新内酰胺类.pdf

本发明涉及式(I)和(II)的新内酰胺类。本发明还涉及这些化合物在治疗微生物感染和处理表面微生物污染(特别是以形成生物被膜为特征的感染和表面污染)中的用途。还提供被丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯基团取代的式(I)和(II)的化合物，且它们连接在表面或聚合物上以抑制微生物污染。

1.  式I的化合物：

其中：
R₁和R₂各自独立地选自氢、卤素、烷基、环烷基、烷氧基、氧代烷基、烯基、杂环基、杂芳基、芳基和芳基烷基；
R₃选自氢、羟基、烷基、环烷基、烷氧基、氧代烷基、烯基、杂环基、杂芳基、环烷基、芳基、芳基烷基和-C(O)CR₆＝CH₂；
R₄和R₅各自选自氢、芳基、杂环基、杂芳基和芳基烷基，条件是R₄和R₅中至少一个为氢；
R₆选自氢或甲基；
条件是R₁和R₂中至少一个选自杂环基、杂芳基、芳基和芳基烷基。

2.  式II的化合物：

其中
R₁和R₂各自独立地选自氢、卤素、烷基、环烷基、烷氧基、氧代烷基、烯基、杂环基、杂芳基、芳基和芳基烷基；
R₃选自氢、羟基、烷基、环烷基、烷氧基、氧代烷基、烯基、杂环基、杂芳基、芳基、芳基烷基、和-C(O)CR₆＝CH₂；
R₄选自氢、芳基、杂环基、杂芳基和芳基烷基；
R₆选自氢或甲基；
R₇选自H和-C(O)CR₆＝CH₂；
条件是R₁和R₂中至少一个选自杂环基、杂芳基、芳基和芳基烷基。

3.  根据权利要求1或权利要求2的化合物，其中R₄和R₅中的每一个均为氢。

4.  根据权利要求1-3中任一项的化合物，其中R₂选自杂环基、杂芳基、芳基和芳基烷基。

5.  根据权利要求1或权利要求2的化合物，其选自5-亚甲基-4-苯基-二氢-吡咯-2-酮、1-甲基-5-亚甲基-4-苯基-二氢-吡咯-2-酮、5-亚甲基-1，4-二苯基-二氢-吡咯-2-酮、4-(4’-溴苯基)-5-亚甲基-2-二氢-吡咯-2-酮、4-苄基-5-亚甲基-二氢-吡咯-2-酮、4-(4’-甲氧基苯基)-5-亚甲基-二氢-吡咯-2-酮、5-亚甲基-4-(4’-氟苯基)-二氢-吡咯-2-酮、5-亚甲基-4-(4’-三氟甲基苯基)-二氢-吡咯-2-酮、5-亚甲基-4-(3’-三氟甲基苯基)-二氢-吡咯-2-酮、5-亚甲基-4-(2’-氟苯基)-二氢-吡咯-2-酮和5-亚甲基-4-(3’-氟苯基)-二氢-吡咯-2-酮。

6.  治疗患者中微生物感染的方法，所述方法包括向所述患者给药根据权利要求1-5中任一项的化合物。

7.  根据权利要求6的方法，其中所述感染是细菌感染。

8.  根据权利要求6或权利要求7的方法，其中所述感染特征在于形成生物被膜。

9.  抑制表面的微生物污染的方法，所述方法包括向所述表面施用根据权利要求1-5中任一项的化合物。

10.  制剂，其包含根据权利要求1-5中任一项的化合物和载体。

11.  根据权利要求1的化合物，其中R₃为-C(O)CR₆＝CH₂。

12.  根据权利要求2的化合物，其中R₃和R₇中至少一个选自-C(O)CR₆＝CH₂。

13.  根据权利要求12的化合物，其中R₃和R₇中的每一个均选自-C(O)CR₆＝CH₂。

14.  用于形成低聚物或聚合物时的根据权利要求11-13中任一项的化合物。

15.  根据权利要求14的化合物，其中所述低聚物或聚合物通过所述化合物的末端乙烯基的聚合形成。

16.  聚合物或低聚物，其通过将权利要求11-13中任一项的化合物直接地或与一种或多种其他单体低聚或聚合而形成。

17.  根据权利要求11-13中任一项的化合物，其中所述化合物的末端乙烯基与官能团反应。

18.  连接于表面时的根据权利要求11-13中任一项的化合物。

19.  根据权利要求18的化合物，其中所述化合物通过所述化合物的末端乙烯基与官能团反应来与所述表面连接。

20.  表面，其包含连接于所述表面的根据权利要求11-13中任一项的一种或多种化合物。

新内酰胺类
发明领域
本发明涉及新内酰胺类、它们的合成方法及这些化合物的用途。
发明背景
在国际专利申请WO 2004/016588中(其公开内容被引入本文作为参考)，本发明的申请人公开了合成式A和B的内酰胺类的方法，其通过将合适的5-卤代亚甲基取代的呋喃酮与胺在温和条件下反应以得到通式A的内酰胺类，任选地接着脱水以得到通式B的内酰胺类。

WO 2004/016588的说明书中举例说明的每种内酰胺类均包括通常在R₃或R₄位的一个或多个溴取代基。R₁和R₂位被卤素、烷基(取代或未取代的)或氢取代。证明所述内酰胺类具有抗菌性并作为群体感应抑制剂(quorum sensing inhibitor)。
发明概述
本发明涉及在内酰胺环的3或4位上包含杂环基、杂芳基、芳基或芳基烷基取代基的一类新的内酰胺，且在其环外亚甲基上未溴化。相对于WO2004/016588中举例说明的化合物，所述环外亚甲基上无溴化改善了这些化合物的稳定性。此外，当与WO 2004/016588中举例说明的载有烷基的化合物相比时，在3或4位的杂芳基、芳基或芳基烷基取代基的存在提供了额外的体内稳定性。已证明这些化合物具有抗菌性。此外，当与WO2004/016588的说明书中举例说明的某些内酰胺类相比时，至少一些本发明的化合物具有令人惊讶的改善的抗菌活性和/或令人惊讶的降低的细胞毒性。本发明人还已发现这些化合物的类似物可被丙烯酸酯和异丁烯酸酯基团取代，从而这些化合物可易于聚合、共聚或通过例如迈克尔加成反应被连接至载有官能团的表面。
因此，第一方面，本发明提供式I的化合物：

其中：
R₁和R₂各自独立地选自氢、卤素、烷基、环烷基、烷氧基、氧代烷基、烯基、杂环基、杂芳基、芳基和芳基烷基；
R₃选自氢、羟基、烷基、环烷基、烷氧基、氧代烷基、烯基、杂环基、杂芳基、环烷基、芳基、芳基烷基和-C(O)CR₆＝CH₂；
R₄和R₅各自选自氢、芳基、杂环基、杂芳基和芳基烷基，条件是R₄和R₅中至少一个为氢；
R₆选自氢或甲基；
条件是R₁和R₂中至少一个选自杂环基、杂芳基、芳基和芳基烷基。
第二方面，本发明提供式(II)的化合物：

其中：
R₁和R₂各自独立地选自氢、卤素、烷基、环烷基、烷氧基、氧代烷基、烯基、杂环基、杂芳基、芳基和芳基烷基；
R₃选自氢、羟基、烷基、环烷基、烷氧基、氧代烷基、烯基、杂环基、杂芳基、芳基、芳基烷基和-C(O)CR₆＝CH₂；
R₄选自氢、芳基、杂环基、杂芳基和芳基烷基；
R₆选自氢或甲基；
R₇选自H和-C(O)CR₆＝CH₂；
条件是R₁和R₂中至少一个选自杂环基、杂芳基、芳基和芳基烷基。
第三方面，本发明提供治疗或预防患者的微生物感染的方法，所述方法包括向所述患者给药式I的化合物或式II的化合物。
第四方面，本发明提供抑制或预防表面的微生物污染的方法，所述方法包括向所述表面施用式I的化合物或式II的化合物。
第五方面，本发明提供包含式I的化合物或式II的化合物和载体的药物制剂。
第六方面，本发明提供式I的化合物，其中R₃为-C(O)CR₆＝CH₂。
第七方面，本发明提供式II的化合物，其中R₃和R₇中至少一个选自-C(O)CR₆＝CH₂。
优选地，R₃和R₇中的每一个均选自-C(O)CR₆＝CH₂。
第八方面，本发明提供用于形成低聚物或聚合物时的根据第六或第七方面的化合物。
第九方面，本发明提供通过将第六或第七方面的化合物直接地或与一种或多种其他单体低聚或聚合而形成的聚合物或低聚物。
第十方面，本发明提供所述化合物的末端乙烯基与官能团反应时的第六或第七方面的化合物。
第十一方面，本发明提供连接于表面时的第六或第七方面的化合物。
第十二方面，本发明提供表面，其包含连接于所述表面的第六或第七方面的一种或多种化合物。

附图简述
图1显示了在第5天用5.2×10⁶CFU/肺(1.3×10⁸CFU/ml)的绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)PAO1(wt)攻击后，两组小鼠间的肺细菌接种量。第一组用5-亚甲基-4-苯基-二氢-吡咯-2-酮(C219)以12μg/g体重处理，注射给药，每天2次，持续3天，第二组用载体处理。(p＝0.0008)。
发明详述
第一方面，本发明提供式I的化合物：

其中
R₁和R₂各自独立地选自氢、卤素、烷基、环烷基、烷氧基、氧代烷基、烯基、杂环基、杂芳基、芳基和芳基烷基；
R₃选自氢、羟基、烷基、环烷基、烷氧基、氧代烷基、烯基、杂环基、杂芳基、环烷基、芳基、芳基烷基和-C(O)CR₆＝CH₂；
R₄和R₅各自选自氢、芳基、杂环基、杂芳基和芳基烷基，条件是R₄和R₅中至少一个为氢；
R₆选自氢或甲基；
条件是R₁和R₂中至少一个选自杂环基、杂芳基、芳基和芳基烷基。
本发明还提供用于制备式I的化合物的原料。这些原料已被发现本身具有抗菌活性。
因此，第二方面，本发明提供式II的化合物：

其中
R₁和R₂各自独立地选自氢、卤素、烷基、环烷基、烷氧基、氧代烷基、烯基、杂环基、杂芳基、芳基和芳基烷基；
R₃选自氢、羟基、烷基、环烷基、烷氧基、氧代烷基、烯基、杂环基、杂芳基、芳基、芳基烷基和-C(O)CR₆＝CH₂；
R₄选自氢、芳基、杂环基、杂芳基和芳基烷基；
R₆选自氢或甲基；
R₇选自H和-C(O)CR₆＝CH₂；
条件是R₁和R₂中至少一个选自杂环基、杂芳基、芳基和芳基烷基。
优选地，R₄和R₅中的每一个均为氢。
优选地，R₂选自杂环基、杂芳基、芳基和芳基烷基。
在优选形式中，所述化合物选自实施例中列出的下述化合物：5-亚甲基-4-苯基-二氢-吡咯-2-酮、1-甲基-5-亚甲基-4-苯基-二氢-吡咯-2-酮、5-亚甲基-1，4-二苯基-二氢-吡咯-2-酮、4-(4’-溴苯基)-5-亚甲基-2-二氢-吡咯-2-酮、4-苄基-5-亚甲基-二氢-吡咯-2-酮、4-(4’-甲氧基苯基)-5-亚甲基-二氢-吡咯-2-酮、5-亚甲基-4-(4’-氟苯基)-二氢-吡咯-2-酮、5-亚甲基-4-(4’三氟甲基苯基)-二氢-吡咯-2-酮、5-亚甲基-4-(3’-三氟甲基苯基)-二氢-吡咯-2-酮、5-亚甲基-4-(2’-氟苯基)-二氢-吡咯-2-酮和5-亚甲基-4-(3’-氟苯基)-二氢-吡咯-2-酮。
第三方面，本发明提供治疗患者中的微生物感染的方法，所述方法包括向所述患者给药式I或式II的化合物。
所述微生物感染可以是细菌、原虫或真菌感染。优选地，所述感染为细菌感染。
在WO 2004/016588中公开了合适的给药方法，其公开内容在此引用作为参考。WO 2004/016588中还公开了可通过本发明的方法治疗的细菌感染类型的实例。
本发明的化合物可作为群体感应抑制剂。因此所述化合物在任何需要抑制群体感应的应用中有用。例如，本发明的化合物在经由抑制群体感应系统和/或其他细胞外系统而阻止微生物建立生物被膜和毒力表达方面有用(例如参见，WO 01/47681，其公开内容在此全部引入作为参考)。
群体感应通路(quorum sensing pathway)(例如涉及高丝氨酸内酯的那些)存在于许多细菌中。生物被膜的形成是群体感应的一个例子。
下述是革兰阴性菌的组的非穷举的列表，它们使用高丝氨酸内酯进行细胞间通信，例如：直线的、弯曲的或螺旋状的革兰氏阴性杆菌；拟杆菌科；立克次体属与衣原体属；异化型硫酸盐或硫还原菌；支原体；分枝杆菌；出芽和/或附属细菌(Budding and/or Appendaged Bacteria)；有鞘细菌；诺卡氏菌型(Nocardioform)和放线菌。参见Bergey′s Manual of SystematicBacteriology，第一版，John G.Holt主编(1984)，在此引入作为参考。
可通过本发明的化合物治疗的更多的微生物感染包括由金黄色葡萄球菌(Staph.Aureus)、表皮葡萄球菌(Staph epidermis)、沙雷菌(Serratia spp.)、弧菌(Vibrio spp.)和肺炎链球菌(Strep.pneumonia)引起的细菌感染；由棘阿米巴属(Acanthamoeba)引起的原虫感染和由镰刀菌(Fusarium spp.)引起的真菌感染。
优选地，第三方面的方法可用于治疗或预防患者中的以形成生物被膜为特征的微生物感染。
本发明适于源自单一类型微生物的生物被膜和适于混合性生物被膜。“混合性生物被膜”意指由超过一种的微生物产生的生物被膜。想象混合性生物被膜可由至少两种由细菌、藻类、真菌和原虫组成的微生物产生。
涉及生物被膜的人类感染的非限制性的实例包括龋病、牙周炎、中耳炎、骨骼肌感染(muscular skeletal infection)、坏死性筋膜炎、胆道感染、骨髓炎、细菌性前列腺炎、天然瓣膜心内膜炎、囊胞性纤维化肺炎、类鼻疽(meloidosis)，以及医院交叉感染如ICU肺炎、尿管膀胱炎、腹膜透析(CAPD)腹膜炎和胆道支架阻塞。生物被膜的形成会影响缝合、出口位点、动静脉位点、巩膜扣带、接触镜、IUDs、气管导管、希克曼导管、中心静脉导管、人工心脏瓣膜、人造血管、矫形外科装置、阴茎假体。在Costerton J等人(1999)，第284卷，Science，第1318-1322页以及Costerton J和Steward，(2001)Battling Biofilms，Scientific American，第75-81页中描述了更多应用，其公开内容在此引入作为参考。
可形成生物被膜的其他位置包括可导致牙周病和牙洞的牙菌斑，可导致眼感染的接触镜、可导致慢性感染的耳和可导致肺炎的肺。
感染可以是囊性纤维化病。所述感染可由皮肤感染、烧伤感染和/或伤口感染引起。本发明的方法和组合物可特别适于治疗免疫受损的个体中的感染。
已证明本发明的化合物在防止表面的微生物污染方面特别有效，尤其是预防生物被膜的形成。
因此，第四方面，本发明提供抑制表面的微生物污染的方法，所述方法包括向所述表面施用式I或式II的化合物。
所述微生物污染可以是原虫、真菌或细菌污染。
在优选形式中，所述微生物污染是细菌污染。在更优选的形式中，所述细菌污染是生物被膜。
所述表面可以是任何天然或人工表面。“人工表面”意指任何非天然存在的表面。在一个实施方案中，所述表面不是人类或动物的外表面(如皮肤)或内表面。在另一实施方案中，所述表面是人类或动物的外表面或内表面。在WO 2004/016588中公开了可使用式I或式II的化合物处理的表面的实例。
所述化合物可通过任何合适的方式施用。例如，可采用描述于WO2004/016588中的技术和表面将所述化合物连接于表面上。
合适的表面包括需要防止细菌污染的物品的表面。这些包括：医疗装置，例如可植入的生物医学装置如尿管、经皮进入的导管、支架、矫形植入物、骨和牙烤瓷和聚合物以及不可植入的装置例如接触镜、接触镜储存盒等。
其他合适的表面包括用于分送油和气体的管道和导管的内部。输油管的内表面会易于被生物被膜污染，所述生物被膜阻碍管道中油的流动并因此降低其效率。
形成所述物品的材料可以是金属、陶瓷、固体合成的聚合物或固体天然的聚合物，例如固体生物聚合物。本发明有用的材料的实例是钛、羟磷灰石、聚乙烯(其为矫形植入物的有用材料)、聚氨基甲酸酯类、有机硅氧烷聚合物、全氟化聚合物(其为例如导管、软组织增加物和血液接触装置如心脏瓣膜的有用材料)、丙烯酸水凝胶聚合物、HEMA/GMA聚合物和硅/硅氧烷水凝胶聚合物(例如应用于接触镜和眼内透镜)等，以及它们的任意组合。还包括的是树脂复合物、部件(componer)和用于口腔护理的树脂改性的玻璃离子交联聚合物。这些材料的表面可以是化学惰性的或含有反应官能团。
物品的更多实例包括意欲储存的档案文件、古董和艺术品、稀有贵重的种子(如：保藏团体的种子库)等，在此情况下基质可以是纸、材料或其他天然材料或合成材料。
所述物品可以是水生贝壳类动物或水产养殖仪器，例如WO 99/05227中描述的，其公开内容在此引入作为参考。
所述物品的表面可为任何硬表面如金属、有机和无机聚合物表面、天然和合成弹性体、板材、玻璃、木材、纸、混凝土、岩石、大理石、石膏和陶瓷材料，其任选地涂敷例如油漆、釉质等；或者为任何软表面如任意种类的纤维(纱、纺织品、植物纤维、石棉、头发等)；或者为多孔表面；皮肤(人类或动物)；角质材料(指甲等)。所述硬表面可存在于加工设备或冷却设备的部件中，例如冷却塔、水处理设备、奶品场、食品加工设备、化学或制药加工设备。多孔表面可存在于过滤器如膜滤器中。
其表面可根据本发明处理的物品的具体实例包括，但不限于：抽水马桶、浴盆、排水沟、高脚椅、柜台面、蔬菜、肉加工室、肉市、食物准备区、风筒、空调、地毯、纸或针织产品处理、尿布(手巾)、个人卫生产品(如卫生巾)和洗衣机。可将化合物配制成用于预防和除去粪便的厕所滴入或喷射装置的形式，以及配制厕所座圈清洁剂的形式。本发明的化合物还具有清洁工业表面如地板、台阶、墙壁等，以及这些和医疗机构如医院(如手术室)、兽医院、停尸房及殡仪馆中的其他表面的应用。
可被处理的表面的更多实例包括硬的刚性表面，如排水管、釉面的陶瓷、瓷器、玻璃、金属、木材、铬、塑料、乙烯树脂和胶木或软的柔韧表面如淋浴帘、室内装饰品、待洗的衣服及地毯。还预想针织和非针织以及多孔和非多孔表面都将是合适的。
可通过任何合适的方式施用所述化合物。例如可采用WO 2004/016588中描述的技术和表面使所述化合物与所述表面连接。实例包括通过例如将所述化合物与其他单体共聚或通过本领域技术人员熟知的技术将所述化合物连接至聚合物骨架上来提供作为低聚物或聚合物的一部分的本发明的化合物。
将有机分子共价固定在固体表面上的方法是本领域技术人员熟知的。导致共价界面的键的界面反应基于熟知的有机合成反应。固定反应的选择取决于特别应用所需的基质材料的性质和本发明化合物的化学组成。
例如，可利用类似于在Li等人，Surface Modification of PolymericBiomaterials(BD Ratner和DG Castner编辑)，Plenum Press，NY，1996，第165-173页(其公开内容全部在此引入作为参考)中描述的将多糖固定在环氧化的表面上的反应路径的环氧化物化学，通过将异氰酸根基团经热方法与表面连接以生成稳定的氨基甲酸乙酯键，或经表面上的羧酸基团或它们的等价物如酰基氯生成酯键来将在环系统远端侧链含有羟基的化合物共价连接在表面上。可利用还原氨化反应将含有醛基的化合物连接至表面胺基团上。可利用碳二亚胺化学将含有羧酸基团的化合物连接至表面胺基团上。
界面偶联反应的选择当然必须不仅考虑其获得所需共价键的能力，而且要避免对要连接的呋喃酮化合物的不利影响。特别地，呋喃酮环系统在碱性条件下趋向于不稳定。这样的限制是本领域技术人员熟知的。在本领域已知的许多可能的界面偶联反应中，在合适的pH范围内并与被多种官能团在多个位置取代的呋喃酮进行反应有充分的选择范围。
一些固体基质材料具有能与化合物上的配对基团(partner group)进行化学反应的反应表面化学基团，从而直接形成共价的界面连接。
可选地，原位共价连接可直接通过在合适的化合物存在下将双官能化的连接分子加至活性表面上制得，或者通过分步相继加入双官能化的连接分子和其后的合适的化合物制得。不是总有可能将呋喃酮化合物直接固定在固体基质材料上；在这些情况下，表面活化或者一个或多个界面键合层被用于实现所述化合物的共价固定。
固体基质材料的表面活化可通过许多方法实现。实例是电晕放电处理或聚合物的低压等离子体处理。这些是熟知的将许多官能团引入至聚合物表面上的方法。
另一方法是提供散置在固体基质材料或医学装置和化合物层之间的界面键合层。可采用如浸涂、旋涂或等离子体聚合的方法完成薄界面键合层的施加。选择键合层的化学以使在该层表面上提供合适的反应化学基团，所述基团接着可进行与本发明的化合物的反应。
特别通用的是连续施加多层薄界面键合层；该方法可在表面上提供非常宽范围的期望的化学基团，用于固定宽范围的官能化的呋喃酮并能使用对于他们的生物效能最优化的化合物。
通过提供化合物的薄的、表面涂布层，本发明的抗菌装置的光学性质未被降低，这使得本发明适用于透明的眼科装置，例如接触镜和眼内透镜。
本发明提供薄表面涂层，其在施加该涂层的固体材料上提供抗菌性质和/或抗真菌性质。更具体地，所述涂层可被设计成降低或预防生物医学装置的细菌建群，当这样的装置被细菌建群时，引起对生物医学装置的人类用户的健康的不良反应。
可选地，所述化合物可按制剂的形式施用。
因此，第五方面，本发明提供包含式I或式II的化合物和载体的制剂。
在WO 2004/016588中公开了可与式I或式II的化合物使用的载体类型的实例。
所述制剂可为任何合适的形式。所述制剂可包含载体或稀释剂。所述载体可为液体或固体。例如，组合物可为至少一种化合物在液体中的溶液剂或混悬剂的形式。液体可为含水溶剂或非水溶剂。所述液体可由一种或多种有机溶剂组成或包含一种或多种有机溶剂。所述液体可为离子液体。载体或稀释剂的具体实例包括但不限于水、聚乙二醇、丙二醇、环糊精及它们的衍生物。
所述组合物可被制剂成以气雾剂或粉末形式递送。
所述组合物可包括有机或无机聚合物质。例如，本发明的化合物可与聚合物混合，或结合或吸附在聚合物上。
当所述组合物被制剂成消毒剂或清洁制剂时，所述组合物可包括用于这样的制剂的常规添加剂。所述制剂的物理形式的非限制性的实例包括散剂、溶液剂、混悬剂、分散剂、乳剂和凝胶剂。
本发明的化合物可被掺入表皮绷带和洗剂中。可选地，本发明的化合物可被掺入化妆品制剂中，例如：剃须后洗剂、皮肤乳膏剂、除臭剂和去屑洗发剂。
本发明的组合物可为含有清洁有效量的上述活性化合物的水溶液剂或混悬剂形式。清洁组合物可为用于预防、去除和清洁厕所以及家庭或工业环境中的其他潮湿的或间歇潮湿的表面的喷雾剂、可分配液体或厕所槽滴入、座圈产品的形式。
本发明的组合物还可包含选自阴离子型、非离子型、两性、生物表面活性剂及它们的混合物的表面活性剂。最优选地，所述表面活性剂是十二烷基硫酸钠。
可将一种或多种辅剂化合物加至本发明的清洁溶液剂中。它们可选自杀虫剂、杀真菌剂、抗生素及其混合物中的一种或多种以影响浮游生物。也可加入pH调节剂、香料、染料或着色剂。此外，所述辅剂可为细胞渗透剂如EDTA或FDS。
在优选形式中，“清洁有效量的活性化合物”表示当与没有接触活性化合物的生物被膜相比时，通过生物被膜内细菌数目下降所确定的从生物被膜中去除至少10％的细菌所需的化合物的量。
优选地，所述制剂为药物制剂。
药物用途的制剂可引入本领域技术人员已知的药学可接受的载体、稀释剂和赋形剂。制剂可被配制用于肠胃外或非注射给药。用于可被配制的制剂的引入方法包括，但不限于局部、皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外、眼和口服途径。它们可被配制用于通过任何方便的途径给药，例如通过输注或快速浓注、通过经上皮或皮肤粘膜内层(例如口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)吸收，并可与其他生物学活性剂共同给药。给药可以是局部的或全身性的。所述制剂可被配制用于心室内和鞘内注射。
也可应用肺部给药，例如通过使用吸入器或喷雾器，并与雾化剂配制。
在某些优选的实施方案中，所述制剂还包含其他活性剂例如抗生素和清洁剂。
在本发明的其他实施方案中，所述制剂可被配制为牙膏、漱口水或用于治疗龋齿的组合物。所述组合物可被配制用于痤疮治疗或接触镜清洁和灭菌(例如作为盐水溶液)。
本发明人还已设计被乙烯基官能化的式I和式II的化合物的类似物的制备方法。所述乙烯基使得官能化的化合物易于被引入聚合物和/或连接至表面。
因此，第六方面，本发明提供式I的化合物，其中R₃为-C(O)CR₆＝CH₂。
此外，第七方面，本发明提供式II的化合物，其中R₃和R₇中至少一个选自-C(O)CR₆＝CH₂。
第八方面，本发明提供用于形成低聚物或聚合物时的第六或第七方面的化合物。
优选地，所述低聚物或聚合物通过第六或第七方面的化合物的末端乙烯基聚合形成。
第九方面，本发明提供通过将第六或第七方面的化合物直接地或与一种或多种其他单体低聚或聚合而形成的聚合物或低聚物。
所述一种或多种其他单体可为任何合适的聚合物共聚单体，例如丙烯酸酯如烷基、羟烷基、氨基烷基或取代的芳基丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯、巴豆酸酯、取代或未取代的丙烯腈、乙烯醇或乙酸酯(acteate)和苯乙烯。
第六和第七方面的化合物的乙烯基可与其他不饱和系统聚合或反应。还可通过例如迈克尔加成与其他官能团反应。乙烯基与官能团反应以形成共价键的其他方法是本领域技术人员熟知的。
因此，第十方面，本发明提供所述化合物的末端乙烯基与官能团反应时的第六或第七方面的化合物。
所述官能团可为例如胺或硫醇基团。优选地，所述反应与胺进行。更优选伯胺。
预期包含连接其上的第六或第七方面的化合物的表面会防止或抑制所述表面被细菌建群。
因此，第十一方面，本发明提供连接于表面时的第六或第七方面的化合物。
如上所述，在WO 2004/016588中详述了可连接本发明的化合物的适合表面。在优选形式中，所述表面是接触镜的表面。
优选地，第六或第七方面的化合物通过化合物的末端乙烯基与官能团的反应连接于表面。
更优选地，所述官能团是伯胺。
第十二方面，本发明提供表面，其包含与所述表面连接的一种或多种式II的化合物。
术语“烷基”意指直链和支链烷基基团，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基等。优选地，所述烷基为1-10个碳原子的低级烷基，更优选1-6个碳原子。
在某些实施方案中，烷基的碳链被一个或多个杂原子间隔。例如，式-(CH₂CH₂O)_nH的聚乙二醇基团被理解为这样的实施方案的烷基。
本文所用的术语“环烷基”指的是环状烃基。适合的环烷基包括但不限于环丙基、环丁基和环己基。
术语“烷氧基”表示直链或支链烷氧基，优选C_1-10烷氧基。实例包括甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基和不同的丁氧基异构体。
术语“烯基”包括由直链、支链或单环或多环烯烃和多烯形成的基团。取代基包括如先前定义的单或多不饱和烷基或环烷基，优选C_2-10烯基。烯基的实例包括乙烯基、烯丙基、1-甲基乙烯基、丁烯基、异丁烯基、3-甲基-2-丁烯基、1-戊烯基、环戊烯基、1-甲基-环戊烯基、1-己烯基、3-己烯基、环己烯基、1-庚烯基、3-庚烯基、1-辛烯基、环辛烯基、1-壬烯基、2-壬烯基、3-壬烯基、1-癸烯基、3-癸烯基、1，3-丁二烯基、1，4-戊二烯基、1，3-环戊二烯基、1，3-己二烯基、1，4-己二烯基、1，3-环己二烯基、1，4-环己二烯基、1，3-环庚二烯基、1，3，5-环庚三烯基或1，3，5，7-环辛四烯基。
本文所用的术语“炔基”指的是含有一个或多个三键的直链或支链烃基。适合的炔基包括，但不限于乙炔基、丙炔基、丁炔基、戊炔基和己炔基。
术语“卤素”包括氟、氯、溴或碘，优选溴或氟。
术语“杂原子”表示O、N、S或Si。
单独使用或在合成词例如“酰氧基”、“酰基硫基”、“酰氨基”或“二酰氨基”中使用的术语“酰基”表示烷酰基、芳酰基、杂酰基(heteroyl)、氨基甲酰基、烷氧羰基、烷基磺酰基、芳基磺酰基，且优选为C_1-10烷酰基。酰基的实例包括氨基甲酰基；直链或支链烷酰基，例如甲酰基、乙酰基、丙酰基、丁酰基、2-甲基丙酰基、戊酰基、2，2-二甲基丙酰基、己酰基、庚酰基、辛酰基、壬酰基、癸酰基；烷氧羰基，例如甲氧羰基、乙氧羰基、叔丁氧羰基、叔戊氧羰基或庚氧羰基；环烷基羰基例如环丙烷羰基、环丁烷羰基、环戊烷羰基或环己烷羰基；烷基磺酰基，例如甲磺酰基或乙磺酰基；烷氧基磺酰基，例如甲氧基磺酰基或乙氧基磺酰基；杂环基烷基羰基；杂环基烷酰基，例如吡咯烷基乙酰基、吡咯烷基丙酰基、吡咯啉基乙酰基、吡咯基乙酰基、吡咯烷基丁酰基、吡咯烷基戊酰基、吡咯烷基己酰基或噻唑烷基乙酰基；杂环基烯酰基(heterocyclyl alkenoyl)，例如杂环基丙烯酰基、杂环基丁烯酰基、杂环基戊烯酰基或杂环基己烯酰基；或者杂环基乙醛酰基，例如噻唑烷基乙醛酰基或吡咯烷基乙醛酰基。
术语“芳基”指的是具有6-10个碳原子的芳基基团且包括例如苯基、萘基、茚基。优选地，所述芳基为苯基或萘基。
术语“芳基烷基”包括例如苄基和苯乙基的基团，其包含带有芳基取代基的烷基链。
术语“杂环基”包括单环、多环、稠合或共轭的烃残基，优选C3-6，其中一个或多个碳原子(当适合的情况下，氢原子连接其上)被杂原子取代从而提供非芳香性的残基。适合的杂原子包括O、N和S。当两个或更多个碳原子被取代时，可被两个或更多个相同的杂原子或不同的杂原子取代。杂环基团的适合实例包括吡咯烷基(pyrollodinyl)、哌啶基、哌嗪基、吗啉代、喹啉基、异喹啉基、硫代吗啉代、二噁烷基、四氢呋喃基、四氢吡喃基和四氢吡咯基。
术语“杂芳基”包括含有一个或多个选自O、N和S的杂原子的5-或6-元杂芳环。杂芳基的适合实例包括四唑基、1，2，3-三唑基、1，2，4-三唑基、咪唑基(imiidazolyl)、吡唑基、吡啶基、嘧啶基、噁唑基和噁二唑基。
每个烷基、环烷基、烷氧基、氧代烷基、烯基、杂环基、杂芳基、芳基和芳基烷基可任选地被一个或多个选自烷基、环烷基、烯基、炔基、芳基、芳基烷基、杂环基、杂芳基、卤素、羧基、卤代烷基、卤代炔基、羟基、取代或未取代的烷氧基、烯氧基、卤代烷氧基、卤代烯氧基、硝基、氨基、硝基烷基、硝基烯基、硝基炔基、硝基杂环基、烷基氨基、二烷基氨基、烯基胺、炔基氨基、酰基、烯酰基、炔酰基、酰氨基、二酰氨基、酰氧基、烷基磺酰氧基、杂环基、杂环氧基、杂环氨基、卤代杂环基、烷基亚磺酰基、烷基羰基氧基、烷硫基、酰基硫基、含磷的基团例如膦酰基和氧膦基的基团取代。
为了可能更清楚地理解本发明的本质，现将其优选形式参考以下非限制性的实施例进行描述。
实施例
1.化合物合成
一般步骤：
反应路线：

3-苯基-4-氧代-2-戊烯酸的合成
将乙酮酸(glyoxilic acid)(42.3g；0.45mol)、苯基丙酮(40.2g；0.3mol)和磷酸(30ml；85％)共同在75-80℃下加热5小时，之后将该混合物在室温下放置冷却过夜。将深色的反应混合物倒入盐水(100ml)中并用CH₂Cl₂∶Et₂O(1∶1；v/∶v)萃取(3×50ml)。合并的萃取液用盐水洗涤三次，干燥(Na₂SO₄)并真空蒸发至棕色浆状油(50g)。将此浆状物再溶于二氯甲烷(100ml)中并用饱和碳酸氢钠萃取(3×65ml)。干燥(Na₂SO₄)有机相并蒸发得到作为浆状油的5-羟基-5-甲基-4-苯基-2(5H)呋喃酮，其在放置时固化(3.3g；6％)。从CH₂Cl₂/石油醚中得到无色晶体，熔点105-107℃。
用2M盐酸酸化合并的碳酸氢钠溶液，并用CH₂Cl₂萃取(3×40ml)。用盐水洗涤二氯甲烷萃取液、干燥(Na₂SO₄)并蒸发得到作为浅黄色油的3-苯基-4-氧代-2-戊烯酸，其在冰箱中放置固化(41g；72％)。从石油醚/CH₂Cl₂中得到无色晶体，熔点70℃。
反应路线：

路线1：5-亚甲基-4-苯基-二氢-吡咯-2-酮的合成
将该酸(4.57g；0.024mol)溶于亚硫酰氯(20ml)中并加热回流1.5小时。在真空下除去过量的亚硫酰氯，将可能为5-氯-5-甲基-4-苯基-2(5H)呋喃酮的残留的油(5.0g)溶解在二氯甲烷(10ml)中并在冰浴中冷却。经1小时期间滴加浓氨水(15M，20ml)并将反应混合物在室温下搅拌过夜。用乙酸乙酯萃取(3×20ml)该混合物并干燥(硫酸钠)合并的有机相和用硅胶短柱闪蒸色谱(EtOAc∶CH₂Cl₂；1∶1)地得到作为浅棕色固体的5-羟基-5-甲基-4-苯基)-二氢-吡咯-2-酮(2.83g；62.4％)。
在室温下将在二氯甲烷(20ml)中的二氢-吡咯酮(0.50g；2.65mmol)和P₂O₅(0.50g；3.52mmol)搅拌30分钟直至所有吡咯酮溶解。将该混合物通过硅藻土/二氧化硅床过滤；并用CH₂Cl₂/EtOAc(1∶1)洗涤。蒸发合并的滤液和洗涤液得到作为浅黄色固体的5-亚甲基-4-苯基-2(5H)-吡咯酮(0.34g；75％)。
1-甲基-5-亚甲基-4-苯基-二氢-吡咯-2-酮的合成

将该酸(0.25g：1.32mmol)与SOCl₂(10ml)加热回流3小时。在真空下除去过量的亚硫酰氯并将残留物溶解在二氯甲烷中(20ml)。将残留物在冰浴中冷却并经10分钟期间加入甲胺水溶液(10ml；24％)。混合物在室温下搅拌过夜。分离有机相，经无水硫酸钠干燥，在真空下蒸发溶剂得到半固体(0.25g)，将其用EtOAc作为洗脱液进行层析得到作为无色固体的1，5-二甲基-5-羟基-4-苯基-2(5H)吡咯酮(0.21g；79％)，熔点148-152℃。
将醇溶解在二氯甲烷(10ml)中并与P₂O₅(1g)搅拌1小时。混合物通过硅藻土/二氧化硅床过滤；并用CH₂Cl₂/EtOAc(1∶1)洗涤。蒸发合并的滤液和洗涤液并用EtOAc/CH₂Cl₂(1∶19)层析得到作为无色固体的1-甲基-5-亚甲基-4-苯基-2(5H)吡咯酮(0.24g；49％)。¹H NMRδ(CDCl₃)：7.42-7.44(m，5H，ArH’s)；6.21(s，1H，C3-H)和3.18(s，3H，N-Me)。
5-亚甲基-1，4-二苯基-二氢-吡咯-2-酮的合成

将5-羟基-5-甲基-4-苯基-2(5H)呋喃酮(0.20g；1.05mmol)加至在甲苯(7ml)中的苯胺(2ml)溶液中。伴随搅拌，将该混合物加热回流24小时。冷却至室温后，将乙酸乙酯(20ml)加至混合物中并将该混合物用HCl(2M)洗涤。在真空下蒸发溶剂并使用CH₂Cl₂/EtOAc(19∶1)作为洗脱剂层析得到5-羟基-5-甲基-1，4-二苯基-2(5H)吡咯酮(0.12g；44％)。
将上述化合物与少量p-TSOH晶体在甲苯溶液中加热回流0.5小时。冷却混合物并进行色谱纯化得到5-亚甲基-1，4-二苯基-二氢-吡咯-2-酮(0.05g)。
5-亚甲基-4-(4’-氟苯基)-二氢-吡咯-2-酮的合成

将该酸(1.5g；6.74mmol)溶解在亚硫酰氯(10ml)中并加热回流3小时。在真空下去除过量亚硫酰氯，将残留油(1.8g)溶解在二氯甲烷(20ml)中并在冰浴中冷却。在1小时内滴加少量乙酸铵晶体，接着滴加浓氨水(15M，15ml)，并将反应混合物在室温下搅拌过夜。将混合物用乙酸乙酯(3×20ml)萃取，干燥(硫酸钠)合并的有机相并蒸发得到5-羟基-5-甲基-4(4’-氟-苯基)-二氢-吡咯-2-酮(0.70g)浅棕色固体。¹H NMR：δ(CDCl₃)：7.78-7.83，2H，m，ArH’s)；7.1-7.14(2H，t，Ar H’s)；6.67(s，1H，-NH)；6.10-6.11(d，1H，C3-H)；3.65(br，1H，-OH)。
将该内酰胺(0.18g；0.87mmol)溶解在干燥二氯甲烷中(10ml)并在冰浴中冷却，同时滴加BF₃.Et₂O(0.15ml)。将该混合物在冰中搅拌1小时，接着在室温下搅拌过夜。在真空下蒸发该溶液。将残留物再溶解在CH₂Cl₂中，用水洗涤并在硫酸钠上干燥。在真空下蒸发溶剂得到作为浅棕色固体5-亚甲基-4-(对氟苯基)-2(5H)吡咯酮(0.15g；91％)。¹H NMR：δ(CDCl₃)：7.40-7.46(2H，m，Ar H’s)；7.18(2H，m，Ar H’s)；6.25(s，1H，C3-H)；5.06(d，1H，C5＝CH2)和5.31(d，1H，C5＝CH₂)。
4-(4’-溴苯基)-5-亚甲基-2(5H)吡咯酮的合成

将4-(4’-溴苯基)-5-羟基-5-甲基-2(5H)吡咯酮(0.17g；0.63mmol)和P₂O₅(0.50g)在二氯甲烷(20ml)中的混合物在室温下搅拌45分钟直到所有的吡咯酮已溶解。用二氯甲烷稀释该混合物并通过硅藻土/二氧化硅床过滤。用CH₂Cl₂/EtOAc(1∶1)洗涤该硅藻土床，蒸发合并的滤液和洗涤液并层析得到作为浅黄色固体的4-(4’-溴苯基)-5-亚甲基-2(5H)吡咯酮(0.06g；35％)，熔点200℃(分解)。¹H NMR：δ(CDCl₃)：8.3(s，1H，NH)；7.57-7.6(d，2H，Ar H’s)；7.29-7.32(d，2H；Ar H’s)；6.23(s，1H，C3-H)；5.15(d，1H，C5＝CH₂)和4.95(d，1H，C5＝CH₂)。
4-(4’-甲氧基苯基)-5-亚甲基-2(5H)吡咯酮的合成

将5-羟基-5-甲基-4-(4’-甲氧基苯基)-2(5H)吡咯酮(0.15g；0.68mmol)和P₂O₅(1g；7mmol))在干燥二氯甲烷(10ml)中的混合物在室温下搅拌0.5小时，在此期间该内酰胺溶解。用二氯甲烷(20ml)稀释该混合物，通过硅藻土/二氧化硅垫过滤。在真空下去除溶剂，残留物通过层析得到作为黄色晶状固体的4-(4’-甲氧基苯基)-5-亚甲基-2(5H)吡咯酮(0.61g；44％)。¹H NMRδ(CDCl₃)8.54(brs；，-NH)；7.40(2H，d，Ar H’s)；6.95-6.98(2H，d，Ar H’s)；6.16(1H，s，C3-H)5.029d，1H，C5＝CH₂)；5.15(d，1H，C5＝CH₂)和3.85(3H，s，OMe)。
4-苄基-5-亚甲基-二氢-吡咯-2-酮的合成

将该酸(3.5g；0.017mol)溶解在亚硫酰氯(20ml)中并加热回流0.5小时。在真空下除去过量亚硫酰氯，将残留油(2.86g)溶解在二氯甲烷(20ml)中并在冰浴中冷却。在1小时内滴加氨水(15M，7ml)并将反应混合物在室温下搅拌过夜。用乙酸乙酯萃取(3×20ml)该混合物，干燥(硫酸钠)合并的有机相并蒸发。层析由此生成的棕色油，得到作为无色固体的5-羟基-5-甲基-4-苄基-二氢-吡咯-2-酮(0.45g)。
将二氢-吡咯酮(0.45g)和P₂O₅(0.50g)在二氯甲烷中(20ml)的混合物在室温下搅拌30分钟直到所有的吡咯酮已溶解。通过硅藻土/二氧化硅床过滤混合物；用CH₂Cl₂/EtOAc(1∶1)洗涤。蒸发合并的滤液和洗涤液得到作为浅黄色固体的4-苄基-5-亚甲基-2(5H)-吡咯酮(0.17g；42％)。¹H NMRδ(CDCl₃)：8.66(brs；1H，NH)；7.18-7.31(5H；m，Ar H’s)；5.80(s，1H，C3-H)；4.90-4.95(d，2H，C5＝CH₂)和3.78(s，2H，-CH₂Ph)。
通过上述的一般合成方法学还制备了表1的化合物。
表1

式I和II的化合物的丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯衍生物的合成
5-羟基-5-甲基-4-苯基-二氢-吡咯-2-酮的甲基丙烯酸酯衍生物的制备
5-甲基-5-(2’-甲基丙-2-烯酰氧基)-4-苯基-二氢吡咯-2-酮和5-甲基-1-(2’-甲基丙-2-烯酰基)-(2’-甲基丙-2-烯酰氧基)-4-苯基-二氢吡咯-2-酮

向在干燥二氯甲烷(20ml)中的假酸内酰胺的悬浮液(020g；1.06mmol)中加入三乙胺(1.5ml；10.76mmol)，并在冰浴中冷却搅拌。在15分钟内滴加在干燥CH₂Cl₂(3ml)中的甲基丙烯酰氯溶液(1ml；9.56mmol)。将混合物在该温度下搅拌2小时。用CH₂Cl₂/石油醚(2∶1)闪式柱层析得到作为粘稠黄色油的甲基丙烯酰酯(0.25g；92％)。
5-甲基-5-(2’-甲基丙-2-烯酰氧基)-4-苯基-二氢吡咯-2-酮
¹H NMRδ(CDCl₃)：7.85(m，2H，Ar H’s)；7.489(m，3H，Ar H’s)；6.32(1H，s，C4-H)；5.41(s，1H，-NH)；5.36(s，1H，＝CH₂)；5.25(s，1H，＝CH₂)；2.06(s，3H，Me)和2.0(s，3H，C5-Me).
5-甲基-1-(2’-甲基丙-2-烯酰基)-5-(2’-甲基丙-2-烯酰氧基)-4-苯基-二氢吡咯-2-酮.
¹H NMRδ(CDCl₃)：7.64-7.67(m，2H，Ar H’s)；7.44-7.47(m，3H，Ar H’s)；6.48(1H，s，C4-H)；6.23(s，1H，＝CH₂)；5.66(d，1H，＝CH₂)；5.32(d，2H，＝CH₂)；2.1(s，3H，Me)和2.0(s，3H，C5-Me)，1.90(s，3H，C5-Me).
5-羟基-5-甲基-4-苯基-二氢-吡咯-2-酮的丙烯酸酯衍生物的制备
5-甲基-5-(丙-2-烯酰氧基)-4-苯基-二氢吡咯-2-酮和5-甲基-1-(丙-2-烯酰基)-5-(丙-2-烯酰氧基)-4-苯基-二氢吡咯-2-酮

向在干燥CH₂Cl₂(10ml)和干燥THF(1ml)中的假酸内酰胺(0.23g；1.22mmol)溶液中加入三乙胺(1.5m；1076mmol)和少量对苯二酚晶体，在冰浴中搅拌并冷却。在10分钟内滴加在干燥CH₂Cl₂(3ml)中的丙烯酰氯(1ml；9.56mmol)溶液。将该混合物继续搅拌3小时。在约30℃真空下除去溶剂，残留的半固体用CH₂Cl₂闪式柱层析得到作为浅黄色固体的丙烯酸酯(0.21g；75％)。
5-甲基-5-(丙-2-烯酰氧基)-4-苯基-二氢吡咯-2-酮
¹H NMRδ(CDCl₃)：7.88(m，2H，Ar H’s)；7.48(m，3H，Ar H’s)；6.62(d，1H，＝CH₂)；6.34(1H，s，C4-H)；5.95(dd，1H，＝CH)；5.30(s，1H，＝CH₂)1.92(s，3H，C5-Me).
5-甲基-1-(丙-2-烯酰基)-5-(丙-2-烯酰氧基)-4-苯基-二氢吡咯-2-酮
¹H NMRδ(CDCl₃)：7.65(m，2H，Ar H’s)；7.43-7.60(m，4H，Ar H+CH2)；6.46-6.53(m，3H，＝CH₂和C3-H)；6.13-6.16(dd，1H，-CH-)；5.8-6.0(m，2H，＝CH₂)和2.1(s，3H，C5-Me)。
5-亚甲基-4-苯基-二氢-吡咯-2-酮的甲基丙烯酸酯衍生物的制备
5-亚甲基-1-(2’-甲基丙-2-烯酰基)-4-苯基-二氢吡咯-2-酮的合成

将三氟乙酸(1.5ml)加至在二氯甲烷中的5-甲基-1-(2’-甲基丙-2-烯酰基)-5-(2’-甲基丙-2-烯酰氧基)-4-苯基-二氢吡咯-2-酮(1.45g，4.46mmol)溶液中。将该混合物在室温下搅拌2小时，并接连用饱和碳酸氢钠溶液和水洗涤。分离二氯甲烷层，经硫酸钠干燥并在硅胶柱上用二氯甲烷作为洗脱液层析得到作为无色颗粒的5-亚甲基-1-(2’-甲基丙-2-烯酰基)-4-苯基-二氢吡咯-2-酮(0.64g，60％)。
¹H NMRδ(CDCl₃)：7.48(m，5H，Ar H’s)；6.23(s，1H，＝CH₂)；6.14(1H，s，C4-H)；5.55(bs，1H，＝CH₂)；5.36(s，1H，＝CH₂)。
5-亚甲基-4-苯基-二氢-吡咯-2-酮的丙烯酸酯衍生物的制备
5-亚甲基-1-(丙-2-烯酰基)-4-苯基-二氢吡咯-2-酮的合成

将三氟乙酸(1.0ml)加至在二氯甲烷(9ml)中的5-甲基-1-(丙-2-烯酰基)-5-(丙-2-烯酰氧基)-4-苯基-二氢吡咯-2-酮(0.44g，1.48mmol)溶液中。将该混合物在室温下搅拌2小时，并接连用饱和碳酸氢钠溶液和水洗涤。分离二氯甲烷层，经硫酸镁干燥并在硅胶柱上采用二氯甲烷作为洗脱液层析得到作为无色颗粒的5-亚甲基-1-(丙-2-烯酰基)-4-苯基-二氢吡咯-2-酮(0.18g，51％)。
¹H NMRδ(CDCl₃)：7.46(m，5H，Ar H’s)；6.70(s，1H，＝CH₂)；6.59(d，1H，＝CH₂)；6.15(1H，s，C4-H)；5.93(d，1H，＝CH₂)；5.41(s，1H，＝CH₂)。
以类似的方法制备其他4-苯基-5-亚甲基-二氢吡咯-2-酮的丙烯酸酯衍生物。
2.抗菌测定
对本发明的化合物进行许多测定。这些测定的实验方法学在下文陈述。
2(a)N-酰化的高丝氨酸内酯(AHL)群体感应测定
本申请人已证明某些呋喃酮和呋喃酮类似物能抑制细菌中AHL-介导的群体感应。使用利用在AHL信号存在下表达绿色荧光蛋白(GFP)的报告菌株的AHL-群体感应测定，将本发明的化合物与现有技术的化合物按顺序进行比较。该测定通过测量待测化合物存在下的GFP输出，并将该输出与对照相比较来进行。通过使用在不同浓度的化合物和AHL下的多个样品，可产生化合物活性的抑制指数。本实施例中所用的抑制指数是降低GFP表达至对照的40％所需的化合物的相对量。抑制指数被称为AIC40。较低值的AIC40代表AHL群体感应系统的较好的抑制剂。
用于该测定的细菌报告菌株是大肠杆菌(E.coli)，已将V.fischeri luxRI系统工程化入所述大肠杆菌中。如(Andersen等人，2001和Andersen等人，1998)中所述，将gfp基因融合至QS控制的luxI启动子。
AIC40(在3nM OHHL下的ID40)的测量
如下进行采用基于大肠杆菌的luxRI构建体测定化合物的活性。
抑制动力学
在15mL塑料试管中，将3mL lux荧光报告菌株的o.n.培养物与12mL新鲜培养基混合，在37℃下温育。标记6个试管，10、20、两个50和两个100。向每个试管中加入OHHL(3-氧代己酰基高丝氨酸内酯)至AB培养基中的最终浓度分别为10、20、50或100nM(加入足量培养基以分布至适当数目的孔中)。向微孔板的第1排(A排)中加入200ul OHHL/AB混合物。向其余的(B-H)排中加入100ul OHHL/AB混合物。向第1排(A)的200ulOHHL/AB混合物中加入待测化合物。通过从第1排孔中转移100μL至第2排孔中并依次类推，在前7排孔中进行系列稀释。从第7排孔中弃去剩余的100μL溶液。向每孔中加入100μL稀释的lux监测剂。在37℃温育该板2小时，采用“Victor”读板机测定绿色荧光。
数据处理
计算每柱的ID₄₀。为此，计算每孔中的相对活性。分别计算每柱，不含有呋喃酮的孔被设定为100％活性(第8排中的孔)。用每个OHHL浓度对所用的化合物浓度范围作图。计算相对活性降低至40％所需的化合物量，这被定义为抑制剂量40％，ID₄₀。对于每种化合物，抑制指数AIC₄₀如下确立：ID₄₀分别对其AHL浓度作图；AIC₄₀是通过作图点和原点的最佳直线的斜率。
2(b)LasR测定
本发明的化合物也采用LasR测定进行测定。该LasR测定提供群体感应抑制活性的量度。抑制百分率越高，化合物越有效。在LasR测定中，不稳定的gfp已与弹性蛋白酶启动子融合，以使得通过QS系统调节Gfp的量。将质粒放入产生自身AHL信号的绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)中。通过在实验开始时向系统中加入不同浓度的待测化合物进行测定。在生长期间的不同时间测量Gfp表达，在24h时间点结束。在对照中荧光达到最大时的时间点(通常在接种后约11-12小时)测量荧光百分率。
实施例2(c)表皮葡萄球菌(S.epidermidis)生长
在Wallac Victor2酶标仪中，通过于96孔微孔板中在胰酶大豆肉汤加0.5％葡萄糖中生长表皮葡萄球菌来测定本发明的化合物对表皮葡萄球菌的生长抑制。将不同浓度的各个化合物加至孔中，还采用无化合物的对照和一列空白孔。每小时测量OD600。做出生长曲线，将在化合物的存在下的细胞生长与对照比较以测定显著改变生长速率或最终生长收率的化合物浓度。
实施例2(d)生物被膜形成的抑制
作为流式细胞和基于微滴定板测定的折衷，通过使用下述方案来测量培养皿中的生物被膜形成。该方法(相对于流式细胞)增加了可测试的平行测定，同时仍产生具有典型结构例如小菌落的生物被膜，这作为生物被膜中的分化结构是重要的。该方法由下述步骤组成：将表面例如载玻片(对于未连接的化合物)或改性的塑料检查片(对于共价连接的化合物)放置在无菌的培养皿底部并加入生长培养基。将细菌接种到培养皿中并在合适的温度下以50rpm培养。在24小时时更换培养基并再培养24小时，而后除去载玻片并清洗以除去松散结合的细胞。为了监测载玻片上的生物被膜形成，或者用适合的荧光染料将细胞染色并用共聚焦显微镜显像及定量生物被膜(作为表面覆盖度％)，或者用结晶紫染色该生物被膜，充分洗涤以除去过量染料并接着脱色，在540nm测量吸光度以确定作为结晶紫染色的函数的生物被膜量。
测量化合物
采用实施例2(a)-2(d)中所述测定的本发明的许多化合物的测定结果列于表2和3。
表2



表3


NE，无效应。
所有百分率均是在无生长抑制浓度下的对照值的下降百分比。
括号中的数字表示采用的浓度。
实施例2(e)肺感染模型：经气管被细菌/海藻藻酸盐攻击的小鼠。
该模型表明了CF患者或患有黏膜纤毛活动梯功能失调(dysfunctionalmuccociliary escalator)的患者的情形。
实验：
5-亚甲基-4-苯基-二氢-吡咯-2-酮(C219)的治疗剂量为12μg/g体重，每日注射给药2次。
小鼠被绿脓杆菌PAO1(wt)5.2×10⁶CFU/肺(1.3×10⁸CFU/ml)攻击。每组保持10只小鼠，用C219和赋形剂治疗，持续3天。死亡率在C219组中为10％，在赋形剂组中为30％。在第5天，处死存活的小鼠。测定肺中的LIMP(显示发炎的肺部分占总肺面积的分数)和细菌含量。
结果：
*在第5天，与赋形剂组相比，C219的治疗显著降低肺细菌接种量(p＝0.0008)(图1)。
*与安慰剂(赋形剂＝对照)相比，C219治疗(每日注射2次，每次12μg/g体重，给药3天)显著减轻小鼠中绿脓杆菌(PA)肺感染的严重性(LIMP)。因此，该化合物看起来对炎症产生正效应。
3.对比研究
将本发明的化合物的抗菌活性和细胞毒性与类似于WO 2004/016588中示例的那些化合物相比。
3(a)N-酰化高丝氨酸内酯(AHL)群体感应测定
本测定的方法学陈述于上文2(a)中。
对根据本发明的化合物219、257、294、295和类似于WO 2004/016588中示例的化合物198和205进行测定，结果示于表4中。可以看出化合物219、257、294和295与化合物198和205相比，具有显著较好的AIC40值。
表4：N-酰化的高丝氨酸内酯(AHL)群体感应测定的比较结果改变为相应于原始数据


3(b)细胞毒性研究
采用以下测定法测试了化合物的细胞毒性：
在测试期间，在塑料培养皿中以低密度接种鼠L929细胞并生长至融合。接种24小时后，吸去测试皿上的培养基并用含有待测化合物的培养基替代。单层细胞接着再培养48小时。在测试阶段结束时，从培养皿中采集细胞、评估其数目并与未加药的培养基比较。细胞数目的差别表示为相对于未加药培养基的抑制百分率。30％的抑制率被认为是测试化合物的细胞毒可能性的清楚指示。
细胞系：
厄尔L细胞(Earle′s L Cells)-生长在添加10％FBS的MEM/NA中的NCTC克隆929(鼠)。
被测化合物是根据本发明的化合物——化合物219和与WO2004/016588中示例的化合物具有相同的溴化模式的二溴取代的内酰胺类——化合物226和223。测定结果列于表5中。


表5