零背景克隆载体及其制备方法和应用.pdf

《零背景克隆载体及其制备方法和应用.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《零背景克隆载体及其制备方法和应用.pdf（38页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。

1、10申请公布号CN104313044A43申请公布日20150128CN104313044A21申请号201410520443322申请日20140930C12N15/63200601C12N15/6620060171申请人天根生化科技（北京）有限公司地址100192北京市海淀区西小口路66号东升科技园（北领地）C7372发明人邹爱兰俞萍李晓晨孙克非74专利代理机构北京清亦华知识产权代理事务所普通合伙11201代理人李志东54发明名称零背景克隆载体及其制备方法和应用57摘要本发明公开了制备零背景克隆载体的方法及应用。其中，制备零背景克隆载体的方法，包括以下步骤提供SEQIDNO6所示的DNA片。

2、段；以PUC19质粒为模板，利用SEQIDNO78所示的引物进行第一PCR扩增，以便获得PUC19载体片段；将DNA片段与PUC19载体片段进行同源重组，以便获得载体骨架；将载体骨架转化感受态细胞并提取质粒，以便获得零背景克隆载体的前载体；以及采用ECORV酶对零背景克隆载体的前载体进行酶切，以便得到零背景克隆载体。该方法获得的载体可直接用于平末端产物的连接，载体自连的背景低，克隆的阳性率高，无需蓝白筛选，能在短时间内实现快速有效的克隆，克隆效率高，效果好。51INTCL权利要求书2页说明书17页序列表14页附图4页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书17页序列。

3、表14页附图4页10申请公布号CN104313044ACN104313044A1/2页21一种制备零背景克隆载体的方法，其特征在于，包括以下步骤提供SEQIDNO6所示的DNA片段；以PUC19质粒为模板，利用SEQIDNO78所示的引物进行第一PCR扩增，以便获得PUC19载体片段；将所述DNA片段与所述PUC19载体片段进行同源重组，以便获得载体骨架；将所述载体骨架转化感受态细胞并提取质粒，以便获得零背景克隆载体的前载体；以及采用ECORV酶对所述零背景克隆载体的前载体进行酶切，以便得到零背景克隆载体。2根据权利要求1所述的方法，其特征在于，通过以下步骤提供SEQIDNO6所示的DNA片段。

4、将SEQIDNO969所示的引物混合，以便获得引物混合物；对所述引物混合物进行第二PCR扩增，以便获得第二PCR扩增产物；以及利用SEQIDNO9和SEQIDNO69所示的引物，将所述第二PCR扩增产物进行第三PCR扩增，以便获得第三PCR扩增产物，所述第三PCR扩增产物即为SEQIDNO6所示的DNA片段，任选地，所述第二PCR扩增的反应体系为10微升50微摩尔的所述引物混合物、05微升高保真DNA聚合酶、10微升5X第二PCR反应混合液，双蒸水补足至50微升，任选地，所述第二PCR扩增的反应程序为953分钟；9430秒，55退火30秒，681分钟，循环25次；685分钟；冷却至室温，任选地。

5、，所述第三PCR扩增的反应体系为05微升50微摩尔SEQIDNO9所示的引物，05微升50微摩尔SEQIDNO69所示的引物，05微升高保真DNA聚合酶、10微升5X第三PCR反应混合液，1微升所述第二PCR扩增产物，双蒸水补足至50微升，任选地，所述第三PCR扩增的反应程序为953分钟；9430秒，55退火30秒，682分钟，循环30次；685分钟；冷却至室温。3根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一PCR扩增的反应体系为05微升10微摩尔SEQIDNO7所示的引物，05微升10微摩尔SEQIDNO8所示的引物，10纳克PUC19质粒，05微升高保真DNA聚合酶、10微升5X第一PC。

6、R反应混合液，双蒸水补足至50微升，任选地，所述第一PCR扩增的反应程序为953分钟；9430秒，55退火30秒，682分钟，循环30次；685分钟；冷却至室温。4根据权利要求1所述的方法，其特征在于，利用基因克隆试剂盒进行所述同源重组，任选地，所述同源重组的反应体系为10微升2X基因克隆反应混合液，5微升所述DNA片段、2微升所述PUC19载体片段，双蒸水补足至50微升，任选地，于室温下进行所述同源重组30分钟。5根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述感受态细胞为大肠杆菌感受态细胞DB31，任选地，于37下进行所述酶切24小时，任选地，所述酶切的反应体系为10微升10X酶切缓冲液，110。

7、微克所述零背景克隆载体的前载体、110微升10U/微升ECORV酶，双蒸水补足至100微升。权利要求书CN104313044A2/2页36根据权利要求1所述的方法，其特征在于，进一步包括将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，并回收纯化约3000碱基的大片段，所述大片段即为所述零背景克隆载体。7一种零背景克隆载体，其是通过权利要求16任一项所述的方法制备获得的。8权利要求7所述的零背景克隆载体在制备目的基因克隆载体中的用途。9根据权利要求8所述的用途，其特征在于，将目的基因片段与所述零背景克隆载体进行连接，然后转化、培养、筛选阳性克隆，以便获得目的基因克隆载体，任选地，利用快速连接缓冲液和T4DNA连接。

8、酶进行所述连接，任选地，所述快速连接缓冲液包含20200毫摩尔的三羟甲基氨基甲烷；550毫摩尔的氯化镁；0550毫摩尔的二硫苏糖醇；011毫摩尔的脱氧核糖核苷三磷酸；033毫摩尔的三磷酸腺苷；0510毫摩尔的盐酸亚精胺；以及501000毫克/毫升的小牛血清白蛋白。10一种制备目的基因克隆载体的方法，其特征在于，包括将目的基因片段与所述零背景克隆载体进行连接，然后转化、培养、筛选阳性克隆，以便获得目的基因克隆载体，任选地，利用快速连接缓冲液和T4DNA连接酶进行所述连接，任选地，所述快速连接缓冲液包含20200毫摩尔的三羟甲基氨基甲烷；550毫摩尔的氯化镁；0550毫摩尔的二硫苏糖醇；011毫摩。

9、尔的脱氧核糖核苷三磷酸；033毫摩尔的三磷酸腺苷；0510毫摩尔的盐酸亚精胺；以及501000毫克/毫升的小牛血清白蛋白，任选地，于室温下进行所述连接530分钟。权利要求书CN104313044A1/17页4零背景克隆载体及其制备方法和应用技术领域0001本发明涉及生物工程技术领域，具体地，涉及零背景克隆载体及其制备方法和应用，更具体地，本发明涉及制备零背景克隆载体的方法、零背景克隆载体及其在制备目的基因克隆载体中的用途，以及制备目的基因克隆载体的方法。背景技术0002现阶段的遗传工程涉及大量的基因克隆技术，将基因片段插入到克隆载体中，方便长期保存基因以及下游的分子生物学操作。市场上常见的克隆。

10、载体比如带胸腺嘧啶T突出末端的载体以下简称T载体大多是应用半乳糖苷酶基因进行蓝白斑筛选，劣势在于蓝白斑比例较高，且白斑中也存在假阳性的情况，每个平板上涂上5溴4氯3吲哚D半乳糖苷以下简称XGAL及异丙基硫代D半乳糖苷以下简称IPTG的步骤也比较繁琐。T载体只能直接连接末端带有腺嘌呤碱基A尾的脱氧核糖核酸以下简称DNA片段，TAQ酶等类似的聚合酶的保真度不如高保真酶，扩增出的片段存在错配的风险。当插入片段大于3千碱基时候，克隆效率非常低下。0003而除了T载体之外，目前也有一些有关含毒性基因的零背景载体的报道，这种新型的零背景平端克隆载体可以避免一些常见载体的缺点。但是，利用毒性基因构建载体时，。

11、为了扩繁质粒载体，一般采用阻断序列将毒性基因的阅读框破坏使基因不能表达，从而有可能导致存在微量未酶切干净的质粒的干扰，对载体的质量有一定影响。0004因而，现阶段急需一种能够有效解决上述问题的零背景平端克隆载体。发明内容0005本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种能够直接用于平末端产物的连接，降低载体自连的背景，提高克隆的阳性率，并能够在短时间内实现快速有效的克隆的零背景克隆载体。0006首先，需要说明的是，本发明是基于发明人的下列发现而完成的0007核糖核酸酶基因氨基酸序列如SEQIDNO；1所示，核苷酸序列如SEQIDNO2所示，来源于解淀粉芽。

12、孢杆菌BACILLUSAMYLOLIQUEFACIENS，编码一种核糖核酸酶，可以降解核糖核酸以下简称RNA，在没有其抑制蛋白时对细胞来说是致死的。例如，在基因克隆载体中常用的复制子能够在大肠杆菌中高效的复制，每个细胞中拷贝达到200300个，但是，在乳糖启动子以下简称LAC启动子、乳糖和色氨酸的杂合启动子以下简称TAC启动子，以及突变的乳糖启动子形式以下简称LACUV5启动子等启动子驱动下，核糖核酸酶基因可以大量表达，将杀死大肠杆菌细胞，因此，核糖核酸酶对普通的大肠杆菌来说都是致死的。并且，利用组织特异性表达的启动子能够有效驱动核糖核酸酶基因在宿主的该组织中特异表达。0008细胞致死毒性CO。

13、NTROLOFCELLDEATH，以下简称CCDB基因表达一种毒性蛋白，在缺乏抗毒素的情况下，干扰大肠杆菌DNA促旋酶的一种蛋白，从而抑制普通大肠杆菌的说明书CN104313044A2/17页5生长，杀伤宿主细胞。而DB31的大肠杆菌可以耐受含有CCDB基因的质粒繁殖，方便质粒的提取。利用DB31的大肠杆菌来繁殖载体，通过增加核糖体结合位点序列，让CCDB基因在DB31菌株中高量表达，可以降低未酶切干净载体转化造成的背景。0009发明人发现，采用双毒基因的构建策略构建零背景克隆载体采用CCDB毒性基因作为零背景载体的间隔序列，即通过CCDB基因的序列阻断破坏核糖核酸酶基因内含多克隆位点的阅读框。

14、，一方面可以使核糖核酸酶基因保留在载体上但不表达，当切去CCDB基因即可得到目的载体，核糖核酸酶基因就可以表达，而插入外源片段后又破坏了核糖核酸酶基因的阅读框引起蛋白失活，从而达到零背景克隆的效果；另一方面，在载体酶切时，常常会有极少量的比如变性超螺旋的质粒酶切不完全，而通过引入CCDB基因，完整的未酶切完全的质粒将不能表达，这可以保证载体的质量。含有核糖核酸酶基因完整阅读框的零背景克隆载体可以在自身环化后杀死大肠杆菌细胞，只有成功连接外源基因的载体才可以在平板上长出菌落。这种阳性筛选策略无需蓝白筛选，能够大大加速克隆筛选进程。0010目前，尚未有使用编码核糖核酸酶的基因来构建零背景载体进行平。

15、端克隆的报道。0011因而，根据本发明的一个方面，本发明提供了一种制备零背景克隆载体的方法。根据本发明的实施例，该方法包括以下步骤提供SEQIDNO6所示的DNA片段；以PUC19质粒为模板，利用SEQIDNO78所示的引物进行第一PCR扩增，以便获得PUC19载体片段；将所述DNA片段与所述PUC19载体片段进行同源重组，以便获得载体骨架；将所述载体骨架转化感受态细胞并提取质粒，以便获得零背景克隆载体的前载体；以及采用ECORV酶对所述零背景克隆载体的前载体进行酶切，以便得到零背景克隆载体。0012发明人惊奇的发现，通过该方法获得的零背景克隆载体能够直接用于平末端产物即目的基因片段的连接，载。

16、体自连的背景低，克隆的阳性率高，无需蓝白筛选，即能够在短时间内实现快速有效的克隆，克隆效率高，效果好，进而能够有效用于目的载体的构建。0013根据本发明的另一方面，本发明还提供了一种零背景克隆载体。根据本发明的实施例，该零背景克隆载体是通过前面所述的制备零背景克隆载体的方法制备获得的。发明人惊奇地发现，该零背景克隆载体相对于普通的T载体性能优越，可直接用于平末端产物即目的基因片段的连接，载体自连的背景低，克隆的阳性率高，无需蓝白筛选，能够在短时间内实现快速有效的克隆，克隆效率高，效果好，进而能够有效用于目的载体的构建。0014根据本发明的又一方面，前述的零背景克隆载体在制备目的基因克隆载体中的。

17、用途。根据本发明的实施例，该零背景克隆载体可以高效连接不同长度的目的基因片段，尤其适于大片段的目的基因的连接，并且连接效率以及阳性率非常高，连接产物可直接转化常用的大肠杆菌菌株，因而，能够直接用于制备目的基因克隆载体。具体地，将目的基因片段有效连接至零背景载体上，即可获得目的基因克隆载体，经测序验证后，可以直接用于序列分析以及基因序列的保存，或者通过亚克隆的方法将该目的基因克隆载体中的目的基因转移到合适的表达载体上，构建目的基因表达载体，以便用于蛋白表达或转基因研究。0015根据本发明的再一方面，本发明提供了一种制备目的基因克隆载体的方法。根据本发明的实施例，该方法包括将目的基因片段与零背景克。

18、隆载体进行连接，然后转化、培养、筛选阳性克隆，以便获得目的基因克隆载体。发明人惊奇地发现，利用该方法可以通过前述的零背景克隆载体高效连接任何具有平末端或粘性末端的不同长度的目的基因片段，说明书CN104313044A3/17页6尤其适于大片段目的基因片段的连接，并且连接效率以及阳性率非常高，连接产物可直接转化常用的大肠杆菌菌株，从而能够有效制备获得目的基因克隆载体。进一步，该目的基因克隆载体，经测序验证后，可以直接用于序列分析以及基因序列的保存，或者通过亚克隆的方法将该目的基因克隆载体中的目的基因转移到合适的表达载体上，构建目的基因表达载体，以便用于蛋白表达或转基因研究。0016本发明的附加方。

19、面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。附图说明0017本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中0018图1显示了根据本发明一个实施例的制备零背景克隆载体的方法的流程示意图；0019图2显示了根据本发明的一个实施例，零背景克隆载体的前载体的载体图谱；0020图3显示了根据本发明的一个实施例，零背景克隆载体的前载体经ECORV酶切后的电泳图；0021图4显示了根据本发明的一个实施例，零背景克隆载体连接700BP平末端片段后的菌落PCR电泳检测结果；0022图5显示了根据本发明的一个实施例，零背景克。

20、隆载体连接700BP粘末端片段后的菌落PCR电泳检测结果；0023图6显示了根据本发明的一个实施例，零背景克隆载体连接2000碱基平末端片段后的菌落PCR电泳检测结果；0024图7显示了根据本发明的一个实施例，零背景克隆载体连接8000碱基平末端片段后的菌落PCR电泳检测结果。具体实施方式0025下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。0026需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个。

21、该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。0027根据本发明的一个方面，本发明提供了一种制备零背景克隆载体的方法。参考图1，根据本发明的实施例，该方法包括以下步骤0028S100提供SEQIDNO6所示的DNA片段0029提供SEQIDNO6所示的DNA片段，该DNA片段包括LACUV5启动子SEQIDNO4驱动的核糖核酸酶基因以及CCDB基因SEQIDNO5的间隔序列，其中，SEQIDNO6序列具体如下0030TTCCCGACTGGAAAGCAATTGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTC600031ATTAGG。

22、CACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGA120说明书CN104313044A4/17页70032GCGGATAACAATTTCACACAGGAGGTTTAAACTTTAAAATGGCTCAGGTTATCAACACCT1800033TCGACGGTGTTGCTGACTACCTGCAGACCTACCACAAACTGCCGGACAACTACATCACCA2400034AATCTGAAGCTCAGGCTCTGGGTTGGGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTAT3000035GCCCATGCTTACGCCAA。

23、GATTTAGGTGACACTATAGAATACTCAAGCTATGCATCCAACG3600036CGTTGGGAGCTCTCCCATATGGTCGACCTGCAGGCGGCCGCGAATTCACTAGGATATCTA4200037AGGAGATTTACATGCAGTTCAAGGTTTACACCTATAAAAGAGAGAGCCGCTATCGCCTGT4800038TTGTGGATGTACAGAGTGATATTATTGACACGCCCGGGCGACGGATGGTGATCCCCCTGG5400039CCAGTGCACGTCTGCTGTCAGATAAAGTCTCCCGTGAACTTTACCCGGT。

24、GGTGCATATCG6000040GGGATGAAAGCTGGCGCATGATGACCACCCAGATGGTCAGTGTGCCGGTCTCCGTCATCG6600041GAGAAGAAGTGGCTGATCTCAGCCACCGCGAAAATGACATCAAAAACGCCATTAATCTGA7200042TGTTCTGGGGAATATAAAGCGGCCGATATCGAATTCCCGCGGCCGCCATGGCGGCCGGGA7800043GCATGCGACGTCGGGCCCAATTCGCCCTATAGTGAGTCGTATTACAATTCACTGGCCGTC8400044GTTTTACAACGTCG。

25、TGACTGGGAAAACCCTGGCGGCTTCTAAAGGTAACCTGGCTGACGT9000045TGCTCCGGGTAAATCTATCGGTGGTGACATCTTCTCTAACCGTGAAGGTAAACTGCCGGG9600046TAAATCTGGTCGTACCTGGCGTGAAGCTGACATCAACTACACCTCTGGTTTCCGTAACTC10200047TGACCGTATCCTGTACTCTTCTGACTGGCTGATCTACAAAACCACCGACCACTACCAGAC10800048CTTCACCAAAATCCGTTAAGGCCTCGTGATACGCCTATT11190。

26、049根据本发明的实施例，通过以下步骤提供SEQIDNO6所示的DNA片段0050首先，将SEQIDNO969所示的引物混合，以便获得引物混合物，其中，各引物序列如下表所示00510052说明书CN104313044A5/17页80053说明书CN104313044A6/17页90054然后，对所述引物混合物进行第二PCR扩增，以便获得第二PCR扩增产物。根据本发明的实施例，所述第二PCR扩增的反应体系为10微升50微摩尔的所述引物混合物、05微升高保真DNA聚合酶、10微升5X第二PCR反应混合液，双蒸水补足至50微升。由此，PCR效率高。根据本发明的实施例，所述第二PCR扩增的反应程序为9。

27、53分钟；9430秒，55退火30秒，681分钟，循环25次；685分钟；冷却至室温。0055最后，利用SEQIDNO9和SEQIDNO69所示的引物，将所述第二PCR扩增产物进行第三PCR扩增，以便获得第三PCR扩增产物，所述第三PCR扩增产物即为SEQIDNO6所示的DNA片段。根据本发明的实施例，所述第三PCR扩增的反应体系为05微升50微摩尔SEQIDNO9所示的引物，05微升50微摩尔SEQIDNO69所示的引物，05微升高保真DNA聚合酶、10微升5X第三PCR反应混合液，1微升所述第二PCR扩增产物，双蒸水补足至50微升。由此，PCR反应效率高。根据本发明的实施例，所述第三PCR。

28、扩增的反应程序为953分钟；9430秒，55退火30秒，682分钟，循环30次；685分钟；冷却至室温。由此，由上述PCR合成效率高，准确度好。0056S200获得PUC19载体片段0057以PUC19质粒为模板，利用SEQIDNO78所示的引物进行第一PCR扩增，以便获得PUC19载体片段，其中，引物序列如下0058PUC19正向引物AATTGCTTTCCAGTCGGGAASEQIDNO7说明书CN104313044A7/17页100059PUC19反向引物GCCTCGTGATACGCCTATTSEQIDNO80060根据本发明的实施例，所述第一PCR扩增的反应体系为05微升10微摩尔SEQ。

29、IDNO7所示的引物，05微升10微摩尔SEQIDNO8所示的引物，10纳克PUC19质粒，05微升高保真DNA聚合酶、10微升5X第一PCR反应混合液，双蒸水补足至50微升，根据本发明的实施例，所述第一PCR扩增的反应程序为953分钟；9430秒，55退火30秒，682分钟，循环30次；685分钟；冷却至室温。0061需要说明的是，前述的第一PCR扩增、第二PCR扩增和第三PCR扩增所采用的PCR试剂盒的种类不受特别限制，可以根据实际实验要求选择合适的PCR试剂盒，进而，相应地，所述第一PCR反应混合液、第二PCR反应混合液和第三PCR反应混合液分别为所选试剂盒中的反应混合液。例如，可以采用。

30、天根生化科技北京有限公司的产品FASTHIFIDELITYPCRKIT进行所述第一PCR扩增、第二PCR扩增和第三PCR扩增，进而，所述第一PCR反应混合液、第二PCR反应混合液和第三PCR反应混合液均为该试剂盒FASTHIFIDELITYPCRKIT中的反应混合液。0062S300将DNA片段与PUC19载体片段进行同源重组0063将所述DNA片段与所述PUC19载体片段进行同源重组，以便获得载体骨架。根据本发明的实施例，利用基因克隆试剂盒进行所述同源重组。由此，同源重组效率高。根据本发明的实施例，所述同源重组的反应体系为10微升2X基因克隆反应混合液，5微升所述DNA片段、2微升所述PUC。

31、19载体片段，双蒸水补足至50微升。根据本发明的实施例，于室温下进行所述同源重组30分钟。0064需要说明的是，同源重组可以采用的基因克隆试剂盒的种类不受特别限制，可以根据实际实验要求进行选择，进而，相应地，所述基因克隆反应混合液为所选试剂盒中携带的反应混合液。例如，可以采用TAKARA产品HDCLONINGKIT进行所述同源重组，进而，所述基因克隆反应混合液为该试剂盒中的反应混合液。0065S400将载体骨架转化感受态细胞并提取质粒0066将所述载体骨架转化感受态细胞并提取质粒，以便获得零背景克隆载体的前载体。需要说明的是，在本文中，有时也将“零背景克隆载体的前载体”简称为“零背景前载体”。。

32、根据本发明的一些实施例，零背景前载体的载体图谱如图2所示。根据本发明的实施例，所述感受态细胞为大肠杆菌感受态细胞DB31。由此CCDB基因可以在DB31菌株中表达量高。0067S500ECORV酶酶切零背景克隆载体的前载体0068采用ECORV酶对所述零背景克隆载体的前载体进行酶切，以便得到零背景克隆载体。其中，根据本发明的一些实施例，经ECORV酶切后的零背景前载体的电泳图谱如图3所示。根据本发明的实施例，于37下进行所述酶切24小时。根据本发明的实施例，所述酶切的反应体系为10微升10X酶切缓冲液，110微克所述零背景克隆载体的前载体、110微升10U/微升ECORV酶，双蒸水补足至100。

33、微升。根据本发明的一个实施例，采用THERMO产品FERMENTASECORVRESTRICTIONENZYMES进行所述酶切。0069根据本发明的实施例，该方法进一步包括将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，并回收纯化约3000碱基的大片段，所述大片段即为所述零背景克隆载体。0070发明人惊奇的发现，通过该方法获得的零背景克隆载体能够直接用于平末端产物说明书CN104313044A108/17页11即目的基因片段的连接，载体自连的背景低，克隆的阳性率高，无需蓝白筛选，即能够在短时间内实现快速有效的克隆，克隆效率高，效果好，进而能够有效用于目的载体的构建。0071根据本发明的另一方面，本发明还提供了一。

34、种零背景克隆载体。根据本发明的实施例，该零背景克隆载体是通过前面所述的制备零背景克隆载体的方法制备获得的。发明人惊奇地发现，该零背景克隆载体相对于普通的T载体性能优越，可直接用于平末端产物即目的基因片段的连接，载体自连的背景低，克隆的阳性率高，无需蓝白筛选，能够在短时间内实现快速有效的克隆，克隆效率高，效果好，进而能够有效用于目的载体的构建。0072根据本发明的又一方面，前述的零背景克隆载体在制备目的基因克隆载体中的用途。根据本发明的实施例，该零背景克隆载体可以高效连接不同长度的目的基因片段，尤其适于大片段的目的基因的连接，并且连接效率以及阳性率非常高，连接产物可直接转化常用的大肠杆菌菌株，因。

35、而，能够直接用于制备目的基因克隆载体。具体地，将目的基因片段有效连接至零背景载体上，即可获得目的基因克隆载体，经测序验证后，可以直接用于序列分析以及基因序列的保存，或者通过亚克隆的方法将该目的基因克隆载体中的目的基因转移到合适的表达载体上，构建目的基因表达载体，以便用于蛋白表达或转基因研究。0073根据本发明的实施例，将目的基因片段与所述零背景克隆载体进行连接，然后转化、培养、筛选阳性克隆，以便获得目的基因克隆载体。0074根据本发明的实施例，利用快速连接缓冲液和T4DNA连接酶进行所述连接。由此，克隆载体可以高效连接不同长度的目的片段，特别对于大片段具有更高的连接效率以及阳性率，性能优于普通。

36、的T载体。0075根据本发明的实施例，所述快速连接缓冲液包含20200毫摩尔的三羟甲基氨基甲烷；550毫摩尔的氯化镁；0550毫摩尔的二硫苏糖醇；011毫摩尔的脱氧核糖核苷三磷酸；033毫摩尔的三磷酸腺苷；0510毫摩尔的盐酸亚精胺；以及501000毫克/毫升的小牛血清白蛋白。0076根据本发明的再一方面，本发明提供了一种制备目的基因克隆载体的方法。根据本发明的实施例，该方法包括将目的基因片段与零背景克隆载体进行连接，然后转化、培养、筛选阳性克隆，以便获得目的基因克隆载体。发明人惊奇地发现，利用该方法可以通过前述的零背景克隆载体高效连接任何具有平末端或粘性末端的不同长度的目的基因片段，尤其适于。

37、大片段目的基因片段的连接，并且连接效率以及阳性率非常高，连接产物可直接转化常用的大肠杆菌菌株，从而能够有效制备获得目的基因克隆载体。进一步，该目的基因克隆载体经测序验证后，可以直接用于序列分析以及基因序列的保存，或者通过亚克隆的方法将该目的基因克隆载体中的目的基因转移到合适的表达载体上，构建目的基因表达载体，以便用于蛋白表达或转基因研究。0077根据本发明的实施例，利用快速连接缓冲液和T4DNA连接酶进行所述连接。由此，克隆载体可以高效连接不同长度的目的片段，特别对于大片段具有更高的连接效率以及阳性率，性能优于普通的T载体。0078根据本发明的实施例，所述快速连接缓冲液包含20200毫摩尔的三。

38、羟甲基氨基甲烷；550毫摩尔的氯化镁；0550毫摩尔的二硫苏糖醇；011毫摩尔的脱氧核糖核苷三磷酸；033毫摩尔的三磷酸腺苷；0510毫摩尔的盐酸亚精胺；以及501000毫克/毫升的小牛血清白蛋白。说明书CN104313044A119/17页120079根据本发明的实施例，于室温下进行所述连接530分钟。0080需要说明的是，本发明的零背景克隆载体至少具有以下优点00811、本发明的零背景克隆载体采用了核糖核酸酶的毒性基因作为正筛选系统，可以高效克隆各种PCR产物和任何具有平末端或粘性末端的DNA片段，且对磷酸化或非磷酸化的DNA片段都有效。阳性选择载体和插入片段连接仅需5分钟即可获得超过95。

39、的阳性重组克隆。由具有校正活性的聚合酶如PFU聚合酶扩增的平末端PCR产物可直接连入克隆载体。由无校正活性的聚合酶如TAQ聚合酶或聚合酶混合物扩增的PCR产物在连接前需用热稳定DNA平端化酶进行末端平端化5分钟即可。连接产物可直接转化常用的大肠杆菌菌株。00822、本发明的零背景克隆载体含有致死的核糖核酸酶基因内含多克隆位点，多克隆位点插入外源片段会引起酶基因失活，因此只有转化了重组质粒的细菌才能存活形成克隆菌落，而自身环化的载体表达致死的核酸酶无外源片段插入，转化后杀死大肠杆菌细胞。00833、本发明的零背景克隆载体，在T4DNA连接酶及快速连接缓冲液的作用下，可以高效连接不同长度的片段，特。

40、别对于大片段具有更高的连接效率以及阳性率，性能优于普通的T载体。00844、将目的基因片段有效连接至零背景载体上，即可获得目的基因克隆载体，经测序验证后，其可以直接用于序列分析以及基因序列的保存，或者通过亚克隆的方法将该目的基因克隆载体中的目的基因转移到合适的表达载体上，构建目的基因表达载体，以便用于蛋白表达或转基因研究。具体地，可以在目的基因的两端设计上合适的限制性内切酶位点，通过酶切连接的方法，从目的基因克隆载体上将目的基因切下，然后连接至表达载体，构建成功后，即可进行后续的蛋白表达或转基因研究等工作。0085下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用。

41、于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件例如参考J萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的分子克隆实验指南，第三版，科学出版社或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品，例如可以采购自天根生化科技北京有限公司。0086实施例1零背景克隆载体的制备0087制备零背景克隆载体，首先需要构建一个零背景克隆载体的前载体，发明人选用高拷贝的PUC19质粒进行改造。步骤如下00881人工合成一个SEQIDNO6所示的基因序列，其包括LACUV5启动子SEQIDNO4驱动的核糖核酸酶基因、CCDB基因SEQ。

42、IDNO5的间隔序列，以及多克隆位点SEQIDNO3。合成引物如下0089说明书CN104313044A1210/17页130090说明书CN104313044A1311/17页1400912将上述1中所有的引物用灭菌水稀释到浓度为50微摩尔/升，每个引物吸取5微升加到一个PCR管中形成一个引物的混合液，然后利用FASTHIFIDELITYPCRKIT天根生化科技北京有限公司，货号KP202，采用快速高保真聚合酶进行组装PCR的第一轮扩增，体系如下0092说明书CN104313044A1412/17页15组装PCR体系中的成分反应体系5X反应混合液10微升引物混合物10微升高保真DNA聚合酶2。

43、5单位/微升05微升双蒸水补足到50微升00930094聚合酶链式反应预变性条件为95，3分钟。PCR循环条件为9430秒，55退火30秒，681分钟，循环25次。PCR补充延伸条件为685分钟。最后将反应体系冷却至室温。00953取1微升上述2中的PCR产物作为模板，利用FASTHIFIDELITYPCRKIT天根生化科技北京有限公司，货号KP202进行第二轮PCR，体系如下0096组装PCR体系中的成分反应体系5X反应混合液10微升正向引物F105微升反向引物R2905微升高保真DNA聚合酶25单位/微升05微升上述2中的PCR产物1微升双蒸水补足到50微升0097聚合酶链式反应预变性条件。

44、为95，3分钟。聚合酶链式反应循环条件为9430秒，55退火30秒，682分钟，循环30次。补充延伸条件为685分钟。最后将反应体系冷却至室温。0098经过上述扩增反应以后得到了1119个碱基对的DNA片段，其中前后两端20个碱基分别是和PUC19载体的26782697位碱基处以及600619位碱基处序列同源。00994在PUC19质粒载体的26782697碱基处以及600619碱基处设计一对引物，0100PUC19正向引物AATTGCTTTCCAGTCGGGAASEQIDNO7；0101PUC19反向引物GCCTCGTGATACGCCTATTSEQIDNO8。0102然后，将上述引物用灭菌水。

45、稀释到浓度为10微摩尔/升，各取05微升，以10纳克PUC19质粒为模板，利用FASTHIFIDELITYPCRKIT天根生化科技北京有限公司，货号KP202进行PCR，其中，反应体系中其余组分包括05微升高保真DNA聚合酶、10微升5X反应混合液，然后加入双蒸水补足到50微升进行聚合酶链式反应PCR的扩增。聚说明书CN104313044A1513/17页16合酶链式反应预变性条件为953分钟。聚合酶链式反应循环条件为9430秒，55退火30秒，682分钟，循环30次。补充延伸条件为685分钟。最后冷却至室温。0103上述扩增得到其余的PUC19的载体骨架，长约2000个碱基对。01045将3。

46、中得到的1119个碱基对的基因片段和4中得到的其余2000个碱基对的PUC19的载体骨架的扩增产物利用HDCLONINGKITTAKARA进行同源重组，反应体系如下0105同源重组体系中的成分反应体系2X反应混合液10微升3中得到的基因片段50纳克/微升5微升4中得到的PUC19载体片段50纳克/微升2微升双蒸水补足到50微升0106室温反应30分钟。0107取上述5微升的重组产物加入到50微升大肠杆菌感受态细胞DB31中，冰浴30分钟后，42度热击90秒，加入350微升的LB培养基后，在37摇床中180转/分钟孵育45分钟。取150微升菌液进行涂板。平板放置在37培养过夜。01086挑取上述。

47、5的平板中的单菌落进行序列测定，验证正确后作为制作零背景克隆载体的前载体。其中，零背景前载体的载体图谱如图2所示。0109利用FERMENTASECORVRESTRICTIONENZYMESTHERMO，货号ER0301，将以上构建好的零背景前载体进行ECORV酶切，酶切体系如下表，37酶切24个小时。0110酶切体系中的成分反应体系10缓冲液10微升零背景前载体的质粒110微克ECORV10U/微升110微升双蒸水补至100微升0111将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，100伏电压电泳12个小时，这时可以看到约300碱基的小片段和约3000碱基的大片段载体，将大片段的载体用刀片切下，利用天根生化。

48、科技北京有限公司在本文中有时也简称为“天根”的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒货号DP209进行回收，大片段的载体纯化后即得到零背景克隆载体，测定浓度后将载体定至25纳克/微升。0112对于平端的聚合酶链式反应产物和酶切产物，可以直接进行连接。加入5微升2X快速连接缓冲液，25纳克零背景克隆载体，50200纳克的DNA插入片段，1微升的T4DNA连说明书CN104313044A1614/17页17接酶，加入双蒸水补足10微升。0113对于粘末端的聚合酶链式反应产物，加入5微升2X快速连接缓冲液，50200纳克的DNA插入片段，05微升平端化酶，加入双蒸水补足85微升。轻轻弹动离心管以混匀内容物，短暂。

49、离心35秒。将以上混合反应液置于70反应5分钟，放在冰上短暂冷却。然后再向平端化的反应体系中加入25纳克零背景克隆载体和05微升T4DNA连接酶。0114低于3000碱基的片段室温连接5分钟，大于3000碱基的片段室温连接30分钟。由于零背景克隆载体的有效性以及快速连接缓冲液的高效连接，插入片段的连接可获得高达100的阳性率。0115实施例2使用零背景克隆载体的连接基因片段的实施方法01161、目的基因片段的获得0117以LAMBDA噬菌体DNA为模板，设计引物如下0118700碱基基因片段的正向引物以下简称700FGAGGGCAAGTATCGTTTCCASEQIDNO700119700碱基基因片段的反向引物以下简称700RACTGGAAAGCAACGAAGTCCSEQIDNO7101202000碱基基因片段的正向引物以下简称2KFATCTGCCTTTACGGGGATTTSEQIDNO7201212000碱基基因片段的反向引物以下简称2KRGTACAGCCAAAGGCATCCATSEQIDNO7301228000碱基基因片段的正向引物以下简称8KFATCCCATGTCGGCAAGCATAAGCSEQIDNO74。