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1、10申请公布号CN104186308A43申请公布日20141210CN104186308A21申请号201410429290122申请日20140828A01H1/06200601A01H4/0020060171申请人兰州大学地址730000甘肃省兰州市天水南路222号72发明人张吉宇霍雅馨段珍狄红艳骆凯吴凡74专利代理机构兰州振华专利代理有限责任公司62102代理人张真54发明名称抗草铵膦紫花苜蓿植株的培养基和土壤筛选方法57摘要本发明主要涉及抗草铵膦紫花苜蓿植株的筛选方法。具体涉及抗草铵膦种质筛选方法。一种抗草铵膦紫花苜蓿植株的培养基筛选方法，其主要特点在于包括如下步骤1MS培养基萌发种。
2、子；2剂量筛选；3甲基磺酸乙酯半致死剂量诱变紫花苜蓿种子；4抗草铵膦紫花苜蓿植株筛选；5抗性植株再次筛选。本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果本发明简便易行，见效快捷，在短期内可以获得抗除草剂紫花苜蓿的单株。本发明采用的是诱变手段。利用化学诱变剂EMS诱变紫花苜蓿种子产生点突变，通过培养基和土壤筛选两种途径筛选抗除草剂紫花苜蓿单株，不但为常规育种提供了新的种质资源，对其他植物的抗除草剂选育也提供了一定的参考。51INTCL权利要求书2页说明书11页附图3页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书11页附图3页10申请公布号CN104186308ACN104186。
3、308A1/2页21一种抗草铵膦紫花苜蓿植株的培养基筛选方法，其特征在于包括如下步骤1MS培养基萌发种子精选紫花苜蓿种子；配制MS培养基培养板备用；无菌条件下进行种子消毒60100酒精浸洗种子205MIN；2次氯酸钠溶液浸洗515MIN；DDH2O清洗种子310次；铺板，用镊子将消过毒的种子均匀铺于MS培养基上，封口膜封口后置于人工培养箱，2218，018H光照，246H黑暗发芽；胚根突破种皮视为萌发，第36天，平均发芽率达到50以上，待用；2剂量筛选草铵膦设置多个处理，浓度分别为0MG/L至15MG/L，配置以上不同浓度的草铵膦培养基，每个浓度多个重复，设与浓度相匹配的多个培养板；无菌条件下。
4、，将MS培养基中发芽的健康种子转入不同浓度草铵膦培养基，封口膜封口后置于1822人工培养箱培养，于培养箱中培养18天，18天后统计致死率，筛选出用于培养基筛选的草铵膦致死剂量为8MG/L；3甲基磺酸乙酯半致死剂量诱变紫花苜蓿种子紫花苜蓿种子用98浓硫酸处理310MIN先打破硬实，蒸馏水冲洗310次；种子在100MM，PH70的磷酸缓冲液中，于4下预浸种618H，用磷酸缓冲液配置浓度为0220V/V的甲基磺酸乙酯溶液，在室温黑暗条件下用甲基磺酸乙酯处理种子，处理时长1224H，置于低温摇床，120RPM/MIN，1822不断摇晃，再用自来水冲洗25H以去除残留的甲基磺酸乙酯，每2535MIN放置。
5、1020MIN；之后铺于干净的滤纸上将种子晾干待用；挑选诱变后饱满完好的种子，分装于离心管中；配制MS基本培养基培养板备用；在MS培养基萌发诱变后的种子，封口膜封口后置于人工培养箱，2218，018H光照，246H黑暗发芽；4抗草铵膦紫花苜蓿植株筛选配置添加了致死剂量8MG/L草铵膦的MS培养基培养板备用；无菌条件下，将步骤3中MS培养基萌发第36天的健康种子转入添加了致死剂量的草铵膦培养基中，封口膜封口后置于2218人工培养箱培养，于培养箱中培养1020D，每天观察统计，1020D后筛选出抗性植株；配置1/2MS培养基，将筛选出的存活植株转入1/2MS培养基中继续培养，每23天更换一次1/2。
6、MS培养基，待存活株长出复叶移栽到花盆继续生长；5抗性植株再次筛选将1/2MS培养基中长出一片复叶的幼苗移栽至土壤继续培养，待幼苗长至23叶期开始用80MG/L的草铵膦溶液进行喷施，每隔48D喷一次，喷施2次。2一种抗草铵膦紫花苜蓿植株的土壤筛选方法，其特征在于包括如下步骤1土壤萌发种子将挑选出的健康饱满的紫花苜蓿种子播种于花盆，盆栽土壤为草炭土与蛭石11比例混合，PH为87，植物生长室培养，2515，1418H光照，106H黑暗；每盆均匀撒播种子，覆土厚度约052CM，浇水200500ML后用保鲜膜覆盖，保鲜膜覆盖生长25天，出苗后揭掉保鲜膜；2剂量筛选草铵膦设置多个处理，浓度分别为0MG/。
7、L至120MG/L，配置以上不同浓度的草铵膦溶液权利要求书CN104186308A2/2页3装于喷壶；每个浓度多个重复；待幼苗长至第一复叶期，在生长至第1416天时，开始喷施除草剂；每隔48天喷施1次，连续1224D，喷施3次；喷施除草剂时一来一回扫过叶面算作一次，保证除草剂均匀撒施到叶面上，第3次喷施后的第7天统计致死率，筛选出用于土壤筛选的草铵膦致死剂量为80MG/L；3甲基磺酸乙酯半致死剂量诱变紫花苜蓿种子紫花苜蓿种子用98浓硫酸处理310MIN先打破硬实，蒸馏水冲洗310次；种子在100MM，PH70的磷酸缓冲液中，于4下预浸种618H，用磷酸缓冲液配置浓度为0220V/V的甲基磺酸乙。
8、酯溶液，在室温黑暗条件下用甲基磺酸乙酯处理种子，处理时长1224H，置于低温摇床，120RPM/MIN，1822不断摇晃，再用自来水冲洗25H以去除残留的甲基磺酸乙酯，每2535MIN放置1020MIN；之后铺于干净的滤纸上将种子晾干待用；挑选诱变后饱满完好的种子，分装于离心管中；将诱变后的紫花苜蓿种子均匀播种于土壤表面，覆土厚度约052CM，浇水200500ML后用保鲜膜覆盖，保鲜膜覆盖生长25天，出苗后揭掉保鲜膜；4抗草铵膦紫花苜蓿植株筛选待幼苗长至第一复叶期，剔除生长不一致的植株，用筛选出的草铵膦致死剂量开始喷施，每隔48天喷施1次，连续1224D，喷施3次；喷施草铵膦时一来一回扫过叶面。
9、算作一次，保证草铵膦均匀撒施到叶面上；3次喷施结束后的一周左右选取存活植株保活待用；5抗性植株再次筛选筛选出的可能具有草铵膦抗性的植株通过再次喷施草铵膦进行鉴定；盆中存活单株继续在土壤中生长，待幼苗长至23叶期开始用80MG/L的草铵膦溶液进行喷施，喷施草铵膦时一来一回扫过叶面算作一次；每隔48天喷一次，喷施2次。权利要求书CN104186308A1/11页4抗草铵膦紫花苜蓿植株的培养基和土壤筛选方法技术领域0001本发明主要涉及抗草铵膦紫花苜蓿植株的筛选方法。具体涉及抗草铵膦种质筛选方法。背景技术0002紫花苜蓿MEDICAGOSATIVAL具有优质、高产、饲用价值高粗蛋白含量21、适口性好。
10、、用途广泛等特点，被世界誉为“牧草之王”，有着很好的固氮、保肥、保持水土的作用，具有食用价值，产业化发展前景良好。而苜蓿地杂草种类繁多，双子叶杂草和单子叶杂草兼具，其中以双子叶杂草的危害最为严重。杂草与苜蓿争夺阳光、水分、养分和空间，还会将病虫害传播给苜蓿，对苜蓿品质和产量造成了严重的不良影响，联合国粮农组织近年来的统计数据表明，全世界每年由草害造成的作物减产率平均达97，减产值高达204亿美元张殿京和陈仁霖，1992。人工除草成本又高，这为除草剂的研发开拓了市场，草铵膦为灭生性除草剂，但灭生性除草剂在杀死杂草的同时也伤害了苜蓿，选育并发展抗除草剂作物势在必行，这远比研制新型除草剂更加经济实惠。
11、，可节省20到100倍的成本，所以获得抗草铵膦苜蓿品种显得尤为重要。0003对除草剂抗性的研究，早期是直接从自然界中筛选抗除草剂作物，接着是采用传统杂交育种手段将具有抗性的基因转入目标作物中，随后是细胞培养、突变等方法，当前获取抗除草剂作物的技术主要分为转基因、非转基因两大类。在外源基因的不可预知性渐渐变为转基因作物发展的阻碍时，非转基因抗除草剂作物的发展愈来愈受重视，诱变育种为其中一种手段。目前，通过非转基因手段培育的抗除草剂作物有玉米、大豆、菜豆和烟草等20余种，抗除草剂种类包括ALS类如咪唑啉酮类、磺酰脲类、ACCASE类如环己烯二酮类、草甘膦类、草铵膦类和合成生长素类等。然而目前鲜有抗。
12、除草剂牧草的相关报道。因此，筛选抗草铵膦除草剂的紫花苜蓿对于我国牧草产业发展具有十分重要意义。然而，在本发明申请之前，国内还没有公开或发表过抗草铵膦紫花苜蓿植株的筛选方法。发明内容0004本发明的目的是避免现有技术的不足，提出一种抗草铵膦紫花苜蓿植株的培养基筛选方法。0005本发明的又一目的提出一种抗草铵膦紫花苜蓿植株的土壤筛选方法。0006为实现上述目的，本发明采取的技术方案为一种抗草铵膦紫花苜蓿植株的培养基筛选方法，其主要特点在于包括如下步骤00071MS培养基萌发种子0008精选紫花苜蓿种子；配制MS培养基培养板备用；无菌条件下进行种子消毒60100酒精浸洗种子205MIN；2次氯酸钠溶。
13、液浸洗515MIN；DDH2O清洗种子310次；铺板，用镊子将消过毒的种子均匀铺于MS培养基上，封口膜封口后置于人工培养箱，2218，018H光照，246H黑暗发芽；胚根突破种皮视为萌发，第36天，平均发芽率达到说明书CN104186308A2/11页550以上，待用；00092剂量筛选0010草铵膦设置多个处理，浓度分别为0MG/L至15MG/L，配置以上不同浓度的草铵膦培养基，每个浓度3个重复，设与浓度相匹配的多个培养板；0011无菌条件下，将MS培养基中发芽的健康种子转入不同浓度草铵膦培养基，封口膜封口后置于2218人工培养箱培养，于培养箱中培养18天，18天后统计致死率，筛选出用于培养。
14、基筛选的草铵膦致死剂量为8MG/L；00123甲基磺酸乙酯半致死剂量诱变紫花苜蓿种子0013紫花苜蓿种子用98浓硫酸处理310MIN先打破硬实，蒸馏水冲洗310次；种子在磷酸缓冲液100MM，PH70，于4下预浸种618H，用磷酸缓冲液配置浓度为0220V/V的甲基磺酸乙酯EMS溶液，在室温黑暗条件下用EMS处理种子，处理时长1224H，置于低温摇床，120RPM/MIN，1822不断摇晃，再用自来水冲洗25H以去除残留的EMS，每2535MIN放置1020MIN；之后铺于干净的滤纸上将种子晾干待用；挑选诱变后饱满完好的紫花苜蓿种子，分装于离心管中；配制MS基本培养基培养板备用；在MS培养基萌。
15、发诱变后的种子，封口膜封口后置于人工培养箱，2218，018H光照，246H黑暗发芽；00144抗草铵膦紫花苜蓿植株筛选0015配置添加了致死剂量8MG/L草铵膦的MS培养基培养板备用；无菌条件下，将步骤3中MS培养基萌发第36天的健康种子转入添加了致死剂量的草铵膦培养基中，封口膜封口后置于1822人工培养箱培养，于培养箱中培养1020D，每天观察统计，1020D后筛选出抗性植株；0016配置1/2MS培养基，将筛选出的存活植株转入1/2MS培养基中继续培养，每23天更换一次1/2MS培养基，待存活株长出复叶移栽到花盆继续生长；00175抗性植株再次筛选0018将1/2MS培养基中长出一片复叶。
16、的幼苗移栽至土壤继续培养，待幼苗长至23叶期开始用80MG/L的草铵膦溶液进行喷施，每隔48D喷一次，喷施2次。0019一种抗草铵膦紫花苜蓿植株的土壤筛选方法，其主要特点在于包括如下步骤00201土壤萌发种子0021将挑选出的健康饱满的紫花苜蓿种子播种于花盆，盆栽土壤为草炭土与蛭石11比例混合，PH为87，植物生长室培养，2515，1418H光照，106H黑暗；每盆均匀撒播种子，覆土厚度约052CM，浇水200500ML后用保鲜膜覆盖，保鲜膜覆盖生长25天，出苗后揭掉保鲜膜；00222剂量筛选0023草铵膦设置多个处理，浓度分别为0MG/L至120MG/L，配置以上不同浓度的草铵膦溶液装于喷壶。
17、；每个浓度多个重复；0024待幼苗长至第一复叶期，在生长至第1416天时，开始喷施除草剂；每隔48天喷施1次，连续1224D，喷施3次；喷施除草剂时一来一回扫过叶面算作一次，保证除草剂均匀撒施到叶面上，第3次喷施后的第7天统计致死率，筛选出用于土壤筛选的草铵膦致死剂量为80MG/L；00253甲基磺酸乙酯半致死剂量诱变紫花苜蓿种子说明书CN104186308A3/11页60026紫花苜蓿种子用98浓硫酸处理310MIN先打破硬实，蒸馏水冲洗310次；种子在磷酸缓冲液中，100MM，PH70，于4下预浸种618H，用磷酸缓冲液配置浓度为0220V/V的甲基磺酸乙酯EMS溶液，在室温黑暗条件下用E。
18、MS处理种子，处理时长1224H，置于低温摇床，120RPM/MIN，1822不断摇晃，再用自来水冲洗25H以去除残留的EMS，每2535MIN放置1020MIN；之后铺于干净的滤纸上将种子晾干待用；挑选诱变后饱满完好的种子，分装于离心管中；将诱变后的紫花苜蓿种子均匀播种于土壤表面，覆土厚度约052CM，浇水200500ML后用保鲜膜覆盖，保鲜膜覆盖生长25天，出苗后揭掉保鲜膜；00274抗草铵膦紫花苜蓿植株筛选0028待幼苗长至第一复叶期，剔除生长不一致的植株，用筛选出的草铵膦的致死剂量开始喷施，每隔48天喷施1次，连续1224D，喷施3次；喷施草铵膦时一来一回扫过叶面算作一次，保证草铵膦均。
19、匀撒施到叶面上；3次喷施结束后的一周左右选取存活植株保活待用；00295抗性植株再次筛选0030筛选出的可能具有草铵膦抗性的植株通过再次喷施草铵膦进行鉴定。盆中存活单株继续在土壤中生长，待苜蓿长至23叶期开始用80MG/L的草铵膦溶液进行喷施，喷施草铵膦时一来一回扫过叶面算作一次；每隔48天喷一次，喷施2次。0031本发明一是将EMS诱变后的紫花苜蓿种子在MS培养基上萌发，然后在附加最佳筛选剂量的草铵膦培养基上进行筛选，对筛选存活的幼苗进行恢复培养，之后转入1/2MS培养基上分化成苗，小苗生根长大后移栽，检测其抗草铵膦的效能；二是将EMS诱变后的种子在土壤中萌发，然后用最佳筛选剂量的草铵膦对幼。
20、苗进行喷施，保留存活幼苗恢复培养。0032本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果本发明简便易行，见效快捷，在短期内可以获得抗除草剂紫花苜蓿的单株。本发明采用的是诱变手段。利用化学诱变剂EMS诱变紫花苜蓿种子产生点突变，通过培养基和土壤筛选两种途径筛选抗除草剂紫花苜蓿单株，不但为常规育种提供了新的种质资源，对其他植物的抗除草剂选育也提供了一定的参考。附图说明0033图1不同浓度草铵膦下紫花苜蓿单株生长情况10D；0034图中从左至右为紫花苜蓿种子在0、1、2、3、5、8、10、12、15MG/L草铵膦培养基中培养10D的单株生长状况；0035图2不同浓度草铵膦下紫花苜蓿在MS培养基的生长情况1。
21、0D；0036图中从左至右为紫花苜蓿种子在0、1、2、3、5、8、10、12、15MG/L草铵膦培养基中培养10D的生长状况；0037图3草铵膦培养基中不同天数紫花苜蓿的生长情况；0038图中从左至右为紫花苜蓿幼苗在8MG/L草铵膦培养基中生长0、6、8、10、12、15、18D的状况；0039图4培养基中筛选出的抗性植株与非抗性植株对比；0040图中左1为培养基中非抗性单株生长状况，26株为培养基中筛选出来的抗性植说明书CN104186308A4/11页7株生长状况；0041图5不同浓度草铵膦下紫花苜蓿在土壤中的生长情况出苗20D；0042图中左为对照，右两列为紫花苜蓿品种在喷施10、30、。
22、50、80、100、120MG/L草铵膦后的生长状况；0043图680MG/L草铵膦筛选后存活的抗性植株；0044图中最佳筛选剂量80MG/L草铵膦喷施筛选后盆中植株生长状况；0045图7土壤中筛选出的抗性植株与非抗性植株对比；0046图中左为盆中非抗性单株生长状况，右为盆中筛选出来的抗性植株生长状况；0047图8筛选获得的抗性植株生长情况；0048图中培养基和土壤两种筛选途径获得的抗性植株生长状况。具体实施方式0049以下结合实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。0050下述实施例与实验例中的MS培养基硝酸钾1900MG/L，硝酸铵1650M。
23、G/L，七水合硫酸镁370MG/L，二水合氯化钙440MG/L，磷酸二氢钾170MG/L，四水合硫酸锰223MG/L，七水合硫酸锌86MG/L，硼酸62MG/L,碘化钾083MG/L，二水合钼酸钠025MG/L，五水合硫酸铜0025MG/L，六水合氯化钴0025MG/L，肌醇100MG/L，甘氨酸20MG/L，盐酸吡哆醇05MG/L，盐酸硫胺素01MG/L，烟酸05MG/L，乙二胺四乙酸二钠373MG/L，七水合硫酸亚铁278MG/L，琼脂7G/L，蔗糖30G/L。00511/2MS培养基硝酸钾950MG/L，硝酸铵825MG/L，磷酸二氢钾85MG/L，七水合硫酸镁185MG/L，二水合氯化。
24、钙220MG/L，四水合硫酸锰223MG/L，七水合硫酸锌86MG/L，硼酸62MG/L,碘化钾083MG/L，二水合钼酸钠025MG/L，五水合硫酸铜0025MG/L，六水合氯化钴0025MG/L，肌醇100MG/L，甘氨酸20MG/L，盐酸吡哆醇05MG/L，盐酸硫胺素01MG/L，烟酸05MG/L，乙二胺四乙酸二钠373MG/L，七水合硫酸亚铁278MG/L，琼脂7G/L，蔗糖30G/L。0052实施例1一种抗草铵膦紫花苜蓿植株的培养基筛选方法，其特征在于包括如下步骤00531MS培养基萌发种子0054精选紫花苜蓿种子；配制MS培养板备用；无菌条件下进行种子消毒100酒精浸洗种子05MI。
25、N；2次氯酸钠溶液浸洗15MIN；DDH2O清洗种子10次；铺板，用镊子将消过毒的种子均匀铺于MS培养基上，封口膜封口后置于人工培养箱，22，18H光照，6H黑暗发芽；胚根突破种皮视为萌发，第6天，平均发芽率达到50以上，待用；00552剂量筛选0056草铵膦设置9个处理，浓度分别为0MG/L、1MG/L、2MG/L、3MG/L、5MG/L、8MG/L、10MG/L、12MG/L、15MG/L，配置以上不同浓度的草铵膦培养基，每个浓度3个重复，共27个培养板；0057无菌条件下，将MS培养基中发芽的健康种子转入不同浓度草铵膦培养基，封口膜封口后置于22人工培养箱培养，于培养箱中培养18天，18。
26、天后统计致死率，筛选出用于说明书CN104186308A5/11页8培养基筛选的草铵膦致死剂量为8MG/L；00583甲基磺酸乙酯半致死剂量诱变紫花苜蓿种子0059紫花苜蓿种子用浓硫酸98处理10MIN先打破硬实，蒸馏水冲洗10次；种子在磷酸缓冲液中100MM，PH70，于4下预浸种18H，用磷酸缓冲液配置浓度为20V/V的EMS甲基磺酸乙酯溶液，在室温黑暗条件下用EMS处理种子，处理时长24H，置于低温摇床，120RPM/MIN，22不断摇晃，再用自来水冲洗5H以去除残留的EMS，每35MIN放置20MIN；之后铺于干净的滤纸上将种子晾干待用；挑选诱变后饱满完好的种子，分装于离心管中；配制M。
27、S基本培养基培养板备用；在MS培养基萌发诱变后的种子，封口膜封口后置于人工培养箱，22，18H光照，6H黑暗发芽；00604抗草铵膦紫花苜蓿植株筛选0061配置添加了致死剂量8MG/L草铵膦的MS培养基培养板，备用；无菌条件下，将步骤3中MS培养基中发芽第6天的健康种子转入添加了致死剂量的草铵膦培养基中，封口膜封口后置于22人工培养箱培养，于培养箱中培养20D，每天观察统计，20D后筛选出抗性植株；0062配置1/2MS培养基，将筛选出的存活植株转入1/2MS培养基中继续培养，每3天更换一次1/2MS培养基，待存活株长出复叶移栽到花盆继续生长；00635抗性植株再次筛选0064将1/2MS培养。
28、基中长出一片复叶的幼苗移栽至土壤继续培养，待幼苗长至23叶期开始用80MG/L的草铵膦溶液进行喷施，每隔8D喷一次，喷施2次。0065实施例2一种抗草铵膦紫花苜蓿植株的培养基筛选方法，其特征在于包括如下步骤00661MS培养基萌发种子0067精选紫花苜蓿种子；配制MS培养基培养板备用；无菌条件下进行种子消毒75酒精浸洗种子1MIN；2次氯酸钠溶液浸洗10MIN；DDH2O清洗种子5次；铺板，用镊子将消过毒的种子均匀铺于MS培养基上，封口膜封口后置于人工培养箱，20，16H光照，8H黑暗发芽；胚根突破种皮视为萌发，第5天，平均发芽率达到50以上，待用；00682剂量筛选0069草铵膦设置9个处理。
29、，浓度分别为0MG/L、1MG/L、2MG/L、3MG/L、5MG/L、8MG/L、10MG/L、12MG/L、15MG/L，配置以上不同浓度的草铵膦培养基，每个浓度3个重复，共27个培养板；0070无菌条件下，将MS培养基中发芽的健康种子转入不同浓度草铵膦培养基，封口膜封口后置于20人工培养箱培养，于培养箱中培养18天，18天后统计致死率，筛选出用于培养基筛选的草铵膦致死剂量为8MG/L；00713甲基磺酸乙酯半致死剂量诱变紫花苜蓿种子0072紫花苜蓿种子用浓硫酸98处理5MIN先打破硬实，蒸馏水冲洗5次；种子在磷酸缓冲液中100MM，PH70，于4下预浸种12H，用磷酸缓冲液配置浓度为08。
30、V/V的EMS甲基磺酸乙酯溶液，在室温黑暗条件下用EMS处理种子，处理时长18H，置于低温摇床，120RPM/MIN，20不断摇晃，再用自来水冲洗4H以去除残留的EMS，每30MIN放置片刻；之后铺于干净的滤纸上将种子晾干待用；挑选诱变后饱满完好的种子，分装于离心管说明书CN104186308A6/11页9中；配制MS基本培养基培养板备用；在MS培养基萌发诱变后的种子，封口膜封口后置于人工培养箱，20，16H光照，8H黑暗发芽；00734抗草铵膦紫花苜蓿植株筛选0074配置添加了致死剂量8MG/L草铵膦的MS基本培养基培养板，备用；无菌条件下，将步骤3中MS培养基萌发第5天的健康种子转入添加了。
31、致死剂量的草铵膦培养基中，封口膜封口后置于20人工培养箱培养，于培养箱中培养18D，每天观察统计，18D后筛选出抗性植株；0075配置1/2MS培养基，将筛选出的存活植株转入1/2MS培养基中继续培养，每2天更换一次1/2MS培养基，待存活株长出复叶移栽到花盆继续生长；00765抗性植株再次筛选0077将1/2MS培养基中长出一片复叶的幼苗移栽至土壤继续培养，待幼苗长至23叶期开始用80MG/L的草铵膦溶液进行喷施，每隔6D喷一次，喷施2次。0078实施例3一种抗草铵膦紫花苜蓿植株的培养基筛选方法，其特征在于包括如下步骤00791MS培养基萌发种子0080精选紫花苜蓿种子；配制MS培养基培养板。
32、备用；无菌条件下进行种子消毒60酒精浸洗种子2MIN；2次氯酸钠溶液浸洗5MIN；DDH2O清洗种子3次；铺板，用镊子将消过毒的种子均匀铺于MS培养基上，封口膜封口后置于人工培养箱，18，0H光照，24H黑暗发芽；胚根突破种皮视为萌发，第3天，平均发芽率达到50以上，待用；00812剂量筛选0082草铵膦设置9个处理，浓度分别为0MG/L、1MG/L、2MG/L、3MG/L、5MG/L、8MG/L、10MG/L、12MG/L、15MG/L，配置以上不同浓度的草铵膦培养基，每个浓度3个重复，共27个培养板；0083无菌条件下，将MS培养基中发芽的健康种子转入不同浓度草铵膦培养基，封口膜封口后置于。
33、18人工培养箱培养，于培养箱中培养18天，18天后统计致死率，筛选出用于培养基筛选的草铵膦致死剂量为8MG/L；00843甲基磺酸乙酯半致死剂量诱变紫花苜蓿种子0085紫花苜蓿种子用浓硫酸98处理3MIN先打破硬实，蒸馏水冲洗3次；种子在磷酸缓冲液中100MM，PH70，于4下预浸种6H，用磷酸缓冲液配置浓度为02V/V的EMS甲基磺酸乙酯溶液，在室温黑暗条件下用EMS处理种子，处理时长12H，置于低温摇床，120RPM/MIN，18不断摇晃，再用自来水冲洗2H以去除残留的EMS，每25MIN放置10MIN；之后铺于干净的滤纸上将种子晾干待用；挑选诱变后饱满完好的种子，分装于离心管中；配制MS。
34、基本培养基培养板备用；在MS培养基萌发诱变后的种子，封口膜封口后置于人工培养箱，18，0H光照，24H黑暗发芽；00864抗草铵膦紫花苜蓿植株筛选0087配置添加了致死剂量8MG/L草铵膦的MS培养基培养板，备用；无菌条件下，将步骤3中MS培养基中发芽第3天的健康种子转入添加了致死剂量的草铵膦培养基中，封口膜封口后置于18人工培养箱培养，于培养箱中培养18D，每天观察统计，10D后筛选出抗性植株；说明书CN104186308A7/11页100088配置1/2MS培养基，将筛选出的存活植株转入1/2MS培养基中继续培养，每2天更换一次1/2MS培养基，待存活株长出复叶移栽到花盆继续生长；0089。
35、5抗性植株再次筛选0090将1/2MS培养基中长出一片复叶的幼苗移栽至土壤继续培养，待幼苗长至23叶期开始用80MG/L的草铵膦溶液进行喷施，每隔4D喷一次，喷施2次。0091实施例4一种抗草铵膦紫花苜蓿植株的土壤筛选方法，其特征在于包括如下步骤00921土壤萌发种子0093将挑选出的健康饱满的紫花苜蓿种子播种于花盆，盆栽土壤为草炭土与蛭石11比例混合，PH为87，植物生长室适宜条件培养，25，18H光照，6H黑暗。每盆均匀撒播种子，覆土厚度约2CM，浇水500ML后用保鲜膜覆盖，保鲜膜覆盖生长5天，出苗后揭掉保鲜膜；00942剂量筛选0095草铵膦设置7个处理，浓度分别为0MG/L、10MG。
36、/L、30MG/L、50MG/L、80MG/L、100MG/L、120MG/L，配置以上不同浓度的草铵膦溶液装于喷壶；每个浓度3个重复；0096待幼苗长至第一复叶期，在生长至第16天时，开始喷施除草剂；每隔8天喷施1次，连续24D，喷施3次；喷施除草剂时一来一回扫过叶面算作一次，保证除草剂均匀撒施到叶面上，第3次喷施后的第7天统计致死率，筛选出用于土壤筛选的草铵膦致死剂量为80MG/L；00973甲基磺酸乙酯半致死剂量诱变紫花苜蓿种子0098紫花苜蓿种子用浓硫酸98处理10MIN先打破硬实，蒸馏水冲洗10次；种子在磷酸缓冲液中100MM，PH70，于4下预浸种18H，用磷酸缓冲液配置浓度为20。
37、V/V的EMS甲基磺酸乙酯溶液，在室温黑暗条件下用EMS处理种子，处理时长24H，置于低温摇床，120RPM/MIN，22不断摇晃，再用自来水冲洗5H以去除残留的EMS，每35MIN放置20MIN；之后铺于干净的滤纸上将种子晾干待用；挑选诱变后饱满完好的种子，分装于离心管中；将诱变后的紫花苜蓿种子均匀播种于土壤表面，覆土厚度约2CM，浇水500ML后用保鲜膜覆盖，保鲜膜覆盖生长5天，出苗后揭掉保鲜膜；00994抗草铵膦紫花苜蓿植株筛选0100待幼苗长至第一复叶期，剔除生长不一致的植株，用筛选出的草铵膦的致死剂量开始喷施，每隔8天喷施1次，连续24D，喷施3次；喷施草铵膦时一来一回扫过叶面算作一。
38、次，保证草铵膦均匀撒施到叶面上；3次喷施结束后的一周左右选取存活植株保活待用；01015抗性植株再次筛选0102筛选出的可能具有草铵膦抗性的植株通过再次喷施草铵膦进行鉴定。盆中存活单株继续在土壤中生长，待苜蓿长至23叶期开始用80MG/L的草铵膦溶液进行喷施，喷施草铵膦时一来一回扫过叶面算作一次；每隔8天喷一次，喷施2次。0103实施例5一种抗草铵膦紫花苜蓿植株的土壤筛选方法，其特征在于包括如下步骤01041土壤萌发种子0105将挑选出的健康饱满的紫花苜蓿种子播种于花盆，盆栽土壤为草炭土与蛭石11说明书CN104186308A108/11页11比例混合，PH为87，植物生长室适宜条件培养20，。
39、16H光照，8H黑暗。每盆均匀撒播种子，覆土厚度约1CM，浇适量水200500ML后用保鲜膜覆盖，保鲜膜覆盖生长3天，出苗后揭掉保鲜膜；01062剂量筛选0107草铵膦设置7个处理，浓度分别为0MG/L、10MG/L、30MG/L、50MG/L、80MG/L、100MG/L、120MG/L，配置以上不同浓度的草铵膦溶液装于喷壶；每个浓度3个重复；0108待幼苗长至第一复叶期，在生长至第15天时，开始喷施除草剂；每隔6天喷施1次，连续18D，喷施3次；喷施除草剂时一来一回扫过叶面算作一次，保证除草剂均匀撒施到叶面上，第3次喷施后的第7天统计致死率，筛选出用于土壤筛选的草铵膦致死剂量为80MG/L。
40、；01093甲基磺酸乙酯半致死剂量诱变紫花苜蓿种子0110紫花苜蓿种子用浓硫酸98处理5MIN先打破硬实，蒸馏水冲洗5次；种子在磷酸缓冲液中100MM，PH70，于4下预浸种12H，用磷酸缓冲液配置浓度为08V/V的EMS甲基磺酸乙酯溶液，在室温黑暗条件下用EMS处理种子，处理时长18H，置于低温摇床，120RPM/MIN，20不断摇晃，再用自来水冲洗4H以去除残留的EMS，每30MIN放置片刻；之后铺于干净的滤纸上将种子晾干待用；挑选诱变后饱满完好的种子，分装于离心管中；将诱变后的紫花苜蓿种子均匀播种于土壤表面，覆土厚度约1CM，浇适量水200500ML后用保鲜膜覆盖，保鲜膜覆盖生长3天，出。
41、苗后揭掉保鲜膜；01114抗草铵膦紫花苜蓿植株筛选0112待幼苗长至第一复叶期，剔除生长不一致的植株，用筛选出的草铵膦致死剂量开始喷施，每隔6天喷施1次，连续18D，喷施3次；喷施草铵膦时一来一回扫过叶面算作一次，保证草铵膦均匀撒施到叶面上；3次喷施结束后的一周左右选取存活植株保活待用；01135抗性植株再次筛选0114筛选出的可能具有草铵膦抗性的植株通过再次喷施草铵膦进行鉴定。盆中存活单株继续在土壤中生长，待苜蓿长至23叶期开始用80MG/L的草铵膦溶液进行喷施，喷施草铵膦时一来一回扫过叶面算作一次；每隔6天喷一次，喷施2次。0115实施例6一种抗草铵膦紫花苜蓿植株的土壤筛选方法，其特征在于。
42、包括如下步骤01161土壤萌发种子0117将挑选出的健康饱满的紫花苜蓿种子播种于花盆，盆栽土壤为草炭土与蛭石11比例混合，PH为87，植物生长室适宜条件培养15，14H光照，10H黑暗。每盆均匀撒播种子，覆土厚度约05CM，浇水200ML后用保鲜膜覆盖，保鲜膜覆盖生长2天，出苗后揭掉保鲜膜；01182剂量筛选0119草铵膦设置7个处理，浓度分别为0MG/L、10MG/L、30MG/L、50MG/L、80MG/L、100MG/L、120MG/L，配置以上不同浓度的草铵膦溶液装于喷壶；每个浓度3个重复；0120待幼苗长至第一复叶期，在生长至第14天时，开始喷施除草剂；每隔4天喷施1次，连续12D，。
43、喷施3次；喷施除草剂时一来一回扫过叶面算作一次，保证除草剂均匀撒施到叶面上，第3次喷施后的第7天统计致死率，筛选出用于土壤筛选的草铵膦致死剂量为说明书CN104186308A119/11页1280MG/L；01213甲基磺酸乙酯半致死剂量诱变紫花苜蓿种子0122紫花苜蓿种子用浓硫酸98处理3MIN先打破硬实，蒸馏水冲洗3次；种子在磷酸缓冲液中100MM，PH70，于4下预浸种6H，用磷酸缓冲液配置浓度为02V/V的EMS甲基磺酸乙酯溶液，在室温黑暗条件下用EMS处理种子，处理时长12H，置于低温摇床，120RPM/MIN，18不断摇晃，再用自来水冲洗2H以去除残留的EMS，每25MIN放置10。
44、MIN；之后铺于干净的滤纸上将种子晾干待用；挑选诱变后饱满完好的种子，分装于离心管中；将诱变后的紫花苜蓿种子均匀播种于土壤表面，覆土厚度约05CM，浇水200ML后用保鲜膜覆盖，保鲜膜覆盖生长2天，出苗后揭掉保鲜膜；01234抗草铵膦紫花苜蓿植株筛选0124待幼苗长至第一复叶期，剔除生长不一致的植株，用筛选出的草铵膦的致死剂量开始喷施，每隔4天喷施1次，连续12D，喷施3次；喷施草铵膦时一来一回扫过叶面算作一次，保证草铵膦均匀撒施到叶面上；3次喷施结束后的一周左右选取存活植株保活待用；01255抗性植株再次筛选0126筛选出的可能具有草铵膦抗性的植株通过再次喷施草铵膦进行鉴定。盆中存活单株继续。
45、在土壤中生长，待苜蓿长至23叶期开始用80MG/L的草铵膦溶液进行喷施，喷施草铵膦时一来一回扫过叶面算作一次；每隔4天喷一次，喷施2次。0127实验例1一种抗草铵膦紫花苜蓿植株的培养基筛选方法01281、MS培养基萌发种子0129精选6000粒紫花苜蓿种子。配制60个MS培养板备用。无菌条件下进行种子消毒175酒精浸洗种子1MIN；22次氯酸钠溶液浸洗10MIN；3DDH2O清洗种子5次。铺板，用镊子将消过毒的种子均匀铺于MS培养基上，每皿100粒种子，共60皿，封口膜封口后置于人工培养箱20，16H光照，8H黑暗发芽。胚根突破种皮视为萌发，第5D，平均发芽率达到50以上，待用。01302、剂。
46、量筛选0131草铵膦设置9个处理，浓度分别为0MG/L、1MG/L、2MG/L、3MG/L、5MG/L、8MG/L、10MG/L、12MG/L、15MG/L，配置以上不同浓度的草铵膦培养基，每个浓度3个重复，共27个培养板。0132无菌条件下，将MS培养基中发芽的健康种子转入不同浓度草铵膦培养基，每皿放置50粒，封口膜封口后置于20人工培养箱培养，共计27皿。于培养箱中培养18D，18D后统计致死率，筛选出用于培养基筛选的草铵膦致死剂量为8MG/L。0133见图1和图2，从左至右为紫花苜蓿在不同浓度草铵膦培养基中培养10天的生长情况，随着草铵膦浓度的增加，幼苗死亡率逐渐增高，浓度达到8MG/L。
47、时，死亡率突增接近100，10MG/L以上浓度完全致死，致死作用明显，说明高浓度的草铵膦对植株造成了很大伤害。其中8MG/L是临界值，从8MG/L开始植株生长严重受到抑制，叶片完全枯黄萎蔫。01343、甲基磺酸乙酯半致死剂量诱变紫花苜蓿种子0135紫花苜蓿种子用浓硫酸98处理5MIN先打破硬实，蒸馏水冲洗5次。种子于4磷酸缓冲液中100MM，PH70预浸种12H。用磷酸缓冲液配置浓度为08V/V的EMS甲基磺酸乙酯溶液，在室温黑暗条件下用EMS处理种子，处理时长18H，置于低温摇说明书CN104186308A1210/11页13床120RPM/MIN，20不断摇晃，再用自来水冲洗4H以去除残留。
48、的EMS，每30MIN放置片刻。之后铺于干净的滤纸上将种子晾干待用。挑选诱变后饱满完好的紫花苜蓿种子10000粒，分装于100个15ML离心管中，每管100粒种子。配置MS培养基，高压灭菌后于无菌条件下分装于100个培养皿中备用。同样在MS培养基萌发诱变后的种子，每皿铺100粒，封口膜封口后置于人工培养箱20，16H光照，8H黑暗发芽。01364、抗草铵膦紫花苜蓿植株筛选0137配置添加了致死剂量8MG/L草铵膦的MS培养板100个，备用。无菌条件下，将步骤3中MS培养基中发芽第5D的健康种子转入添加了致死剂量的草铵膦培养基中，每皿50株，封口膜封口后置于20人工培养箱培养，共计100皿。于培。
49、养箱中培养18D，每天观察统计，18D后筛选出抗性植株。0138配置1/2MS培养基，将筛选出的存活植株转入1/2MS培养基中继续培养，每2D更换一次1/2MS培养基，待存活株长出复叶移栽到花盆继续生长。0139见图3，从左至右为诱变后的紫花苜蓿种子在8MG/L草铵膦培养基中生长不同天数的状况，致死数随着培养时间的增加而增加，但部分诱变株在筛选18D后表现出了一定的耐药性，并无完全致死。0140见图4，左1为培养基中非抗性紫花苜蓿生长状况，右26株为培养基中筛选出来的抗性植株生长状况，培养基中培养18天后的非抗性和抗性植株相比，长势明显较好，根系相对发达，生长速度较快；抗性植株多为两片子叶，少有真叶伸出，生长受到抑制。01415、抗性植株再次筛选0142将1/2MS培养基中长出一片复叶的紫花苜蓿移栽至土壤继续培养，待苜蓿长至23叶期开始用80MG/L的草铵膦溶液进行喷施，每隔6D喷一次，喷施两次。0143见图8，培养基和土壤两种筛选途径获得的抗性植株生长状况，抗性植株移栽至土壤再次筛选后，仍具有抗性。0144实验例2一种抗草铵膦紫花苜蓿植株的土壤筛选方法01451、土壤萌发0146将挑选出的健康饱。