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1、(10)申请公布号 CN 102688692 A(43)申请公布日 2012.09.26CN102688692A*CN102688692A*(21)申请号 201210167994.7(22)申请日 2012.05.28B01D 57/02(2006.01)G01N 1/34(2006.01)(71)申请人上海交通大学地址 200240 上海市闵行区东川路800号(72)发明人曹成喜 杨经华 郭陈刚 王后禹樊柳荫 杨成章 孔凡志(74)专利代理机构上海新天专利代理有限公司 31213代理人张泽纯(54) 发明名称用于制备型自由流电泳的分离室装置(57) 摘要一种用于制备型自由流电泳的分离室装置。
2、，包括第一、第二有机玻璃平板、电泳室和电极室，第一和第二有机玻璃平板之间夹有由离子交换膜的分离孔和电极孔及塑料薄膜形成电泳室和电极室，并用塑料螺丝通过所述的第一有机玻璃平板的上螺丝孔、第二有机玻璃平板的下螺丝孔和塑料薄膜的薄膜螺丝孔固定，在第一有机玻璃平板上，且对应于离子交换膜的电极孔的两端，分别设有电极缓冲液进液口和电极缓冲液出液口，用于循环电极液。本发明能够解决传统自由流电泳中密封性问题和稳定性问题，提供高稳定高度均匀的流体动力学环境，广泛应用于核酸/蛋白质/多肽/细胞/病毒等多种样品的常规FFE分离，可应用于各种在FFE装置进行的样品纯化。(51)Int.Cl.权利要求书1页 说明书6页。
3、 附图3页(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书 1 页 说明书 6 页 附图 3 页1/1页21.一种用于制备型自由流电泳的分离室装置，包括第一有机玻璃平板（1）、第二有机玻璃平板（3）、电泳室和电极室，电极室中安装有铂电极，第二有机玻璃平板（3）的一端设有多个电泳缓冲液进液口（32），第一有机玻璃平板（1）的另一端对称地设有多个电泳缓冲液出液口（14），形成电泳缓冲液泳道，其特征在于，在所述的第一有机玻璃平板（1）和第二有机玻璃平板（3）之间还设有离子交换膜（2）与框形的塑料薄膜（4）；该离子交换膜（2）的中央区域设有长形分离孔（21），在分离孔（21）的两侧各。
4、设有一个与该分离孔（21）平行的长形电极孔（22），所述的第一有机玻璃平板（1）和第二有机玻璃平板（3）之间夹有由离子交换膜（2）的分离孔（21）和电极孔（22）及塑料薄膜（4）形成电泳室和电极室，并用塑料螺丝（5）通过所述的第一有机玻璃平板（1）的上螺丝孔（11）、第二有机玻璃平板（3）的下螺丝孔（31）和塑料薄膜（4）的薄膜螺丝孔（41）固定；在所述的第一有机玻璃平板（1）上，且对应于离子交换膜（2）的电极孔（22）的两端，分别设有电极缓冲液进液口（12）和电极缓冲液出液口（13），用于循环电极液，在电极缓冲液进液口（12）的外侧还设有电极固定孔（15），用于固定所述的铂电极。2.根据权利。
5、要求1所述的用于制备型自由流电泳的分离室装置，其特征在于，所述的塑料薄膜（4）的外径大小与第一有机玻璃平板（1）和第二有机玻璃平板（3）的大小相同，塑料薄膜（4）的内径大小与离子交换膜（2）的大小相适配。3.根据权利要求1所述的用于制备型自由流电泳的分离室装置，其特征在于，所述的离子交换膜（2）是厚度为0.8-1.0 mm的高效离子交换膜。4.根据权利要求1所述的用于制备型自由流电泳的分离室装置，其特征在于，所述的电泳缓冲液进液口（32）内插有枪头，该枪头的下端与硅胶管连接；所述的缓冲液出液口（14）内插有枪头，该枪头的上端与硅胶管连接。5.根据权利要求4所述的用于制备型自由流电泳的分离室装置。
6、，其特征在于，电泳缓冲液进液口（32）和电泳缓冲液出液口（14）分别是由数量分别为24、48或96个孔组成。6.根据权利要求4所述的用于制备型自由流电泳的分离室装置，其特征在于，所述的枪头为圆柱形短管。7.根据权利要求1所述的用于制备型自由流电泳的分离室装置，其特征在于，在所述的第二有机玻璃平板（3）的底部中央设置水冷却槽（6），该水冷却槽（6）的位置、面积和所述电泳室的位置、面积对应一致。权 利 要 求 书CN 102688692 A1/6页3用于制备型自由流电泳的分离室装置技术领域0001 本发明涉及生物化工的装置技术领域，具体涉及一种用于制备型自由流电泳（Free-flow electr。
7、ophoresis, 以下简称：FFE）的分离室装置。背景技术0002 由于电泳（Electrophoresis）技术能够分离许多的生物分子，如蛋白质、多肽和细胞等，所以在生物化学领域得到了广泛地应用。随着电泳技术的发展，电泳过程中的支撑介质由最初的滤纸和醋酸纤维素膜逐渐被凝胶所取代。凝胶作为支持介质的引入大大促进了电泳技术的发展，使电泳技术成为分析蛋白质、核酸等生物大分子的重要手段之一。然而，固体介质填充的电泳有很多的缺点。首先，其处理样品的含量不大，主要应用于分析以及小规模的分离纯化，而很少用于大规模的制备。其次，固体物质对样品的性质会产生一定的影响，如迁移距离、带电能力的改变。最后，有些。
8、固体填充料还会引起样品的吸附、变性，导致对样品的分离纯化以及大规模的制备都有很大的影响。0003 科学技术的日益发展以及生物样本对温和分离条件的苛刻要求，迫切需要电泳技术在创新理念上做出革新。正是在这样的背景下，FFE应运而生。至今，FFE已经发展成为一种水相制备技术，具有可连续分离、多种分离模式、无固体支持介质和分离条件温和等优势，特别适用于生物材料的分离纯化和制备，且有着极高的回收率。其基本形式就是在一个薄的分离腔中，背景缓冲液和样液以不同的流速流动，通过垂直于背景缓冲液流速方向的电场实现物质的分离、富集。由于可以连续进样，所以这种电泳可以进行连续制备。 （屈锋, 韩彬, 邓玉林等. 色谱。
9、, 2003, 26(3): 274-279 ）通常，FFE的原理可以简述如下：在两块平行板构成的薄的电泳室中，电场与溶液流向垂直，电泳迁移率不同的各种组分在电场力作用下与液流方向形成不同的偏转角，在电泳室中表现出抛物线流型，在电泳室末端不同出口处流出并进行收集。（Roman M C, Brown P R. Anal Chem, 1994, 66: 86A ）较之传统的以固体介质为依托的电泳形式，FFE不再需要固体介质，而是在一个水相条件下进行各种样本的分离甚至制备，并显现出以下优势：效率高、设备操作简单、分辨率好、过程和条件可控、对产物损伤小。同时又由于FFE是一种全液相的电泳模式，分离速度。
10、快以及样品回收率高也是其主要的特征。0004 FFE有着极其广泛的应用前景。根据相关的报道，小到药物小分子，大到动物细胞甚至器官组织都可以用自由流电泳对其成功地进行分离。同时FFE分辨率也能够达到很高的标准，利用该技术已经分离出了很多化学结构上只有细微差别的物质。FFE在蛋白质组分析，尤其在分离低丰度蛋白过程中起到了十分重要的作用。而且，FFE的优点能使其在分离一些特殊物质时发挥无比的优越性，例如组织纤溶酶激活剂（t-P A）的分离。FFE在细胞的分离上也有广泛的前途。目前，FFE也被广泛地运用到制药中去，其中用处最大的莫过于手性药物的分离。（Lanz M, Caslavska J, Thor。
11、mann W. Electrophoresis,1998, 19, 10811090; Valery C, Boris B, Sergey P.R, Andreas C. Electrophoresis, 1998, 说 明 书CN 102688692 A2/6页419, 1211-1214; Hoffmann P, Hong J, Moritz R.L, Connoly L.M et al. Proteomics, 2001, 1, 807-818; Hannig K. Electrophoresis, 1982, 3, 235-243; 夏其昌，宋金芳，蛋白质化学研究技术与进展：连续自由流。
12、电泳，科学出版社，1997, 151-158; 刘韬, 王升年. 生物化学与生物物理学报：英文版1999, 31, 5, 590-593; Hoffmann P, Wagner H, Weber G, Lanz M, Caslavska J, Thormann W. Anal. Chem, 1999, 71, 1840-1850; Wind M, Hoffmann P, Wagner H, Thormann W. J. Chromatogr. A, 2000, 895, 5165; ）。0005 迄今为止，FFE主要有三种基本的操作模式：自由流区带电泳（Free-flow zone elect。
13、rophoresis, ZE-FFE）、自由流等速电泳（Free-flow isotachophoretic electrophoresis, ITP-FFE）、自由流等电聚焦电泳（Free-flow isoelectric focusing, IEF-FFE）。由这三种基本的FFE模式，科学家们又逐渐发展出其他模式的FFE，如自由流场梯度电泳（Free-flow field step electrophoresis, FSE-FFE），自由流免疫电泳（Immune free-flow electrophoresis, IMM-FFE），移动反应界面自由流电泳（Moving reaction 。
14、boundary free-flow electrophoresis, MRB-FFE），循环等电聚焦自由流电泳（Recycling isoelectric focusing free-flow electrophoresis, RIEF-FFE）。（L. Kiivankova, P. BoEek. Electrophoresis 1998, 19, 1064-1074; 屈锋, 韩彬, 邓玉林, 张丽华, 张玉奎. 色谱. 2008, 26（3）, 274-279; Chen, S., Palmer, J. F., Zhang, W., Shao, J., Li, S., Fan, L. Y。
15、., Sun, R., Dong, Y. C., Cao, C. X., Electrophoresis 2009, 30, 19982007; ）本研究组在新近的研究中，利用一种基于聚丙烯酰胺凝胶膜的自由流电泳分离室（专利授权号：ZL200710042306.3）自组装了大型、中型、小型的重力自平衡自由流电泳仪器。用这三种型号的自由流电泳仪，我们分别纯化了Pseudomonas sp.M18菌株发酵液中低浓度的吩嗪-1-羧酸（phenazine-1-carboxylic acid，PCA）、分离了Escherichia coli 和Staphylococcus aureus细胞及三种蛋白、微。
16、制备了猪胰液中的胰蛋白酶。研究结果表明，这种传统的分离室能够很好地应用于自由流电泳装置。然而，这种聚丙烯酰胺膜在电泳操作前的制备相当繁琐，而且分离室的密封性不强，从而降低了FFE的操作效率。而且，这种膜的自身属性使得这种电泳分离室的寿命很短。另外，这种膜材质导电性能一般，导致电压有效利用率比较低。基于实验操作的高效性原则考虑，极有必要对这种传统类型的分离室装置进行改进。（Shao, J., Fan, L. Y., Zhang, W., G uo, C. G., Li, S., Xu, Y. Q., Cao, C. X., Electrophoresis 2010, 31, 34993507; 。
17、Y. C. Dong, J. Shao, X. Y. Yin, L. Y. Fan, C. X. Cao, J. Sep. Sci. 2011, 34,1683-1691; J. Z. Geng, J. Shao. J. H. Yang, B. Pang, C. X. Cao, L. Y. Fan, Electrophoresis 2011,323248-3256）。发明内容0006 本发明的目的在于克服上述现有技术的不足，提供一种用于自由流电泳的分离装置，高效地对样本进行分离纯化。0007 本发明的技术解决方案如下：一种用于制备型自由流电泳的分离室装置，包括第一有机玻璃平板、第二有机玻璃平板。
18、、电泳室和电极室，电极室中安装有铂电极，第二有机玻璃平板的一端设有多个电泳缓冲说 明 书CN 102688692 A3/6页5液进液口，第一有机玻璃平板的另一端对称地设有多个电泳缓冲液出液口，形成电泳缓冲液泳道，其特征在于，在所述的第一有机玻璃平板和第二有机玻璃平板之间还设有离子交换膜与框形的塑料薄膜；该离子交换膜的中央区域设有长形分离孔，在分离孔的两侧各设有一个与该分离孔平行的长形电极孔，所述的第一有机玻璃平板和第二有机玻璃平板之间夹有由离子交换膜的分离孔和电极孔及塑料薄膜形成电泳室和电极室，并用塑料螺丝通过所述的第一有机玻璃平板的上螺丝孔、第二有机玻璃平板的下螺丝孔和塑料薄膜的薄膜螺丝孔固。
19、定；在所述的第一有机玻璃平板上，且对应于离子交换膜的电极孔的两端，分别设有电极缓冲液进液口和电极缓冲液出液口，用于循环电极液，在电极缓冲液进液口的外侧还设有电极固定孔，用于固定所述的铂电极。0008 所述的塑料薄膜的外径大小与第一有机玻璃平板和第二有机玻璃平板的大小相同，塑料薄膜的内径大小与离子交换膜的大小相适配。0009 所述的离子交换膜是厚度为0.8-1.0 mm的高效离子交换膜。0010 所述的电泳缓冲液进液口内插有枪头，该枪头的下端与硅胶管连接；所述的缓冲液出液口内插有枪头，该枪头的上端与硅胶管连接。0011 电泳缓冲液进液口和电泳缓冲液出液口分别是由数量分别为24、48或96个孔组成。
20、。0012 所述的枪头为圆柱形短管。0013 在所述的第二有机玻璃平板的底部中央设置水冷却槽，该水冷却槽的位置、面积和所述电泳室的位置、面积对应一致。0014 本发明分离室装置的电泳缓冲液进液口端与气液缓冲分流装置（发明专利授权号：Zl200510024412.X）相连接，电泳缓冲液出液口端与分离液自平衡连通收集装置（发明专利授权号：Zl200510024413.4）相连接，从而使得进液口和出液口的液体流量均匀一致，最终在FFE分离室中形成稳定均匀的流体动力学环境。使用这种FFE分离室，我们采用水/有机混合相自由流电泳技术，提高了弱极性物质（PCA）在FFE中的分离通量约11.9倍（相对于之前。
21、的FFE分离PCA技术而言）。0015 本发明FFE分离室装置被设计成三明治夹心结构，由上下两块第一有机玻璃板和第二有机玻璃板夹着一张厚度0.8-1.0 mm的离子交换膜组成。离子交换膜的中央区域被挖空，自然地形成样品电泳室和两个电极室，用塑料螺丝进行密封固定。0016 厚度为0.8-1.0 mm的高效离子交换膜，如图4所示，长为310 mm，宽为200 mm。这样的长宽比（2.5），相比以前的设计，更为“窄长”，对整个自由流电泳仪的分离能力有一定程度上的提升。同时，中空的离子交换膜也将整个电泳室和电极室完全隔离开来，使电泳缓冲液和电极缓冲液之间无法形成对流。同时由于离子交换膜具有很好的导电能。
22、力，因此在电泳室中起到了“电桥”的作用。0017 电泳室的上下两板采用厚度为10 mm的PMMA板作为基体材料。在第一有机玻璃板的一端打出半径1 mm的小孔48个，将白色的10uL枪头截取中间一部分插进小孔，作为电泳缓冲液进出液的转接头，连接硅胶管。第二有机玻璃板尺寸和第一有机玻璃板尺寸完全符合，只是在与第一有机玻璃板对应的另一端打出半径同为1 mm的小孔48个。在第一有说 明 书CN 102688692 A4/6页6机玻璃板和第二有机玻璃板之间采用挖空的厚度为0.8-1.0 mm的离子交换膜，三者共同形成电泳室，而电泳缓冲液液流就在其中流动。液流从第二有机玻璃板的孔道进入电泳室，横贯电泳室后。
23、，再从第一有机玻璃板的孔道流出。整个电泳室的长度为300 mm，宽为120 mm。0018 电泳室的电泳缓冲液进（出）液口孔道的空间安排上，摈弃了商业化仪器一排孔的设计，而改用交错角度为60度的两排交错孔设计。这样在限定的总宽度之内，孔与孔间能获得最大的间距，获得最小的平面应力，干扰因素也最少。0019 电泳室两侧同时各设计一个与电泳室平行等长、10 mm宽的电极室。在电泳过程中，通过其电极缓冲液进液口注入与电泳缓冲液流向相同的电极缓冲液。电极室中安装有铂丝电极，与电压装置通过导线相连，为电极处提供一定的电压。离子交换膜将整个电泳室和电极室完全隔离开来，使电泳缓冲液和电极缓冲液之间无法形成对流。
24、，同时起到“电桥”的作用。0020 为了扩散分离过程中产生的焦耳热，将水冷却装置（专利授权号：ZL200710042306.3）安装于本发明第二有机玻璃板底部，冷却水从装置的进口进入散热槽，分散分布于分离室中的焦耳热，再从装置的出口处流出。0021 对电泳室的密封，本发明通过在两层有机玻璃板四周钻孔并利用塑料螺丝来进行。0022 仪器操作过程中，将本发明装置斜上放置，将电泳缓冲液和电极缓冲液缓缓地泵入电泳室和电极室，以排尽内腔及硅胶管中的气泡，并平衡一段时间使得分离室中的液流稳定均一。随后，将本分离室装置水平放置，并启动水冷却装置、打开电源，即可进行样品的分离纯化。0023 与现有技术相比，本。
25、发明的有益效果如下：（1）采用商业化的离子交换膜替换了之前的聚丙烯酰胺凝胶膜用于FFE分离室，改进了传统的分离室装置，能够较好地用于常规模式的各种样本的高效分离纯化。0024 （2）稳定性强，可以连续反复使用1年以上时间。对许多凝胶膜进行测试，其中包括聚丙烯酰胺凝胶、醋酸纤维薄膜、硝酸纤维薄膜等，发现其稳定性不够高，使用寿命大多在1个月左右。0025 （3）导电性能强。使用凝胶膜设计分离室时，在施加较高电压的时候，膜的电流很不稳定。商业化的离子交换膜相比凝胶膜而言，导电性能强，对电压的利用率要高出很多，而且耐受的电压强度要比凝胶膜大。因此采用了商业化的离子交换膜后的自由流电泳装置，其导电能力得。
26、到了大幅度提高，同时也极大地提高了待分离物质的分离能力。0026 （4）密封性能和制作方便。传统分离室的密封主要由上下两板夹着透明密封橡胶的未挖空部分完成，采用C形夹承压。由于C形夹在有机玻璃板上施的力难以在各处均匀分布，故而使得分离室密封效果欠佳。而使用高效分离膜后，可以采用塑料螺丝设计密封分离室，从而达到完全密封的效果，同时制作方便。附图说明0027 图1为本发明用于制备型自由流电泳的分离室装置的结构示意图。0028 图2为本发明中第一有机玻璃平板的平面示意图。0029 图3为本发明中第二有机玻璃平板的平面示意图。说 明 书CN 102688692 A5/6页70030 图4为本发明中离子。
27、交换膜的平面示意图。0031 图5为本发明中塑料薄膜的平面示意图。0032 图中，1-第一有机玻璃平板，11-上螺丝孔，12-电极缓冲液进液口，13-电极缓冲液出液口，14-电泳缓冲液出液口，15-电极固定孔，2-离子交换膜，21-分离孔，22-电极孔，3-第二有机玻璃平板，31-下螺丝孔，32-电泳缓冲液进液口，4-塑料薄膜，41-薄膜螺丝孔5-塑料螺丝，6-水冷槽，7-冷却水进液口，8-冷却水出液口。具体实施方式0033 以下结合附图对本发明的技术方案作进一步说明，但不应以此限制本发明的保护范围。0034 请先参阅图1，图1为本发明用于自由流电泳的分离室装置的结构示意图，如图所示，第一有机。
28、玻璃平板 1和第二有机玻璃平板3之间是挖空的离子交换膜2和塑料薄膜4，三者采用“三明治夹心”的方式，共同形成电泳分离室（分离孔21）和电极室（电极孔22）。位于周边各处均匀分布的的塑料螺丝5依次贯穿第一有机玻璃平板 1、塑料薄膜4和第二有机玻璃平板3，达到密封的效果。第二有机玻璃平板3的底部中央设置水冷却槽6，水槽的位置、面积和电泳室的位置、面积对应一致，冷却水从冷却水进液口7进入水冷却槽6，再由冷却水出液口8流出，起到分散焦耳热的作用。0035 图3为本发明中第二有机玻璃平板的平面示意图，主要起引入分离电泳缓冲液和支持电泳室的作用。如图所示，第二有机玻璃平板3开有电泳缓冲液进液口32以及在对。
29、应塑料薄膜的位置打有下螺丝孔31。电泳缓冲液进液口32通过插在下端的枪头和硅胶管连接储液槽。电泳缓冲液进液口32呈两排设计，相邻孔的位置呈现锯齿型排列，孔与孔之间夹角为60度。离子交换膜2，用于隔离电泳缓冲液和电极缓冲液形成分离室（分离孔21）和电极室（电极孔22）。周围均匀分布的塑料螺丝5，密封整个分离室装置。0036 图2为本发明中第一有机玻璃平板的平面示意图，主要起送出电泳缓冲液和循环电极缓冲液的作用。电泳缓冲液出液口14，通过插在上端的枪头和硅胶管连接分馏收集装置。电极室（电极孔22）的一端设置电极固定孔15，通过螺栓固定铂电极，外部可加入绝缘材料用以防止漏电。电极室的两端设置了电极缓。
30、冲液进液口12和电极缓冲液出液口13，用于循环电极缓冲液。装置的固定，出液口的接头以及密封的方法均与前段的描述一致。0037 图4为本发明中离子交换膜的平面示意图，如图所示，离子交换膜2按照电泳室、电极室的大小进行加工，整体上与塑料薄膜4的挖空区域相适配。将离子交换膜中间相对应的部分挖去形成电泳室（分离孔21）1以及电极室（电极孔22）。离子交换膜在电泳缓冲液进出液口端锯齿放射型的引流设计能够使流入的液流呈现稳定匀速的层流。0038 图5为本发明中塑料薄膜的平面示意图，如图所示，塑料薄膜4按照第一、二有机玻璃平板的大小以及各孔的位置进行加工，将中间的部分挖去，形成外围绝缘的套环，起到绝缘保护的作用。0039 工作时，首先关闭电泳电源和冷却装置系统，将本发明分离室装置斜上放置，将电泳缓冲液和电极缓冲液缓缓地泵入电泳室和电极室，以排尽内腔及硅胶管中的气泡，并平衡一段时间使得分离室中的液流稳定均一。随后，将分离室装置水平放置，并启动冷却装置、打开电源，即可进行样品的分离纯化。实验结束后，先关闭电源，再依次关闭恒流泵和水说 明 书CN 102688692 A6/6页8冷装置，收集48管（或96管）进行离线分析检测。说 明 书CN 102688692 A1/3页9图1图2说 明 书 附 图CN 102688692 A2/3页10图3图4说 明 书 附 图CN 102688692 A10。