枯草芽孢杆菌BACILLUSSUBTILIS菌株XI－55及其制备方法.pdf

本发明公开了一种枯草芽孢杆菌(Bacillu subtilis)菌株Xi－55(CGMCCNo.1070)及其制备方法，该菌株对水稻稻瘟病菌有良好的抑制效果，用于水稻稻瘟病的防治，具有无污染，无残留，无生态毒性和安全性好等优点；且其制备方法工艺简单、发酵周期短、投入低和易于保存等特点，易于工业化生产，便于尽快投入农业生产。

1、  一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株Xi-55，其保藏登记号为：CGMCC No.1070。

2、  一种制备权利要求1所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株Xi-55的方法为：
a、繁殖方法：将菌种接种于KB培养基的平皿中，置于25℃-31℃的生化培养箱内培养43-53h；
b、发酵方法：将繁殖好的菌种接种于灭菌的KB液体培养基中震荡培养，温度控制在28-30℃、转速为130r/min、发酵时间48-72h。

3、  根据权利要求2所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株Xi-55的制备方法，其特征在于：所述的KB液体培养基的灭菌方式为，100℃-140℃湿热灭菌20-40分钟。

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株Xi-55及其制备方法
所属技术领域
本发明涉及一种枯草芽孢杆菌菌株及其制备方法。
背景技术
为控制化学污染，保障食品安全，美国等欧美发达国家都把发展生态农业，减少化学农药使用、研究和开发生物农药，作为植物病虫害防治的主要发展方向。生物防治以其无污染，无残留，无生态毒性和安全性好等优点在病虫害综合防治体系中普遍被人们所接受和高度重视，其中微生物农药又在生防体系中起到主导作用。自90年代以来，全球生物农药的产量每年以10％-20％的速度递增。目前，全世界生物农药产品已经超过100多种，其中生物技术产品有10余种。在生物农药品种中，90％以上的是微生物杀虫剂，微生物杀菌剂相对较少，尤其对水稻稻瘟病病菌具有抑制作用的微生物杀菌剂很少，不宜获得，难于培养和制备。
发明内容
本发明地目的就是提供一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株Xi-55，该菌株对水稻稻瘟病菌有良好的抑制效果，用于水稻稻瘟病的防治，具有无污染，无残留，无生态毒性和安全性好等优点。
本发明的另一目的是提供上述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株Xi-55的制备方法。该制备方法的发酵工艺简单、发酵周期短、投入低和易于保存等特点，易于工业化生产，便于尽快投入农业生产。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)菌株Xi-55，其保藏登记号为：CGMCC No.1070。
该枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株Xi-55是通过对西昌市深层的原始土壤中的多种芽孢杆菌的分离、筛选、对峙法一系列试验获得。其具体分离方法为：取原始土10g，加水100ml，静置1h，分别将土壤液的浓度稀释至10^-5、10^-6、10^-7、10^-8，然后以之字型抹于灭菌的KB培养基表面，28-30℃温度下培养36-48h后，挑取单个菌落分别接种于KB培养基平板培养，待菌种繁殖足够量时，再对水稻稻瘟病菌与单菌落菌进行对峙法试验，经多次重复试验，获得对水稻稻瘟病菌有显著抑菌效果的获得一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株，命名为Xi-55。
本发明的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株Xi-55，其微生物学特性为：
镜检特性：Xi-55枯草芽孢杆菌的单细胞为杆状，长1.59-3.71μm，宽0.85μm。
KB固体培养基：接种菌落0.5cm，270C温箱培养5天，菌落平均直径2.2cm，菌落边缘不规则，边缘较中心厚，菌落颜色为淡黄色，不透明。
KB液体培养基：接种发酵48小时，发酵液为不透明的淡黄色液体，静止后有沉淀生成。
该菌株已于2003年12月08日在中国微生物菌种管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏登记号为：CGMCC No.1070。
一种制备上述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株Xi-55的方法为：
a、繁殖方法：将菌种接种于KB培养基的平皿中，置于28℃左右的生化培养箱内培养48h左右；
b、发酵方法：将繁殖好的菌种接种于灭菌的KB液体培养基中震荡培养，温度控制在28-30℃、转速为130r/min、发酵时间48-72h。
上述KB液体培养基的灭菌方式为100℃-140℃湿热灭菌20-40分钟。
采用上述方法制备该菌株Xi-55，其发酵后的孢子浓度约3.3～5.0×10⁸cfu/ml。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
该枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株Xi-55，经实验证实它对水稻稻瘟病菌有80％以上抑制效果，四年的田间试验证明，其防治水稻稻瘟病的效果平均达60％。同时室内实验还显示：该菌对其他多种植物病原菌也有一定的抑菌效果，经华西医科大学急性毒理(经皮、经口和致敏)实验还证明：该菌属于微毒(LD50＜5000mg/Kg)。故该菌株用于开发、生产防治水稻稻瘟病的微生物杀菌剂，具有防治效果好，无污染，无残留，无生态毒性和安全性好等优点。
该种制备方法的发酵工艺简单、发酵周期短、投入低和易于保存等特点，易于工业化生产，便于尽快投入农业生产。
下面结合实施例对本发明进一步说明。
具体实施方式：
实施例一
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株Xi-55是通过对西昌市深层的原始土壤中的多种芽孢杆菌的分离、筛选、对峙法一系列试验获得。其具体分离方法为：取原始土10g，加水100ml，静置1h，分别将土壤液的浓度稀释至10^-5、10^-6、10^-7、10^-8，然后以之字型抹于灭菌的KB培养基表面，28-30℃温度下培养36-48h后，挑取单个菌落分别接种于KB培养基平板培养，待菌种繁殖足够量时，再对水稻稻瘟病菌与单菌落菌进行对峙法试验，经多次重复试验，获得对水稻稻瘟病菌有显著抑菌效果的获得一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtikis)菌株，命名为Xi-55。
该菌株Xi-55菌种的保存方法：短期保存采用KB斜面培养基保存菌种。长期保存采用冻干培养法保存。
其制备方法为：
a、繁殖方法：将菌种接种于KB培养基的平皿中，置于25℃的生化培养箱内培养53h；
b、发酵方法：将繁殖好的菌种接种于灭菌的KB液体培养基中震荡培养，温度控制在28℃、转速为130r/min、发酵时间72h。
KB液体培养基的灭菌方式为，100℃湿热灭菌-40分钟。
实施例二
本例的制备方法为：
a、繁殖方法：将菌种接种于KB培养基的平皿中，置于31℃的生化培养箱内培养43h；
b、发酵方法：将繁殖好的菌种接种于灭菌的KB液体培养基中震荡培养，温度控制在30℃、转速为130r/min、发酵时间48h。
KB液体培养基的灭菌方式为，140℃湿热灭菌20分钟。
实施例三
本例的制备方法为：
a、繁殖方法：将菌种接种于KB培养基的平皿中，置于27℃的生化培养箱内培养53h；
b、发酵方法：将繁殖好的菌种接种于灭菌的KB液体培养基中震荡培养，温度控制在29℃、转速为130r/min、发酵时间50h。
KB液体培养基的灭菌方式为，100℃湿热灭菌20分钟。
实施例四
本例的制备方法为：
a、繁殖方法：将菌种接种于KB培养基的平皿中，置于30℃的生化培养箱内培养52h；
b、发酵方法：将繁殖好的菌种接种于灭菌的KB液体培养基中震荡培养，温度控制在30℃、转速为130r/min、发酵时间68h。
KB液体培养基的灭菌方式为，130℃湿热灭菌40分钟。
实施例五
本例的制备方法为：
a、繁殖方法：将菌种接种于KB培养基的平皿中，置于28℃的生化培养箱内培养48h；
b、发酵方法：将繁殖好的菌种接种于灭菌的KB液体培养基中震荡培养，温度控制在29℃、转速为130r/min、发酵时间60h。
KB液体培养基的灭菌方式为，125℃湿热灭菌35分钟。
采用本发明制备方法制备枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株Xi-55，其发酵后得到的孢子浓度3.3～5.0×10⁸cfu/ml。