导LINCRAM的表达如图1H。MYOD敲除的小鼠骨骼肌中LINCRAM的表达显著下调如图1I。以上所有结果显示MYOD调节LINCRAM的表达。0040检测LINCRAM在细胞中的分布0041根据核质分离试剂盒AMBION公司的步骤，分别提取细胞质和细胞核RNA，RTPCR检测LINCRAM在细胞中的分布。FISH技术进一步检测LINCRAM在细胞中的分布。0042结果如图1J和1K所示，LINCRAM在核质中均有表达，且细胞质中表达量多于细胞核。结果提示LINCRAM可能在细胞质和细胞核中发挥不同的作用。0043实施例2LINCRAM对骨骼肌干细胞系分化的作用0044构建LINC。
47、RAM高表达及敲低细胞系0045利用BLOCKITLENTIVIRALRNAIEXPRESSIONSYSTEMINVITROGEN构建SHLINCRAM敲低质粒，与病毒包装质粒PVSVG，0891共感染293T细胞，分别收集24小时和48小时上清，1100G离心35分钟去除细胞碎片，045UM滤器过滤，24000RPM/MIN离心24H，100ULPBS溶解病毒颗粒，感染C2C12购自ATCC细胞48小时后，杀稻瘟菌素INVITROGEN筛选得到LINCRAMSHLINCRAM敲抵细胞系。同样的方法得到CONTROL质粒对照组细胞系。0046将BLOCKITLENTIVIRALRNAIEXPR。
48、ESSIONSYSTEM中的PENTRTM/U6ENTRYCONSTRUCTPU6启动子表达区域置换为PEGFPN1的PCMV启动子表达区域，得到质粒命名为PVIRUS从香港科技大学邬振国老师处得到，将LINCRAM片段插入该质粒，与PLENTI6/BLOCKITDEST质粒重组后，包装病毒，感染C2C12细胞得到LINCRAM高表达LINCRAMOE的C2C12细胞系。0047REALTIMERTPCR检测LINCRAM表达0048结果如图2A和2E所示，LINCRAM在高表达和敲除的细胞系中分别被高表达和敲低，结果提示细胞系构建成功。说明书CN104189921A109/13页110049。
49、免疫荧光检测LINCRAM对C2C12细胞分化的影响0050分别将12104个LINCRAM高表达和敲低的C2C12细胞培养于12孔板中DMEM培养基，包含10胎牛血清，1青霉素，1链霉素，1谷氨酰胺，培养24H换分化培养基DMEM培养基，包含2马血清，1青霉素，1链霉素，1谷氨酰胺，60小时后收取细胞。0051结果如图2B、2C、2F、2G所示，分化60H时LINCRAM高表达组的MHC阳性的细胞数比对照组显著增加，而LINCRAM敲低组的MHC阳性的细胞数比对照组显著减少，结果提示LINCRAM显著促进C2C12细胞分化。MHC是C2C12细胞分化标记基因。0052WESTERNBLOT检测蛋白表达0053结果WESTERNBLOT结果显示如图2D、2H，分化60小时后，LINCRAM高表达组的MHC蛋白表达量比对照组显著增加，LINCRAM敲低组的MHC蛋白表达量比对照组显著减少。结果提示LINCRAM显著促进C2C12细胞分化。0054LINCRAM能够部分弥补由于MYOD敲低造成的C2C12细胞分化缺陷0055如实施例1所示BLOCKITLENTIVIRALRNAIEXPRESSIONSYSTEM，构建MYOD敲低的C2C12细胞系。MYOD敲低的C2C12细胞转染LINCRAM高表达质粒，检测细胞分化情况。0056结果REALTIM。