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1、10申请公布号CN104189918A43申请公布日20141210CN104189918A21申请号201410348885422申请日20140721A61K48/00200601A61K49/22200601A61P13/12200601A61P3/1020060171申请人香港中文大学深圳研究院地址518057广东省深圳市南山区虚拟大学园区粤兴二道10号72发明人钟志刚74专利代理机构深圳新创友知识产权代理有限公司44223代理人王震宇54发明名称动力蛋白轻链路障2型制备治疗肾衰竭药物的应用及其药物57摘要本发明公开了一种将抑制动力蛋白轻链路障2型的物质用于制备治疗肾病尤其是肾衰竭糖尿。
2、病药物的应用，其中使用敲低动力蛋白轻链路障2型质粒制作所述药物。本发明还公开了一种治疗肾病糖尿病的药物，其含有敲低抑制动力蛋白轻链路障2型的质粒。本发明提供的药物可用于实现新型、安全、有效、可控制的基因疗法,来抑制TGFBETA介导的肾脏纤维化。51INTCL权利要求书1页说明书5页附图3页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书5页附图3页10申请公布号CN104189918ACN104189918A1/1页21一种将抑制动力蛋白轻链路障2型的物质用于制备治疗肾病糖尿病药物的应用，其特征在于,使用敲低动力蛋白轻链路障2型质粒制作所述药物。2如权利要求1所述的应用，。
3、其特征在于,将所述敲低动力蛋白轻链路障2型质粒与微泡造影剂混合以制作所述药物。3如权利要求2所述的应用，其特征在于,所述微泡造影剂为六氟化硫微泡造影剂，优选造影剂。4如权利要求2或3所述的应用，其特征在于,所述敲低动力蛋白轻链路障2型质粒与所述微泡造影剂的体积比为11。5如权利要求1至4任一项所述的应用，其特征在于，构造敲低动力蛋白轻链路障2型的质粒是将一个针对动力蛋白轻链路障2型信使RNA的短发夹RNASHRNA合成在载体中，以产生一个动力蛋白轻链路障2型的小发夹RNA，其中，所述短发夹RNA的序列为GGACAACTCAACAACTGTTCAATAT,优选地，所述载体为PSILENCER41。
4、载体INVITROGEN，CARLSBAD,VA,USA。6如权利要求5所述的应用，其特征在于,采用不含内毒素的质粒试剂盒产生所述敲低动力蛋白轻链路障2型质粒。7如权利要求1至6任一项所述的应用，其特征在于,制作含1M/ML的敲低动力蛋白轻链路障2型的SHRNA质粒的微泡的静脉注射剂。8一种治疗肾病糖尿病的药物，其特征在于,含有敲低动力蛋白轻链路障2型质粒。9如权利要求8所述的药物，其特征在于,还含有微泡造影剂，优选地，所述敲低动力蛋白轻链路障2型质粒与所述微泡造影剂的体积比为11。10如权利要求8或9所述的药物，其特征在于,采用含1M/ML的敲低动力蛋白轻链路障2型的SHRNA质粒的静脉注射。
5、剂。权利要求书CN104189918A1/5页3动力蛋白轻链路障2型制备治疗肾衰竭药物的应用及其药物技术领域0001本发明涉及动力蛋白轻链路障2型制备治疗肾衰竭药物的应用及其药物。背景技术0002肾脏纤维化导致终末期肾功能衰竭，由于TGFBETA/SMAD信号调控在肾脏疾病中的细胞外基质的表达，所以针对TGFBETA信号是控制纤维化的一个有吸引力的治疗方法。然而，在TGFBETA信号传导途径的复杂性使得选择适当的治疗靶点困难。尤其是，针对在TGFBETA信号传导途径中的单个元素的方法被证明效用不大。0003在过去的十年中，许多策略以直接阻断TGFBETA影响已经被开发，包括使用TGFBETA的。
6、中和抗体、抑压TGFBETA的寡脱氧核苷酸ODN、可溶性人类TGFBETA型受体，或TGFBETA受体激酶的特异性抑制剂。然而，通过深入调查后，发现采用这些策略作没有产生如预期的有效的结果。这可能是由于封锁TGFBETA信号上游传导途径会损害TGFBETA的有效的抗发炎特性，并随后促进肾脏炎症。另一方面，细胞内的SMAD通路的串扰会阻碍靶向TGFBETA与TGFBETA受体激酶的策略。发明内容0004本发明的主要目的在于针对现有的治疗肾病的药物的不足，提供动力蛋白轻链路障2型在制备治疗肾病如肾衰竭糖尿病药物中的应用及其药物。0005为实现上述目的，本发明采用以下技术方案0006一种将抑制动力蛋。
7、白轻链路障2型的物质用于制备治疗肾病糖尿病药物的应用，其中使用敲低动力蛋白轻链路障2型质粒制作所述药物。0007优选地0008将所述敲低动力蛋白轻链路障2型质粒与微泡造影剂混合以制作所述药物。0009所述微泡造影剂为六氟化硫微泡造影剂，优选造影剂BRACCOIMAGINGBV,PLANLESQUATESGENEVE,SWITZERLAND。0010所述敲低动力蛋白轻链路障2型质粒与所述微泡造影剂的体积比为11。0011构造敲低动力蛋白轻链路障2型的质粒是将一个针对动力蛋白轻链路障2型信使RNAMESSENGERRNA的短发夹RNASHRNA合成在载体中，以产生一个动力蛋白轻链路障2型的小发夹R。
8、NA，其中，所述短发夹RNA的序列为GGACAACTCAACAACTGTTCAATAT。优选地，所述载体为PSILENCER41载体INVITROGEN，CARLSBAD,VA,USA。0012采用不含内毒素的质粒试剂盒产生所述敲低动力蛋白轻链路障2型质粒。0013制作含1M/ML的敲低动力蛋白轻链路障2型的SHRNA质粒的微泡的静脉注射剂。0014一种治疗肾病糖尿病的药物，含有敲低动力蛋白轻链路障2型质粒。0015还含有微泡造影剂，优选地，所述敲低动力蛋白轻链路障2型质粒与所述微泡造说明书CN104189918A2/5页4影剂的体积比为11。0016采用含1M/ML的敲低动力蛋白轻链路障2型。
9、的SHRNA质粒的静脉注射剂。0017本发明的有益效果0018本发明提供抑制动力蛋白轻链2型以治疗肾脏疾病的药物及其制备方法。动力蛋白轻链路障2型在肾脏疾病过程中影响SMAD3的激活。因此，通过这抑制动力蛋白轻链2型的表达特异性压制SMAD3蛋白的磷酸化机制去调控SMAD3的激活。此外，我们证明了抑制动力蛋白轻链2型也减少了型胶原的表达及2胶原启动子活性。我们还发现，压制动力蛋白轻链2型的表达抑制在肾小管上皮细胞纤维化过程中SMA的表达，这可能是因为抑制动力蛋白轻链2型废除自分泌TGFBETA信号通路在肾脏纤维化过程中的激活。0019结果表明，压制动力蛋白轻链2型抑制TGFBETA信号下游途径。
10、及阻止过度的细胞外基质生成，动力蛋白轻链2型的抑制将会是打击慢性肾脏病的一种有效的治疗。0020由于采用本药物的基因治疗能直接抑制肾疾病过程中TGFBETA/SMAD3信号传导的激活，而且减少体内肾纤维化，在短期应用方面，采用本药物的基因治疗可以抑制直接施行在慢性肾脏病病人身上，去中止肾纤维化的进展，改善肾功能的表现。在长期来看，这种基因疗法可以用在防止肾脏疾病的发生，通过抑制TGFBETA信号在肾脏的任何异常激活，来减少肾纤维化的出现。0021本发明提供的药物可用于实现一种新型、安全、有效、可控制的基因疗法来抑制TGFBETA介导的肾脏纤维化。附图说明0022图1A示出未使用本发明实施例的药。
11、物时和使用本发明实施例的药物之后的实时PCR检测结果；0023图1B示出未使用本发明实施例的药物时和使用本发明实施例的药物之后的免疫印迹结果；0024图1C示出未使用本发明实施例的药物时和使用本发明实施例的药物之后的免疫组织化学结果；0025图1D示出未使用本发明实施例的药物时和使用本发明实施例的药物之后的量化后的免疫化学结果；0026图2A示出未使用本发明实施例的药物时和使用本发明实施例的药物之后的组织学和免疫组织化学的结果；0027图2B示出未使用本发明实施例的药物时和使用本发明实施例的药物之后的实时PCR检测结果；0028图2C示出未使用本发明实施例的药物时和使用本发明实施例的药物之后的。
12、蛋白质印迹结果。具体实施方式0029以下结合附图对本发明的实施方式作详细说明。应该强调的是，下述说明仅仅是示例性的，而不是为了限制本发明的范围及其应用。说明书CN104189918A3/5页50030研究发现SMAD3，HSP72，和HSP90特异性抑制剂能够降低肾纤维化。因此可以提供肾脏纤维化的替代治疗的新途径。使用针对TGFBETA/SMAD3信号途径的抑制剂可能为肾病提供了一种新的、有效的、安全的治疗。0031本发明的实施例优选采用超声微泡质粒转染技术将抑制动力蛋白轻链2型的SHRNA质粒转染到肾脏，下调动力蛋白轻链2型在肾脏细胞的表达。可以检测抑制动力蛋白轻链2型治疗糖尿病肾病的良好效。
13、果。0032具体来说，实施例中优选提供用于静脉注射的含有抑制动力蛋白轻链2型的SHRNA质粒1M/ML的微泡的药物，优选含量1M/ML。可通过静脉注射此药物质粒，然后在肾旁加进超声能量1W，1MHZ5分钟。超声治疗增强质粒传递到整个肾脏，效率可达90的细胞肾小球、肾小管间质和血管壁的细胞核。0033药物的组成成分0034在优选的实施例中，药物包括00351敲低动力蛋白轻链路障2型DYNLRB2的KDPLASMID质粒；00362六氟化硫微泡造影剂BRACCOIMAGINGBV,PLANLESQUATESGENEVE,SWITZERLAND。0037在优选的实施例中，还进一步提供含有上述药物成分。
14、的静脉注射药物。0038药物的制备0039在优选的实施例中，药物采用敲低动力蛋白轻链路障2型质粒和六氟化硫微泡造影剂混合来制备。0040在更优选的实施例中，构造敲低动力蛋白轻链路障2型的质粒是将一个针对动力蛋白轻链路障2型信使RNAMESSENGERRNA的短发夹RNASHRNA合成在PSILENCER41载体中INVITROGEN，CARLSBAD,VA,USA，以产生一个动力蛋白轻链路障2型的小发夹RNA，其中，所述短发夹RNA的序列为GGACAACTCAACAACTGTTCAATAT。0041并可采用不含内毒素的质粒试剂盒QIAGEN,VALENCIA,CA,USA去大量产生敲低动力蛋白。
15、轻链路障2型的质粒。最后，该质粒优选以11体积/体积的比例与六氟化硫微泡造影剂BRACCOIMAGINGBV,PLANLESQUATESGENEVE,SWITZERLAND混合备用。0042施药方式00431静脉注射含有构造敲低动力蛋白轻链路障2型的质粒的微泡400L。00442在肾旁加进超声能量1MHZ,1W5分钟。0045药物疗效实验及实验数据的具体说明0046为了验证抑压动力蛋白轻链路障2型的表达对在体内TGF诱导的肾纤维化的作用，我们利用小鼠单侧尿道梗阻UNILATERALURETEROBSTRUCTION，UUO模型作为慢性肾病的模型，采用超声微泡质粒转染技术将抑制动力蛋白轻链路障2。
16、型的的质粒转染到肾脏，下调动力蛋白轻链路障2型在肾脏细胞的表达，检测动力蛋白轻链路障2型治疗慢性肾脏病的效果。施用药物中质粒优选份量150G/25G质粒/小鼠体重。0047我们先建立单侧尿道梗阻的小鼠慢性肾脏病模型，同一天，我们静脉注射含有和敲低动力蛋白轻链路障2型的质粒1M/ML,400L的微泡给小鼠，然后在肾旁加进超声能量1W，1MHZ的5分钟，超声治疗增强质粒传递到整个肾脏。说明书CN104189918A4/5页60048在单侧尿道梗阻后的第7天，肾脏内的动力蛋白轻链路障2型的表达显著增加图1A。然而，输入敲低动力蛋白轻链路障2型的质粒抑制了在单侧尿道梗阻肾病的小鼠模型之肾脏内动力蛋白轻。
17、链路障2型的表达图1A。0049我们再研究敲低动力蛋白轻链路障2型治疗会是否影响TGF信号，因为TGFBETA信号是肾脏纤维化的关键信号通路，在单侧尿道梗阻肾病的小鼠模型中TGFBETA信号会被活化，增加肾脏的结缔组织生长因子CTGF和磷酸化SMAD3PSMAD3蛋白图1B,C的表达。然而，输入敲低动力蛋白轻链路障2型的质粒抑制TGF1、CTGF和磷酸化SMAD3蛋白的表达图1B,C。这表明的是，敲低动力蛋白轻链路障2型的表达抑制肾脏内的TGF信号的激活，导致肾纤维化的抑制。0050组织学上，在单侧尿道梗阻后的第7天引起间质纤维化和肾小管萎缩图2A。当比较用空载体治疗后的小鼠，敲低动力蛋白轻链。
18、路障2型治疗减少肾小管萎缩和间质纤维化图2A。符合肾损伤和间质纤维化程度，纤维化标志物的表达包括I型胶原和平滑肌肌动蛋白SMA的表达均上调图2AC，但输入敲低动力蛋白轻链路障2型的质粒下调纤维化标志物的表达水平图2AC。这些结果证明了敲低动力蛋白轻链路障2型的表达减少慢性肾脏病的间质纤维化。0051如图1A所示，实时PCR检测结果表明，在单侧尿道梗阻后的第7天，肾脏内的动力蛋白轻链路障2型表达增加，但输入敲低动力蛋白轻链路障2型的质粒抑制后，其表达就降低。0052如图1B所示，免疫印迹结果显示，在单侧尿道梗阻后的第7天，肾脏的结缔组织生长因子CTGF和磷酸化SMAD3PSMAD3蛋白的表达增加。
19、，但用敲低动力蛋白轻链路障2型质粒治疗后减少这种增加。0053图1C所示的免疫组织化学结果及图1D所示的量化后的免疫化学结果显示，在单侧尿道梗阻后的第7天，肾脏的磷酸化SMAD3PSMAD3蛋白的表达增加，但用敲低动力蛋白轻链路障2型质粒治疗后减少这种增加。0054如图2A所示，从组织学和免疫组织化学的结果均表明，在单侧尿道梗阻7天后，敲低动力蛋白轻链路障2型质粒治疗能物改善肾间质纤维化，降低在单侧尿道梗阻肾脏中I型胶原和平滑肌肌动蛋白的表达。0055如图2B所示，实时PCR检测结果表明，在单侧尿道梗阻后的第7天，I型胶原和平滑肌肌动蛋白的表达是升高，但输入敲低动力蛋白轻链路障2型的质粒抑制后。
20、，其表达就降低。0056如图2C所示，蛋白质印迹结果表明，在单侧尿道梗阻后的第7天，I型胶原和平滑肌肌动蛋白的表达是升高，但用敲低动力蛋白轻链路障2型的质粒的治疗后却降低它們的表达。0057总结来说，抑压动力蛋白轻链路障2型的治疗方法有效抑制TGFBETA信号的活化，并压制SMAD3蛋白的磷酸化机制去调控SMAD3的激活，而且减少体内肾纤维化和中止肾纤维化的进展，抑制动力蛋白轻链2型也减少了型胶原的表达及2胶原启动子活性。我们还发现，压制动力蛋白轻链2型的表达抑制在肾小管上皮细胞纤维化过程中平滑肌肌动蛋白的表达，这可能是因为抑制动力蛋白轻链2型废除自分泌TGFBETA信号通路在肾脏纤维化过程中。
21、的激活。所以动力蛋白轻链路障2型的抑制将会是打击慢性说明书CN104189918A5/5页7肾脏病的一种有效的治疗。0058以上内容是结合具体/优选的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，其还可以对这些已描述的实施方式做出若干替代或变型，而这些替代或变型方式都应当视为属于本发明的保护范围。说明书CN104189918A1/3页8图1A图1B图1C说明书附图CN104189918A2/3页9图1D图2A说明书附图CN104189918A3/3页10图2B图2C说明书附图CN104189918A10。