一种烷烃降解酶制剂及其制备方法和应用.pdf

本发明属于环境微生物技术领域，涉及一种烷烃降解酶制剂及其制备方法和应用。烷烃降解酶制剂为经破碎处理后的地衣芽孢杆菌发酵培养物，所述地衣芽孢杆菌保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:2011261。本发明烷烃降解酶制剂可以对烷烃进行降解，对受烷烃污染的土壤进行降解，降解速度显著提高，较微生物降解速度提高40-60倍。本发明是一种效果好，见效快，成本低的烷烃去除的方法，在石油污染土壤修复领域具有很大的应用价值。

1.  一种烷烃降解酶制剂，其特征在于：烷烃降解酶制剂为经破碎处理后的地衣芽孢杆菌发酵培养物；
所述地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)已于2011年7月19日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2011261。

2.  一种权利要求1所述的烷烃降解酶制剂的制备方法，其特征在于：将地衣芽孢杆菌接种到含有烷烃的无机盐液体培养基中发酵培养，收集菌体后超声破碎即得烷烃降解酶制剂。

3.  按权利要求2所述的烷烃降解酶制剂的制备方法，其特征在于：将体积百分比5-10％的地衣芽孢杆菌接种于含有烷烃的无机盐液体培养基中，于25-30℃，150-200rpm/min振荡培养48-60h；而后按体积百分比5-8％的接种量将培养液接种到含有烷烃的无机盐液体培养基中，于25-28℃发酵到对数生长期；于6000-8000rpm/min下离心5-10min收集菌体；
将收集的菌体用5-10倍体积的pH 6.0的PBS缓冲液重悬菌体，然后进行超声波破碎，超声功率为200-500W，超声破碎时间为25-35min；然后在2-8℃条件下，经6000-8000rpm/min离心5-10min，取上清液，即为烷烃降解酶制剂。

4.  按权利要求2或3所述的烷烃降解酶制剂的制备方法，其特征在于：所述含有烷烃的无机盐液体培养基组成为：正十六烷0.5-2.0g/L，环十二烷0.2-0.5g/L，0.5g/L NaCl，0.2g/L MgSO₄，0.5g/L(NH₄)₂SO₄，1.5g/L K₂HPO₄，0.5g/L KH₂PO₄，0.05g/L CaCl₂，0.02g/L FeSO₄，0.002g/L酵母粉，PH值7.0。

5.  按权利要求3所述的烷烃降解酶制剂的制备方法，其特征在于：所述PBS缓冲液由16ml 0.2mol/L NaH₂PO₄水溶液和84ml 0.2mol/L Na₂HPO₄水溶液混合制成。

6.  一种权利要求1所述的烷烃降解酶制剂的应用，其特征在于：所述酶制剂作为污染环境中的烷烃降解酶制剂，用于治理污染环境。

7.  按权利要求6所述的烷烃降解酶制剂的应用，其特征在于：所述酶制剂用于降解污染水体或土壤中的烷烃。

8.  按权利要求7所述的烷烃降解酶制剂的应用，其特征在于：所述酶制剂中加入2-4mmol/L的Fe²⁺或2-4mmol/L摩尔比为1:1的Fe²⁺/Fe³⁺，施用于污染水体或土壤中进行降解烷烃，进而达到修复的目的。

一种烷烃降解酶制剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于环境微生物技术领域，特别涉及一种烷烃降解酶制剂及其制备方法和应用。
背景技术
石油烃类污染已经成为全世界范围内的重要的环境污染问题之一。石油是由数百种化合物组成的复合体，烷烃作为石油最重要的成分之一，占石油总质量的20-50％以上。在自然环境中，短链烷烃易挥发，中链烷烃可以被微生物降解，而不易挥发、低溶解性的长链烷烃和环烷烃则属于很难被生物降解的污染物，对环境的危害较持久，因此环境中烷烃的去除一直以来都是研究的热点。
去除烷烃的方法主要包括物理、化学和生物等方法。其中，生物方法具有不造成二次污染、费用低、原位降解污染物等特点，是一种极有前途的技术。目前已经报道的烷烃降解微生物主要有假单胞菌、不动杆菌、诺卡氏菌、红球菌等，但高效广谱降解菌株少，其中大多数菌株降解谱为C₁₀-C₂₀烷，而少数降解谱较宽的菌株如诺卡氏菌降解原油中长链烷烃的效率则较低。而且用于环境修复的外源微生物引进土壤环境后，容易受到土著微生物的竞争、排斥，影响其存活、繁殖。因此需要建立一种高效广谱降解烷烃强化生物修复方法。
国内外研究表明，微生物分泌的酶是降解有机污染物的决定因素。微生物降解酶主要有两种，分别为胞内酶和胞外酶。许多研究发现，降解有机物的酶主要位于胞内。因此，破碎微生物细胞而释放出酶液，对于利用有机污染物降解至关重要。与投放活体微生物相比，投放降解酶具有以下优势：(1)不需要对环境的适应期；(2)对环境适应的范围比微生物本身要广，如pH、温度、湿度等；(3)无论环境污染物的浓度大小，酶对底物均具有专一、高效性；(4)容易进入土壤空隙与底物结合，而且酶活容易控制；(5)受代谢产物的抑制作用较小。因此酶和酶技术在环境有机污染治理方面具有广泛的前景。
发明内容
本发明的目的在于提供一种烷烃降解酶制剂及其制备方法和应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：一种烷烃降解酶制剂，烷烃降解酶制剂为经破碎处理后的地衣芽孢杆菌发酵培养物；
所述地衣芽孢杆菌PS5(Bacillus licheniformis PS5)已于2011年7月19日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2011261。
将地衣芽孢杆菌接种到含有烷烃的无机盐液体培养基中发酵培养，收 集菌体后超声破碎即得烷烃降解酶制剂。
将体积百分比5-10％的地衣芽孢杆菌接种于含有烷烃的无机盐液体培养基中，于25-30℃，150-200rpm/min振荡培养48-60h；而后按体积百分比5-8％的接种量将培养液接种到含有烷烃的无机盐液体培养基中，于25-28℃发酵到对数生长期；于6000-8000rpm/min下离心5-10min收集菌体；
将收集的菌体用5-10倍体积的pH 6.0的PBS缓冲液重悬菌体，然后进行超声波破碎，超声功率为200-500W，超声破碎时间为25-35min；然后在2-8℃条件下，经6000-8000rpm/min离心5-10min，取上清液，即为烷烃降解酶制剂。
所述含有烷烃的无机盐液体培养基组成为：正十六烷0.5-2.0g/L，环十二烷0.2-0.5g/L，0.5g/L NaCl，0.2g/L MgSO₄，0.5g/L(NH₄)₂SO₄，1.5g/L K₂HPO₄，0.5g/L KH₂PO₄，0.05g/L CaCl₂，0.02g/L FeSO₄，0.002g/L酵母粉，PH值7.0。
所述PBS缓冲液由16ml 0.2mol/L NaH₂PO₄水溶液和84ml 0.2mol/L Na₂HPO₄水溶液混合制成。
所述酶制剂作为污染环境中的烷烃降解酶制剂，用于治理污染环境。
所述酶制剂用于降解污染水体或土壤中的烷烃。
所述酶制剂中加入2-4mmol/L的Fe²⁺或2-4mmol/L摩尔比为1:1的Fe²⁺/Fe³⁺，施用于污染水体或土壤中进行降解烷烃，进而达到修复的目的。
本发明的优点是：
1.本发明的酶制剂含有参与烷烃降解的多种酶，施用于受污染的水体或土壤后可直接对烷烃进行降解，具有效率高、成本低的特点，较微生物降解速度提高40-60倍。
2.本发明制剂较降解微生物受环境影响小，不需要对环境的适应期，可保持较高的生物活性，可以将烷烃彻底的降解为CO₂和H₂O。
3.辅助金属离子的添加进一步提高酶剂作用效率。
附图说明
图1为本发明实施例提供的不同金属离子盐溶液对水相中酶制剂对烷烃降解作用的影响效果图；
图2为本发明实施例提供的不同金属离子盐溶液对土壤中酶制剂对烷烃降解作用的影响效果图；
图3为本发明实施例提供的烷烃降解酶剂与电动修复组合修复烷烃污染土壤效果图。
具体实施方式
实施例1、烷烃降解酶制剂的制备及其对水体中烷烃的降解
1)烷烃降解酶制剂的制备
选取烷烃高效降解菌株地衣芽孢杆菌进行种子液培养，将单克隆菌种接 种到含有烷烃的无机盐液体培养基中，于28℃，180rpm/min振荡培养60h；而后按体积百分比5％的接种量将上述培养的菌种重新接种到含有烷烃的无机盐液体培养基内振荡培养，于28℃发酵到对数生长期(OD₆₀₀＝0.6)；将发酵液于6000rpm/min下离心10min，收集菌体。
收集的菌体用10倍体积的pH 6.0的PBS缓冲液重悬菌体，然后进行超声波破碎，处理条件为300W功率下超声3s，停止3s，超声破碎时间为30min；然后在4℃条件下，经8000rpm/min离心10min，取上清液，即为烷烃降解酶制剂。
地衣芽孢杆菌PS5(Bacillus licheniformis PS5)保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2011261，保藏日期为2011年7月19日，保藏单位地址为中国.武汉.武汉大学。
含有烷烃的无机盐液体培养基成分为：正十六烷0.5g/L，环十二烷0.3g/L，0.5g/L NaCl，0.2g/L MgSO₄，0.5g/L(NH₄)₂SO₄，1.5g/L K₂HPO₄，0.5g/L KH₂PO₄，0.05g/L CaCl₂，0.02g/L FeSO₄，0.002g/L酵母粉，PH值7.0。
所述PBS缓冲液由16ml 0.2M NaH₂PO₄水溶液和84ml 0.2M Na₂HPO₄水溶液混合制成。
采用考马斯亮蓝法(Bradford法)测定酶制剂蛋白质浓度，采用牛血清蛋白(BSA)配制成标准蛋白质溶液，依据外标法对粗酶蛋白浓度进行定量分析，经测定，粗酶蛋白浓度为1.5mg/L。
2)烷烃降解酶制剂对水体中烷烃的降解
烷烃污染水体中酶制剂降解活性测定反应体系为：3mg酶制剂、20ml0.2M pH 7.5的PBS缓冲液、500mg/L混合烷烃(250mg/L正十六烷和250mg/L环十二烷)、浓度均为2mmol/L的Fe²⁺(FeSO₄)和Fe³⁺(FeCl₃)；以及浓度之和为2mmol/L的Fe²⁺/Fe³⁺(FeSO₄/FeCl₃)(1:1)混合物。以只加酶制剂和只加PBS缓冲液的反应体系作为对照，32℃反应4h，试验重复三次。
水相中混合烷烃的残留采用有机相与水相间的液-液萃取方法，选用二氯甲烷作为萃取剂进行烷烃浸提，采用气相色谱(安捷伦7890)进行定量测定。
测定结果(图1所示)表明：与只加PBS缓冲液处理PBS-CK相比,加酶制剂和铁离子处理(En、En-Fe²⁺、En-Fe³⁺和En-Fe²⁺/Fe³⁺)对正十六烷和环十二烷均有较好的降解效果，只添加酶制剂处理(En)的正十六烷和环十二烷的去除率分别达到36.2％和32.5％；添加铁离子促进了酶降解烷烃的活性，其中以加入Fe²⁺/Fe³⁺酶处理(En-Fe²⁺/Fe³⁺)对烷烃的降解效率最好，正十六烷和环十二烷的去除率达到了48.5％和45.4％，较单独酶制剂处理去除率提高了12.3％和12.9％。
实施例2、烷烃降解酶制剂对土壤中烷烃的降解
1)烷烃降解酶制剂的制备
选取烷烃高效降解菌株地衣芽孢杆菌进行种子液培养，将单克隆菌种接种到含有烷烃的无机盐液体培养基中，于30℃，150rpm/min振荡培养54h；而后按体积百分比10％的接种量将上述培养的菌种重新接种到含有烷烃的无机盐液体培养基内振荡培养，于30℃发酵到对数生长期(OD₆₀₀＝0.6)；将发酵液于8000rpm/min下离心5min收集菌体。
收集的菌体用8倍体积的pH6.0的PBS缓冲液重悬菌体，然后进行超声波破碎，处理条件为200W功率下超声5s，停止5s，超声破碎时间为35min；然后在4℃条件下，经8000rpm/min离心10min，取上清，即为烷烃降解酶制剂。
含有烷烃的无机盐液体培养基成分为：正十六烷0.5g/L，环十二烷0.3g/L，0.5g/L NaCl，0.2g/L MgSO₄，0.5g/L(NH₄)₂SO₄，1.5g/L K₂HPO₄，0.5g/L KH₂PO₄，0.05g/L CaCl₂，0.02g/L FeSO₄，0.002g/L酵母粉，PH值7.0。
所述PBS缓冲液由16ml 0.2M NaH₂PO₄水溶液和84ml 0.2M Na₂HPO₄水溶液混合制成。
采用考马斯亮蓝法(Bradford法)测定酶制剂蛋白质浓度，采用牛血清蛋白(BSA)配制成标准蛋白质溶液，依据外标法对粗酶蛋白浓度进行定量分析，经测定，粗酶蛋白浓度为1.45mg/L。
2)对土壤中烷烃的降解
烷烃污染土壤中粗酶液降解活性测定反应体系为：3mg酶制剂、5g 1％(W/W)浓度烷烃污染土壤、适量0.2M pH7.5PBS缓冲液、浓度均为3mmol/L的Fe²⁺(FeSO₄)和Fe³⁺(FeCl₃)以及浓度之和为3mmol/L的Fe²⁺/Fe³⁺(FeSO₄/FeCl₃)(1:1)混合物，以只加酶液和只加PBS缓冲液的反应体系作为对照，32℃反应4h，试验重复三次。烷烃分离于辽河油田原油，采用柱层析方法进行分离。
土壤中混合烷烃的提取采用固相萃取方法，选用二氯甲烷作为萃取剂浸提三次，脱水浓缩浸提至干后采用红外分光光度法利用标准曲线进行定量测定。
测定结果(图2所示)表明：与只加PBS缓冲液处理PBS-CK相比,加酶制剂和铁离子处理(En、En-Fe²⁺、En-Fe³⁺和En-Fe²⁺/Fe³⁺)对烷烃去除具有较好的效果，只添加酶制剂处理(En)的对烷烃的去除率达到30.6％；添加铁离子促进了酶降解烷烃的活性，其中以加入Fe²⁺/Fe³⁺酶处理(En-Fe²⁺/Fe³⁺)对烷烃的降解效率最好，烷烃的去除率达到了47.1％，较单独酶制剂处理去除率提高了16.5％。
实施例3、电动-烷烃降解酶制剂组合修复烷烃污染土壤
1)按照实施例1中发酵培养及超声破碎方法进行高效降解菌培养及酶 制剂的制备。
2)采用电动修复和烷烃降解酶制剂组合的修复模式进行烷烃污染土壤的降解修复，土壤中烷烃的浓度为2％(W/W),试验过程如表1所示。烷烃分离于辽河油田原油，采用柱层析方法进行分离。
首先在切换电场的1V/cm电压梯度下进行烷烃污染土壤的电动修复处理(图3)，前35天的烷烃去除率达到31.1％，而后随着处理时间延长降解作用显著减弱；此时停止电动修复进行烷烃降解酶制剂处理，同时添加PBS缓冲液继续进行土壤烷烃降解处理作为对照组，酶制剂处理4h后的烷烃去除率增加20.4％；随后继续以前述条件进行第二次电动处理，处理组中修复效率显著恢复，去除效率较第一次电动处理后期显著加快且此快速降解趋势持续一定时间；对照组中电动修复效率稍有恢复但随即再次降低。加酶电动处理组中烷烃的总去除率达到70.6％，而对照组(未加酶处理)只达到44.4％。数据表明，在电动修复过程中酶制剂的添加不仅加快烷烃降解速率和程度，同时为再次电动修复创造了良好的土壤环境。
表1 试验设计