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1、10申请公布号CN104313066A43申请公布日20150128CN104313066A21申请号201410518180222申请日20141001C12P7/62200601C12R1/7320060171申请人青岛科技大学地址266061山东省青岛市崂山区松岭路99号72发明人刘均洪曹延俊刘慧张银隋洪南54发明名称一种生产2R,3S含碘甲基丙酸甲酯的生物还原法57摘要一种生产2R,3S含碘甲基丙酸甲酯的生物还原法。一种生物还原制备手性医药中间体2R,3S3（4碘苯基）3羟基2甲基丙酸甲酯的方法，反应罐中加入磷酸盐缓冲液，加入白土调控底物、产物浓度，用耶氏解脂假丝酵母细胞进行生物还原反。
2、应，得到产物，产品收率高，对映体过量率高，具有很好的应用前景。51INTCL权利要求书1页说明书5页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书5页10申请公布号CN104313066ACN104313066A1/1页21一种耶氏解脂假丝酵母细胞生物还原制备2R,3S3（4碘苯基）3羟基2甲基丙酸甲酯的方法，其特征在于反应罐中加入磷酸盐缓冲液，装料系数为0607，PH为78，加入吸附了底物的白土，使底物2（4氟苯甲酰）2丙烯酸甲酯添加量为8090G/L，麦芽浸膏2226G，葡萄糖1822G/L，木糖1213G/L，山梨坦单月桂酸酯为2022G/L，121高压灭菌30分钟。
3、；冷却至3233时，加入湿酵母细胞使浓度为2932G/L，通气比为013016V/（V分钟），进行生物还原反应，反应时间为95100小时；反应结束后，分别滤出细胞、白土，用乙酸乙酯萃取反应液、萃取白土，合并乙酸乙酯萃取液和萃取白土的乙酸乙酯，蒸出乙酸乙酯，得到产物2R,3S3（4氟苯基）3羟基2甲基丙酸甲酯，反应转化率9496，产品收率9294，对映体过量率9798。2权利要求1所述的方法，其特征在于湿酵母细胞制备过程如下耶氏解脂假丝酵母经斜面、摇瓶、种子罐培养得到种子液；发酵罐加入培养液，装料系数为0607，121高压灭菌30分钟，冷却至2829，将耶氏解脂假丝酵母种子液接种至发酵罐，接种比。
4、例为665，通气比为051V/（V分钟），2829培养4248小时，用过滤式离心机离心得到湿酵母细胞，用作生物还原反应催化剂。3权利要求1所述的方法，其特征在培养液成份为葡萄糖2025G/L，酵母浸膏1015G/L，KH2PO44455G/L，MGSO47H2O0506G/L，玉米油57G/L，黄豆粉1620G/L,PH值为78。4权利要求1所述的方法，其特征在于所述吸附了底物的白土制作方法为，将底物溶于乙酸乙酯，底物与乙酸乙酯的比率为052，得到底物的乙酸乙酯溶液，用白土吸收此溶液，然后，烘干、回收乙酸乙酯，即得到吸附底物的白土，调节底物与白土用量，使得底物与白土的质量比率为029033。权。
5、利要求书CN104313066A1/5页3一种生产2R,3S含碘甲基丙酸甲酯的生物还原法技术领域0001本发明属于制药工程技术领域，特别涉及到耶氏解脂假丝酵母细胞生物还原制备手性医药中间体2R,3S3（4碘苯基）3羟基2甲基丙酸甲酯的技术。背景技术0002羟基手性酯是合成手性药物、精细化学品、农药品和其他特殊材料的重要中间体。生物催化羰基化合物的不对称还原具有环境友好、条件温和、选择性高等优点,作为绿色高效制备羟基手性酯的优先途径,被越来越多地应用于生产一些高附加值的羟基手性酯。生物催化制备羟基手性酯具有很好的应用前景。0003生物催化具有催化效率高、选择性强、条件温和、环境友好等突出优点,是。
6、可持续发展过程中替代和拓展传统有机化学合成的重要方法。其中手性拆分和不对称合成是生物催化最具吸引力的应用领域。在作为生物催化剂的六大类酶中,水解酶能够催化动力学拆分外消旋体得到手性产品,在工业生物催化中一直扮演着重要角色。近几年来,氧化还原酶在工业上的应用得到了迅速增长。目前,采用水解酶动力学拆分法、生物还原法和生物氧化法工业制备光学活性手性化合物的比例为421。0004生物还原法相对于动力学拆分法而言,最大的优势在于理论收率可达100,原子经济性好。然而生物还原反应需要辅酶或辅因子的参与,一定程度上限制了其应用。由于辅酶依赖性的缘故,生物还原反应中多釆用整细胞作为催化剂,实现体内辅酶循环再生。
7、的同时免去了酶的分离纯化步骤。00052R,3S3（4碘苯基）3羟基2甲基丙酸甲酯是合成手性药物、精细化学品、农药品的重要手性砌块，由于有2个手性中心，使得化学合成较为困难，成本高。本发明将采用生物催化制备2R,3S3（4碘苯基）3羟基2甲基丙酸甲酯。发明内容0006本发明采用耶氏解脂假丝酵母细胞催化制备2R,3S3（4碘苯基）3羟基2甲基丙酸甲酯，反应式如下底物2（4碘苯甲酰）2丙烯酸甲酯（1）经耶氏解脂假丝酵母催化还原，得到产物2R,3S3（4碘苯基）3羟基2甲基丙酸甲酯（2）。有多种微生物可以催化还原，经过大量实验筛选，最终确定采用耶氏解脂假丝酵母作为催化剂，因为其催化还原1的效果最好，。
8、反应收率、对映体过量率（EE）均很高。0007许多耶氏解脂假丝酵母都可以进行生物催化还原，然而，其效果不同，相差很大，说明书CN104313066A2/5页4经实验，本发明选用耶氏解脂假丝酵母菌株为ATCC20496，其催化还原效果最佳。0008培养介质1、斜面培养基配制如下马铃薯200G葡萄糖20G琼脂20G水1000ML马铃薯去皮切成块煮沸30MIN然后用纱布过滤再加葡萄糖及琼脂溶化后补足水至1000ML2、种子培养基成份为葡萄糖5G/L，酵母浸膏10G/L，尿素10，KH2PO42G/L，MGSO47H2O05G/L，配制固体培养基时添加15G/L的琼脂粉；3、培养液成份为葡萄糖2025。
9、G/L，酵母浸膏1015G/L，KH2PO44455G/L，MGSO47H2O0506G/L，玉米油57G/L，黄豆粉1620G/L,PH值为78。0009酵母细胞制备。耶氏解脂假丝酵母经斜面、摇瓶、种子罐培养得到种子液；发酵罐加入培养液，耶氏解脂假丝酵母经斜面、摇瓶、种子罐培养得到种子液；发酵罐加入培养液，装料系数为0607，121高压灭菌30分钟，冷却至2829，将耶氏解脂假丝酵母种子液接种至发酵罐，接种比例为665，通气比为051V/（V分钟），2829培养4248小时，用过滤式离心机离心得到湿酵母细胞，用作生物还原反应催化剂。0010由于底物、产物均对酵母细胞有抑制作用，为了减少底物、。
10、产物对细胞的抑制，本发明采用白土吸附底物，反应中，当底物被细胞催化还原，浓度降低时，底物从白土溶出，补充反应消耗的底物。同时，产物被白土吸附，减少了其在水中的浓度，从而大幅度降低了底物、产物对细胞的抑制。底物与白土的比率，决定了反应液中底物、产物的浓度，而且，浓度还与反应温度、反应液成份有关。不同细胞对底物、产物的敏感度不同，所以，要进行大量实验，才能确定最佳的底物与白土的比率。实验表明，对于本发明的菌株、反应液成份、反应温度，最佳的底物与白土的比率为029033。具体吸附时，将底物溶于乙酸乙酯，底物与乙酸乙酯的比率为052，得到底物的乙酸乙酯溶液，用白土吸收此溶液，然后，烘干、回收乙酸乙酯，。
11、即得到吸附底物的白土。调节底物与白土用量，使得底物与白土的质量比率为029033。所用白土为普通白土，从市场上购买后，灭菌，无菌保存待用。0011底部通气搅拌反应罐中加入磷酸盐缓冲液，装料系数为0607，PH为78，加入吸附了底物的白土，使底物2（4氟苯甲酰）2丙烯酸甲酯添加量为8090G/L，麦芽浸膏2226G，葡萄糖1822G/L，木糖1213G/L，山梨坦单月桂酸酯为2022G/L，121高压灭菌30分钟；冷却至3233时，加入湿酵母细胞使浓度为2932G/L，通气比为01316V/（V分钟），进行生物还原反应，反应时间为95100小时；反应结束后，分别滤出细胞、白土，用乙酸乙酯萃取反应。
12、液、萃取白土，合并乙酸乙酯萃取液和萃取白土的乙酸乙酯，蒸出乙酸乙酯，得到产物2R,3S3（4氟苯基）3羟基2甲基丙酸甲酯，反应转化率9496，产品收率9294，对映体过量率（EE）9798。0012本发明所开展工作包括菌株选择（从近百个菌株中选择）、催化还原条件优化（反应温度、通气量、PH）、反应介质选择和浓度优化（底物浓度、葡萄糖含量、麦芽浸膏含量、木糖含量、表面活性剂种类（20多种选1）及浓度、其它多种成份选择排除），采用固体吸附控制底物产物浓度，从而减少对细胞的抑制，试验了白土、硅藻土、棉纱布、苎麻纱布、大孔树酯等多种固体材料，还曾进行了水有机溶剂2相体系试验。由于试验量很大，尽管采用了。
13、响应面优化设计试验，大幅度减少了试验量，试验量仍然很大，全部试验进行2年多才完成，达成目前的技术方案。对于光活性产物而言，当反应转化率9496，产品收率9294时，对映体过量率（EE）仍然高达9798，是非常不易的，我们的工作取得了显著进步。说明书CN104313066A3/5页50013实施例1斜面培养基配制如下马铃薯200G葡萄糖20G琼脂20G水1000ML马铃薯去皮切成块煮沸30MIN然后用纱布过滤再加葡萄糖及琼脂溶化后补足水至1000ML。0014种子培养基成份为葡萄糖5G/L，酵母浸膏10G/L，尿素10，KH2PO42G/L，MGSO47H2O05G/L，配制固体培养基时添加15。
14、G/L的琼脂粉。0015培养液成份为葡萄糖20G/L，酵母浸膏10G/L，KH2PO444G/L，MGSO47H2O05G/L，玉米油5G/L，黄豆粉16G/L,PH值为78。0016湿酵母细胞制备过程如下耶氏解脂假丝酵母ATCC20496经斜面、摇瓶培养，得到种子液。10L发酵罐加入培养液；发酵罐加入培养液，装料系数为06，121高压灭菌30分钟，冷却至28，将耶氏解脂假丝酵母种子液接种至发酵罐，接种比例为6，通气比为05V/（V分钟），28培养42小时，用过滤式离心机离心得到湿酵母细胞，用作生物还原反应催化剂。0017吸附底物的白土制作方法为，将底物溶于乙酸乙酯，底物与乙酸乙酯的比率为05。
15、2，得到底物的乙酸乙酯溶液，用白土吸收此溶液，然后，烘干、回收乙酸乙酯，即得到吸附底物的白土，调节底物与白土用量，使得底物与白土的质量比率为029。所用白土为普通白土，从市场上购买后，灭菌，无菌保存待用，其它实施例白土处理相同。001850L底部通气搅拌反应罐中加入磷酸盐缓冲液，装料系数为06，PH为78，加入吸附了底物的白土，使底物2（4氟苯甲酰）2丙烯酸甲酯添加量为80G/L，麦芽浸膏22G，葡萄糖18G/L，木糖12G/L，山梨坦单月桂酸酯为20G/L，121高压灭菌30分钟；冷却至32时，加入湿酵母细胞使浓度为29G/L，通气比为013V/（V分钟），进行生物还原反应，反应时间为95小。
16、时；反应结束后，分别滤出细胞、白土，用乙酸乙酯萃取反应液、萃取白土，合并乙酸乙酯萃取液和萃取白土的乙酸乙酯，蒸出乙酸乙酯，得到产物2R,3S3（4氟苯基）3羟基2甲基丙酸甲酯，反应转化率94，产品收率92，对映体过量率（EE）98。0019实施例2斜面培养基和种子培养基成份同实施例1。0020培养液成份为葡萄糖25G/L，酵母浸膏15G/L，KH2PO455G/L，MGSO47H2O06G/L，玉米油7G/L，黄豆粉20G/L,PH值为78。0021湿酵母细胞制备过程如下耶氏解脂假丝酵母ATCC20496经斜面、摇瓶培养，得到种子液。100L发酵罐加入培养液；发酵罐加入培养液，装料系数为07，。
17、121高压灭菌30分钟，冷却至29，将耶氏解脂假丝酵母种子液接种至发酵罐，接种比例为65，通气比为1V/（V分钟），29培养48小时，用过滤式离心机离心得到湿酵母细胞，用作生物还原反应催化剂。0022吸附底物的白土制作方法为，将底物溶于乙酸乙酯，底物与乙酸乙酯的比率为052，得到底物的乙酸乙酯溶液，用白土吸收此溶液，然后，烘干、回收乙酸乙酯，即得到吸附底物的白土，调节底物与白土用量，使得底物与白土的质量比率为033。所用白土为普通白土，从市场上购买后，灭菌，无菌保存待用，其它实施例白土处理相同。0023500L底部通气搅拌反应罐中加入磷酸盐缓冲液，装料系数为07，PH为78，加入吸附了底物的白。
18、土，使底物2（4氟苯甲酰）2丙烯酸甲酯添加量为90G/L，麦芽浸说明书CN104313066A4/5页6膏26G，葡萄糖22G/L，木糖13G/L，山梨坦单月桂酸酯为22G/L，121高压灭菌30分钟；冷却至33时，加入湿酵母细胞使浓度为32G/L，通气比为016V/（V分钟），进行生物还原反应，反应时间为100小时；反应结束后，分别滤出细胞、白土，用乙酸乙酯萃取反应液、萃取白土，合并乙酸乙酯萃取液和萃取白土的乙酸乙酯，蒸出乙酸乙酯，得到产物2R,3S3（4氟苯基）3羟基2甲基丙酸甲酯，反应转化率96，产品收率94，对映体过量率（EE）975。0024实施例3斜面培养基和种子培养基成份同实施例。
19、1。0025培养液成份为葡萄糖23G/L，酵母浸膏13G/L，KH2PO45G/L，MGSO47H2O055G/L，玉米油6G/L，黄豆粉18G/L,PH值为78。0026湿酵母细胞制备过程如下耶氏解脂假丝酵母ATCC20496经斜面、摇瓶培养，得到种子液。250L发酵罐加入培养液；发酵罐加入培养液，装料系数为065，121高压灭菌30分钟，冷却至285，将耶氏解脂假丝酵母种子液接种至发酵罐，接种比例为62，通气比为08V/（V分钟），285培养46小时，用过滤式离心机离心得到湿酵母细胞，用作生物还原反应催化剂。0027吸附底物的白土制作方法为，将底物溶于乙酸乙酯，底物与乙酸乙酯的比率为052。
20、，得到底物的乙酸乙酯溶液，用白土吸收此溶液，然后，烘干、回收乙酸乙酯，即得到吸附底物的白土，调节底物与白土用量，使得底物与白土的质量比率为031。所用白土为普通白土，从市场上购买后，灭菌，无菌保存待用，其它实施例白土处理相同。002850L底部通气搅拌反应罐中加入磷酸盐缓冲液，装料系数为065，PH为78，加入吸附了底物的白土，使底物2（4氟苯甲酰）2丙烯酸甲酯添加量为85G/L，麦芽浸膏24G，葡萄糖20G/L，木糖125G/L，山梨坦单月桂酸酯为21G/L，121高压灭菌30分钟；冷却至325时，加入湿酵母细胞使浓度为31G/L，通气比为014V/（V分钟），进行生物还原反应，反应时间为9。
21、7小时；反应结束后，分别滤出细胞、白土，用乙酸乙酯萃取反应液、萃取白土，合并乙酸乙酯萃取液和萃取白土的乙酸乙酯，蒸出乙酸乙酯，得到产物2R,3S3（4氟苯基）3羟基2甲基丙酸甲酯，反应转化率95，产品收率93，对映体过量率（EE）975。0029实施例4斜面培养基和种子培养基成份同实施例1。0030培养液成份为葡萄糖25G/L，酵母浸膏15G/L，KH2PO455G/L，MGSO47H2O06G/L，玉米油7G/L，黄豆粉20G/L,PH值为78。0031湿酵母细胞制备过程如下耶氏解脂假丝酵母ATCC20496经斜面、摇瓶培养，得到种子液。1000L发酵罐加入培养液；发酵罐加入培养液，装料系数。
22、为07，121高压灭菌30分钟，冷却至29，将耶氏解脂假丝酵母种子液接种至发酵罐，接种比例为65，通气比为1V/（V分钟），29培养48小时，用过滤式离心机离心得到湿酵母细胞，用作生物还原反应催化剂。0032吸附底物的白土制作方法为，将底物溶于乙酸乙酯，底物与乙酸乙酯的比率为052，得到底物的乙酸乙酯溶液，用白土吸收此溶液，然后，烘干、回收乙酸乙酯，即得到吸附底物的白土，调节底物与白土用量，使得底物与白土的质量比率为033。所用白土为普通说明书CN104313066A5/5页7白土，从市场上购买后，灭菌，无菌保存待用，其它实施例白土处理相同。00335000L底部通气搅拌反应罐中加入磷酸盐缓冲液，装料系数为07，PH为78，加入吸附了底物的白土，使底物2（4氟苯甲酰）2丙烯酸甲酯添加量为90G/L，麦芽浸膏26G，葡萄糖22G/L，木糖13G/L，山梨坦单月桂酸酯为22G/L，121高压灭菌30分钟；冷却至33时，加入湿酵母细胞使浓度为32G/L，通气比为016V/（V分钟），进行生物还原反应，反应时间为100小时；反应结束后，分别滤出细胞、白土，用乙酸乙酯萃取反应液、萃取白土，合并乙酸乙酯萃取液和萃取白土的乙酸乙酯，蒸出乙酸乙酯，得到产物2R,3S3（4氟苯基）3羟基2甲基丙酸甲酯，反应转化率96，产品收率94，对映体过量率（EE）98。说明书CN104313066A。