泡核桃壳提取物在制备抗肿瘤药物中的应用.pdf

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1、10申请公布号CN104208138A43申请公布日20141217CN104208138A21申请号201410524028522申请日20141008A61K36/52200601A61P35/00200601A61K131/0020060171申请人大理学院地址671003云南省大理白族自治州大理市古城弘圣路2号72发明人刘熙李春艳巫秀美于冬梅李冬梅李寅珊赵昱彭友伦54发明名称泡核桃壳提取物在制备抗肿瘤药物中的应用57摘要本发明“泡核桃壳提取物在制备抗肿瘤药物中的应用”涉及泡核桃壳提取物用于制备防治肿瘤疾病药物的用途。具体而言，本发明涉及泡核桃壳碱溶液浸泡提取得到的有效部位及其用于制备抗。

2、肿瘤药物的医药用途。本发明所指的泡核桃壳为胡桃科JUGLANDACEAE胡桃属JUGLANS植物泡核桃JUGLANSSIGILLATA的成熟果实壳，该有效部位提取物具有明显的抑制人肺癌细胞、人肝癌细胞活性，且对人正常肝细胞的毒性非常小，可以预期发展成为防治多种肿瘤的药物。51INTCL权利要求书1页说明书8页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书8页10申请公布号CN104208138ACN104208138A1/1页21一种泡核桃壳提取物用于制备防治肿瘤疾病的用途，其特征是泡核桃壳提取物由下列方法制备得到；A泡核桃壳晒干后粉碎，加氢氧化钠溶液至刚好浸没粉碎粗品，。

3、常温浸泡1024小时，过滤；再加入5001000毫升碱液，放置13小时，过滤，合并滤液；其中，氢氧化钠溶液的浓度为1摩尔/升，碱液是指浓度为1摩尔/升的氢氧化钠溶液；B在步骤A中的合并滤液中加入冰醋酸，放置052小时，过滤；滤液加入1倍量乙醇溶液，放置052小时，过滤；滤液再加入1倍量乙醇溶液，放置052小时，过滤；滤液继续加入3倍量乙醇溶液，放置052小时，过滤，得沉淀物DEF；或者，在步骤A中的合并滤液中加入冰醋酸，放置052小时，过滤；滤液加入1倍量乙醇溶液，放置052小时，过滤；滤液再加入1倍量乙醇溶液，放置052小时，过滤，得沉淀物D；其中，乙醇溶液的浓度为20100。C将沉淀物D或。

4、沉淀物DEF，置3050减压烘干13小时，即得。2根据权利要求1的用途，其特征是所述肿瘤疾病是指肺癌和/或肝癌。3根据权利要求1的用途，其特征是所述泡核桃壳是指胡桃科胡桃属植物泡核桃JUGLANSSIGILLATA的成熟果实壳。权利要求书CN104208138A1/8页3泡核桃壳提取物在制备抗肿瘤药物中的应用技术领域0001本发明涉及医药技术领域，具体而言，本发明涉及一种泡核桃壳提取物用于制备抗肿瘤药物的医药用途。该泡核桃壳提取物由泡核桃JUGLANSSIGILLATAD的果实壳以碱溶液浸泡提取、醇沉、溶剂回收、干燥而成，其具有细胞毒活性和抗肿瘤功能，可以预期发展成为防治肿瘤疾病的药物。背景技。

5、术0002近年来，随着生活水平的提高、生态环境的改变及生活压力增大，癌症已成上升趋势，其中肝癌和肺癌是我国常见的两大恶性肿瘤。肺癌，是最常见的肺原发性恶性肿瘤，绝大多数起源于支气管粘膜和细支气管肺泡，故又称支气管肺癌。肺癌是发病率和死亡率增长最快，对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。据统计，全世界每年约有140万人死于肺癌，而我国每年肺癌的发病人数约70万，排名恶性肿瘤发病率及死亡率首位。肺癌可分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌，其中非小细胞肺癌占80左右，其首选治疗方法是手术，但大多数患者确诊时已经是癌症晚期，失去治疗机会。另外，50以上患者尽管经过手术、放化疗等积极治疗，最终仍会出现局部复发。

6、或远端转移，并且其毒副作用大，患者难以承受。0003肝癌，多指原发性肝癌，是发生于肝脏的恶性肿瘤。肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一，是全球癌症的第三大死亡原因，其恶性度极高、进展迅速、预后差，严重危害人类生命和健康。我国是肝癌发病大国，发病人数占全球的55，每年约有13万人死于肝癌。肝脏只有表面包膜具有神经，癌细胞侵入包膜内才会引起痛感，而且肝脏只要剩下1/5仍可维持正常功能，因此肝脏破坏了80时，才会产生肝功能失调症状，故肝癌确诊时基本属于中晚期，而且肝脏的血液供应丰富，容易在器官内外作血源性转移，导致治疗上的困难。0004手术、放疗和化疗是治疗肺癌和肝癌的主要手段，但上述两类癌症患者在确诊时多。

7、数属于晚期，已经失去手术的最佳时机，并且放化疗在杀灭癌细胞的同时对患者机体也会造成损害，毒副反应大且预后较差，疗效不佳。因此寻找新型治疗肝、肺癌的药物，延长患者生存期、降低复发率、提高生命质量有重要的意义。而探寻一种副作用小、高效低毒的抗肿瘤药物则成为当前研究的热点。0005中药具有多靶点、多途径的协同作用，在癌症放化疗的减毒增效及术后防复发转移等方面独具优势。因此，从中草药中寻找高效低毒的抗癌药物具有极其重要的现实意义。云南漾濞泡核桃JUGLANSSIGILLATAD系胡桃科JUGLANDACEAE胡桃属JUGLANS植物的成熟果实，产于云南、贵州、四川西部、西藏雅鲁藏布江中下游；生于海拔1。

8、3003300米山坡或山谷林中。明代李时珍著本草纲目对核桃仁的药用价值概括是“温肺润肠、益命门、补气养血、治虚寒咳喘、润燥化痰、利三焦等”。现代药理研究发现，胡桃属植物所含化学成分的结构较多，并具有抗菌、心血管保护、清除氧自由基和镇痛等药理作用。随着科学技术的发展和人类生活水平的提高，人们对核桃资源的开发研究已不仅是以核桃仁为主，在核桃的树皮、果青皮、枝条、叶、花、坚果壳的应用研究上也取得了新的进展。然而，关说明书CN104208138A2/8页4于核桃的树皮等部位的应用研究还局限于工艺品制作、饲料、活性炭原料等方面。关于核桃的坚果壳在制备药物方面的应用研究除中国发明专利申请申请号200710。

9、0569968表明核桃壳的醇提取物具有一定的强心及改善心肌供血的活性外，其余方面的应用尚未见报道；且该技术方案仅涉及核桃壳的乙醇提取部位，对于核桃壳的其他提取物的制药用途也未见报道。0006发明人所在研究团队对核桃壳的系列研究中发现用碱溶液浸泡提取、醇沉核桃属植物的成熟果实壳，可以得到具有抗艾滋病毒活性的有效部位刘光明，李冬梅，李春艳等，国家发明专利ZL2010105213186。在发明人对天然产物抗肿瘤活性的系统研究中发现，以该专利公开的制备方法得到的两种有效部位具有明显的肿瘤细胞毒活性。我们采用了四株人体肿瘤细胞株人肺癌细胞NCIH292、人肺癌细胞NCIH661、人肝癌细胞HEPG2、人。

10、肝癌细胞HUH7和一株正常细胞株人肝细胞L02对各种核桃壳的粗粉、总提取物、碱溶液提取物的细胞生长抑制活性进行检测，寻找到具有细胞毒活性的抗肿瘤有效部位。实验结果显示本发明涉及的泡核桃壳提取物具有显著的抑制肺癌、肝癌细胞增殖的活性，可以预期发展为抗肿瘤药物。查新结果显示，以往均无以泡核桃壳提取物作为主药进行配制的抗肿瘤药物的相关报道，从而构成本发明。发明内容0007本发明的目的在于提供一种具有抗肿瘤细胞生长功能的泡核桃壳提取物，并公开了该提取物用于制备防治肿瘤疾病的药物的用途。0008具体而言，本发明中泡核桃壳具抑制肿瘤细胞增殖活性的有效部位提取物的制备方法如下用碱溶液浸泡提取经粉碎的泡核桃壳。

11、、醇沉、浓缩提取回收溶剂得到的有效部位经减压浓缩至无醇味、干燥得产品。0009本发明中的泡核桃壳是指胡桃科JUGLANDACEAE胡桃属JUGLANS植物泡核桃JUGLANSSIGILLATA的成熟果实壳。0010本发明所述的泡核桃壳提取物药物组合物是由核桃壳碱溶液提取物和药学上应用的各种制剂辅料，通过合理组合制成的用于医疗目的的制剂。0011经药效学研究证明，本发明的泡核桃壳提取物PHTKDEF、PHTKD对人肺癌细胞NCIH292、NCIH661、肝癌细胞HEPG2、HUH7均有增殖抑制作用P005，且随着浓度降低，抑制作用减弱，具有剂量效应关系。高浓度下，PHTKDEF、PHTKD对人肝。

12、正常细胞L02的存活率分别为7319、7191，其余浓度下对L02细胞无毒性作用。通过实验结果得出，泡核桃壳碱溶液提取物有抗肺癌、肝癌活性，且在高浓度下对正常人肝细胞毒性小。0012本发明的泡核桃壳具有细胞毒性的有效部位提取物或其混合物可以与现已上市的抗肿瘤药物如铂类药物顺铂DDP、喜树碱类药物伊立替康IRINATECAN，CPT11、长春花碱类药物失碳长春花碱VINOREBINE，NVB诺维本、脱氧胞昔类药物吉西他滨GEMCITABINE，GEMZAR，健择、足叶乙甙ETOPOSIDE、紫杉醇PACLITAXEL等联合使用，制备得到具有肿瘤生长抑制活性的细胞毒性组合物，可用于治疗肿瘤疾病。该。

13、类药物组合物可以采用注射剂、片剂、胶囊剂、气雾剂、栓剂、膜剂、滴丸剂、外用搽剂、软膏剂等剂型药物，还可以采用现代制药界所公知的控释或缓释剂型或纳米制剂。这些药物组合物可以用说明书CN104208138A3/8页5于治疗肿瘤疾病、延缓肿瘤恶化、延长肿瘤病人生存时间等用途。0013至今为止，以往文献中并未发现针对云南主产的泡核桃壳提取物进行针对人体细胞毒活性研究的报道，本针对性的研究尚属首次，其具有显著的抑制体外培养人体肿瘤细胞生长的活性也属于意想不到的结果，因而可以预期进一步开发成为治疗肿瘤疾病的药物或药物组合物。据此完成本发明。0014本发明的有益之处在于本发明中采用的“湿法提取工艺”也最大限。

14、度地保证了虫体内活性物质的原始天然状态，也是优点之一。本发明再一特点是该属蜘蛛生长繁殖能力旺盛，在云贵高原广泛分布，便于养殖，每头雌蛛每年可以孵育600800只子代，有利于成为稳定的生物药物资源，同时也有利于贫困山区农民街养殖此类药源性动物达到脱贫目的。具有潜在的巨大社会效益和经济效益。该药物原料来源于天然养殖，制备步骤简便，成本低，污染小，利于大规模生产。0015本发明的有益之处是泡核桃壳提取物具有强效抑制人肝癌细胞株HEPG2、HUH7和人肺癌细胞NCIH292、NCIH661生长的活性，显示该提取物可以预期应用于制备治疗新的抗肿瘤药物，对于开发新的创新型抗癌药物提供了新的物质基础。泡核桃。

15、树自然资源丰富，本发明提取物原料泡核桃壳资源丰富易得，提取工艺简单、成分及药效稳定，容易实现产业化。此外，对泡核桃壳的开发应用属于变废为宝，产业化的成本低廉，且有希望研发出一种对泡核桃种植业，尤其是边疆经济发展有重大推动作用的抗肿瘤新药。具体实施方案0016为了更好地理解本发明的实质，下面分别用泡核桃壳提取物对四株肿瘤细胞株和一株正常细胞株生长的抑制作用实验结果，说明其在抗肿瘤药物研究领域中的新用途。药理实施例给出了代表性化合物的部分活性数据。除非另有说明，本发明中的百分数是重量百分数。0017必须说明的是本发明的实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行的简单改。

16、进都属于本发明要求保护的范围。0018实施例1泡核桃壳提取物对人肺癌细胞NCIH292、NCIH661的细胞毒试验001911泡核桃壳提取物的制备0020泡核桃JUGLANSSIGILLATA采自云南省漾濞县，经大理学院生药教研室夏从龙教授鉴定为胡桃科JUGLANDACEAE胡桃属JUGLANS植物的成熟果实，取该果实壳晒干备用。0021111泡核桃壳提取物PHTKDEF的制备0022将晒干的泡核桃壳1千克粉碎，加800毫升的氢氧化钠溶液1摩尔/升，常温浸泡过夜，过滤。再加入700毫升的氢氧化钠溶液1摩尔/升，放置2小时，过滤，合并滤液。在滤液中加入冰醋酸至PH5，放置1小时，过滤。滤液加入1。

17、倍量乙醇95，放置1小时，过滤。滤液再加入1倍量乙醇95，放置1小时，过滤。滤液继续加入3倍量乙醇95，放置1小时，过滤，得沉淀物。将沉淀物置40减压，烘干2小时，得干品11克，即得产品PHTKDEF。0023112泡核桃壳提取物PHTKD的制备0024将晒干的泡核桃壳1千克粉碎，加800毫升的氢氧化钠溶液1摩尔/升，常温浸说明书CN104208138A4/8页6泡过夜，过滤。再加入700毫升的氢氧化钠溶液1摩尔/升，放置2小时，过滤，合并滤液。在滤液中加入冰醋酸至PH5，放置1小时，过滤。滤液加入1倍量乙醇95，放置1小时，过滤。滤液再加入1倍量乙醇95，放置1小时，过滤，得沉淀物。将沉淀物。

18、置40减压，烘干2小时，得干品21克，即得产品PHTKD。002512细胞毒性试验0026121仪器与材料00271仪器无菌操作台YJ1450型购自苏州安泰空气技术有限公司；倒置相差显微镜OLYMPUSIX7型；水套式CO2细胞培养箱购自美国THERMO公司；高压灭菌器ES315型购自日本TOMYKOGYO公司；连续波长酶标仪购自BIOTEK公司。00282材料泡核桃壳提取物PHTKDEF、PHTKD；DDP顺铂，粉针剂山东罗欣药业股份有限公司；DMEM培养基及胎牛血清FBS购自GIBCO公司；025胰蛋白酶购自THERMO公司；噻唑蓝MTT、HEPES和二甲基亚砜DMSO购自SIGMA公司；。

19、022M微孔滤膜购自MILLIPORE公司。00293细胞株人肺癌细胞NCIH292、人大细胞肺癌NCIH661，购自中国科学院昆明动物研究所细胞库。0030122方法00311细胞接种NCIH292、NCIH661细胞分别用含10灭活FBS的DMEM培养基在37、5二氧化碳培养箱中培养，取对数生长期的上述细胞，用025胰酶消化后，离心，弃去上清液，用完全培养基将细胞浓度调至1104个/毫升，接种于96孔板，每孔150微升，置于37、5二氧化碳培养箱中培养。00322PHTKDEF、PHTKD对NCIH292、NCIH661细胞增殖的抑制作用分别在每个实验孔中加入不同浓度的PHTKDEF、PH。

20、TKD样品溶液，每个浓度设3个复孔，同时设置阳性对照组DDP、阴性对照组和空白对照组。放入37，5二氧化碳培养箱中培养72小时后，弃去上清液，加入5毫克/毫升的MTT溶液，继续培养4小时后，分别加入DMSO溶液150微升/孔，待紫色结晶溶解后，在570NM波长检测各孔OD值，按下式计算抑制率。0033抑制率1001OD实验OD空白/OD阴性OD空白00343统计学处理实验数据均采用SPSS170统计软件进行处理，各组数据进行ANOVA或T检验。003513结果0036实验结果见表1。从表中可知与阴性对照组比较，PHTKDEF在2501000微克/毫升时，能有效抑制NCIH292和NCIH661。

21、细胞的增殖P001或005。随着PHTKDEF浓度的降低，对肺癌细胞的抑制作用也减弱，即抑制作用表现出浓度依赖性。在15631000微克/毫升时，PHTKD对NCIH292、NCIH661细胞增殖均有显著抑制作用P001或005，并呈剂量效应关系趋势。对NCIH292细胞，PHTKDEF和PHTKD的细胞生长抑制作用的起效浓度分别为625微克/毫升和098微克/毫升。结果表明，泡核桃壳提取物对肺癌细胞NCIH292、NCIH661具有显著细胞毒活性。0037表1泡核桃壳提取物对肺癌细胞NCIH292、NCIH661的增值抑制试验0038说明书CN104208138A5/8页700390040注。

22、与阴性对照组比较，P005，P001004114实验结论0042NCIH292和NCIH661细胞是测试活性物质对肿瘤细胞的细胞毒性的有效工具和评价指标。本实验表明泡核桃壳提取物对人肺癌细胞NCIH292、NCIH661具有有效抑制增殖的作用，即该提取物具有确切的细胞生长抑制活性，有可能经过进一步发掘优化而发展成为新的具有抗肿瘤作用的药物。0043实施例2泡核桃壳提取物对人肝癌细胞HEPG2、HUH7的细胞毒试验004421泡核桃壳提取物的制备0045同实施例11项下方法，制备得到泡核桃壳提取物PHTKDEF和PHTKD。004622细胞毒性试验0047221仪器与材料00481仪器同实施例1。

23、。00492材料同实施例100503细胞株人肝癌细胞HEPG2、HUH7，购自中国科学院昆明动物研究所细胞库。0051222方法00521细胞接种HEPG2、HUH7细胞分别用含10灭活FBS的DMEM培养基在说明书CN104208138A6/8页837、5二氧化碳培养箱中培养，取对数生长期的上述细胞，用025胰酶消化后，离心，弃去上清液，用完全培养基将细胞浓度调至1104个/毫升，接种于96孔板，每孔150微升，置于37、5二氧化碳培养箱中培养。00532PHTKDEF、PHTKD对HEPG2和HUH7细胞增殖的抑制作用分别在每个实验孔中加入不同浓度的PHTKDEF、PHTKD样品溶液，每个。

24、浓度设3个复孔，同时设置阳性对照组DDP、阴性对照组和空白对照组。放入37，5二氧化碳培养箱中培养72小时后，弃去上清液，加入5毫克/毫升的MTT溶液，继续培养4小时后，分别加入DMSO溶液150微升/孔，待紫色结晶溶解后，在570NM波长处检测各孔OD值，按下式计算抑制率。0054抑制率1001OD实验OD空白/OD阴性OD空白00553统计学处理同实施例1。005623结果0057实验结果见表2。从表中可知与阴性对照组比较，PHTKDEF在2501000微克/毫升时，能有效抑制HEPG2、HUH7细胞的增殖P001或005。随着PHTKDEF浓度的降低，对肝癌细胞的抑制作用也减弱，即抑制作。

25、用表现出浓度依赖性。在6251000微克/毫升时，PHTKD对HUH7细胞增殖有显著抑制作用P001或005，并呈剂量效应关系趋势；在1000微克/毫升浓度下，PHTKD能有效抑制HEPG2细胞的生长P001。结果表明，泡核桃壳提取物对肝癌细胞HEPG2、HUH7具有显著细胞毒活性。0058表2泡核桃壳提取物对肝癌细胞HEPG2、HUH7的增值抑制试验00590060说明书CN104208138A7/8页90061注与阴性对照组比较，P005，P001006224实验结论0063HEPG2和HUH7细胞株是测试活性物质对肿瘤细胞的细胞毒性的有效工具和评价指标。本实验表明泡核桃壳提取物对人肝癌细。

26、胞HEPG2、HUH7具有显著的生长抑制活性，即有确切的细胞毒活性，有可能经过进一步发掘优化而发展成为新的具有抗肿瘤作用的药物。0064实施例3泡核桃壳提取物对正常肝细胞L02的作用006531实验目的0066透过泡核桃壳提取物对正常肝细胞L02细胞株的生长作用，评价该提取物的毒性大小。006732泡核桃壳提取物的制备0068同实施例11项下方法，制备得到泡核桃壳提取物PHTKDEF和PHTKD。006933细胞毒性试验0070331仪器与材料00711仪器同实施例1。00722材料同实施例1。00733细胞株正常人肝细胞L02，购自中国科学院昆明动物研究所细胞库。0074332方法00751。

27、细胞接种L02细胞用含10灭活FBS的DMEM培养基在37、5二氧化碳培养箱中培养，取对数生长期的上述细胞，用025胰酶消化后，离心，弃去上清液，用完全培养基将细胞浓度调至1104个/毫升，接种于96孔板，每孔150微升，置于37、5二氧化碳培养箱中培养。00762泡核桃壳提取物PHTKDEF、PHTKD对L02细胞的作用加入浓度梯度PHTKDEF、PHTKD溶液，每个浓度设置3个复孔，同时设置阴性对照组和空白对照组。将96孔板置于37，5二氧化碳培养箱中培养72小时后，弃去上清液，每孔加入5毫克/毫升MTT，继续培养4小时后，再分别加入DMSO溶液150微升，待紫色结晶溶解后，波长570NM。

28、检测各孔OD值，按下式计算出存活率。0077存活率100OD实验OD空白/OD阴性OD空白00783统计学处理实验数据均采用SPSS170统计软件进行处理，各组数据进行ANOVA或T检验。007934结果0080实验结果见表3。从表3中结果可知与不同浓度梯度的PHTKDEF、PHTKD共同孵育72小时后，高浓度下1000微克/毫升，PHTKDEF、PHTKD对L02细胞的存活率分别为7319、7191；其余浓度梯度下，对L02细胞无杀灭作用。由实验结果可知泡核桃壳提取物对正常人肝细胞的毒性非常小。说明书CN104208138A8/8页100081表3泡核桃壳提取物对正常人肝细胞L02的作用00820083注与阴性对照组比较，P005，P001008435实验结论0085透过泡核桃壳提取物对NCIH292、NCIH661、HEPG2、HUH7、L02等细胞株的增殖作用的试验，可以得知泡核桃壳对肺癌、肝癌等肿瘤细胞具有显著的生长抑制活性，而对正常肝细胞的毒性非常小。因此，泡核桃壳提取物有可能经过进一步发掘优化而发展成为新的高效低毒的具有抗多种肿瘤作用的药物。0086在上述说明书阐述本发明时，同时提供了实施例的目的是举例说明本发明的实际操作过程和本发明的意义。在进入本发明权利要求和其等同物范围内时，本发明的实际应用包括所有一般变化、配合，或改进。说明书CN104208138A10。