一种提高乳酸菌冻干活性的方法.pdf

一种提高乳酸菌冻干活性的方法，属于酸奶冻干发酵剂、乳酸菌活菌制剂技术领域。本发明是经过富集培养，离心收集乳酸菌菌体后用保护剂悬浮，保护剂的用量是菌体湿重量的10-15倍，加保护剂悬浮后的乳酸菌菌体在4℃放置30分钟平衡，在30-45℃温度下，经过30-120分钟的预培养后，再进行冷冻干燥。与传统的不经预培养的冻干方法相比较，经过富集培养，离心收集和保护剂悬浮后，先不置于低温下预冻，而是把悬浮菌体重新送回一定温度培养一定时间，然后再冷冻干燥，预培养对离心收集过程中使菌体造成的损伤有修复作用。本发明用这种方法可以提高冻干酸奶发酵剂、乳酸菌活菌制剂的活性。

权利要求书
1.  一种提高乳酸菌冻干活性的方法，其特征是经过富集培养，离心收集乳酸菌菌体后用保护剂悬浮，保护剂的用量是菌体湿重量的10-15倍，加保护剂悬浮后的乳酸菌菌体在4℃放置30分钟平衡，在30-45℃温度下，经过30-120分钟的预培养后，再进行冷冻干燥，其中所述乳酸菌为德氏乳杆菌保加利亚亚种CTCC6047、嗜热链球菌(CTCC6038或以上两个菌种按质量比1：1混合菌种，所述保护剂为脱脂奶粉8.1g、甘油2.2g、酵母膏0.6g，加水100mL充分混合溶解，所述保护剂应于115.5℃、20分钟条件下灭菌，灭菌后置于37.1℃下培养三天，确认无菌后才能使用。

2.  根据权利要求1所述的方法，其特征是预培养的温度优选为42℃，预培养的时间优选为60分钟。

3.  根据权利要求1所述的方法，其特征是本方法适用于乳酸菌的活菌制剂或酸奶发酵剂。

说明书一种提高乳酸菌冻干活性的方法
技术领域
一种提高乳酸菌冻干活性的方法，属于酸奶冻干发酵剂、乳酸菌活菌制剂技术领域。
背景技术
由于成本和工业化方面的问题，菌体收集最常用的方法是离心分离法，即借助离心机的离心力作用使菌体沉积，目的就是将菌体与培养基和代谢产物分开，且要尽可能减少对菌体的损伤，此类方法简便、快速、处理量大，适合商业化生产。
菌体经过富集培养、离心收集和保护剂悬浮后，一般采取的措施就是迅速于低温下预冻，预冻一定时间后就开始冷冻干燥。从保护剂悬浮菌体到预冻这一步，可以做的工作很多：Broadbent等指出将乳酸乳球菌置于1O℃冷激2h，能提高细胞冻融后的存活率。国内关于这方面的研究才刚起步，东北农大的张兰威等人发表过一篇综述。国外有文献报道的也仅限于对大肠杆菌和一些嗜温乳酸菌关于冷激方面的研究。关于德氏乳杆菌保加利亚亚种和嗜热链球菌这两种常用于酸奶发酵剂菌种进行预培养的研究还未见诸报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种提高乳酸菌冻干活性的方法，在菌体经过富集培养，离心收集和保护剂悬浮后，先不置于低温下预冻，而是把悬浮菌体重新送回一定温度培养一定时间，然后再冷冻干燥。本发明把这种处理方法称为预培养。预培养对前面的离心收集过程使菌体造成的损伤有修复作用，所 以能提高乳酸菌冻干活性。本发明根据微生物的生理代谢特点，引入了预培养的思路，最大限度的挖掘冻干酸奶发酵剂活性提高的关键控制点。
本发明的技术方案：酸奶发酵剂主要由德氏乳杆菌保加利亚亚种和嗜热链球菌两种菌构成。
将这两种菌分别或按照1：1的配比以2％接入发酵培养基中培养，用常规方法经过
富集培养，离心后收集菌体，加入保护剂悬浮，保护剂的用量是菌体湿重量的10-15倍，加保护剂悬浮后的乳酸菌菌体于4℃放置平衡30min，在30-45℃温度下，经过30—120min时间的预培养后，再进行冷冻干燥。
本发明所用乳酸菌菌种为德氏乳杆菌保加利亚亚种CTCC6047、嗜热链球菌CTCC6038或以上两个菌种按质量比1：1混合菌种。所用保护剂为：脱脂奶粉8.1g、甘油2.2g、酵母膏0.6g，加水100mL充分混合溶解，保护剂应于115.5℃、20min条件下灭菌，灭菌后置于37.1℃下培养三天，确认无菌后才能使用。
预培养的温度优选为42℃，预培养的时间优选为60分钟，本方法也适用于乳酸菌活菌制剂或酸奶发酵剂。
本发明的有益效果：采用预培养方式可以修复离心过程中对菌体造成的损伤，所以能提高乳酸菌冻干活性。本发明对于用作酸奶发酵剂乳酸菌，可以缩短凝乳时间。菌体经过预培养过程，由冷冻干燥前的不活跃状态又能回复到富集培养后的相对活跃状态。所选菌株最适预培养温度为42℃，最适预培养时间为60min。将此种状态的菌体冻干后，菌体活性显著提高，凝乳时间比对照组缩短25min。
菌体用保护剂悬浮后不能马上冷冻，保护剂与菌体细胞平衡需要一段时间。保护剂与菌体在4℃放置30min以上平衡完成。
经过稳定性实验表明，预培养的细胞稳定性比对照组要好。前者于4℃的条件下贮藏90天后，凝乳时间损失36％；而对照组损失62％。
具体实施方式
实施例1
菌种由德氏乳杆菌保加利亚亚种CTCC6047和嗜热链球菌CTCC6038两种菌按照1：1的配比以2％接入发酵培养基中培养，用常规方法经过富集培养，离心后收集菌体，加入上述保护剂悬浮，于4℃放置平衡30min后进行预培养。预培养温度分别选择20℃，30℃，42℃，55℃，预培养时间分别选择1小时，2小时，3小时，进行初选，分别考察培养过程中pH和菌数的变化；考察预培养处理后的细胞经冻干后的成活率和凝乳时间。结果表明：菌体在20℃这个生长温度，各项指标很接近，pH和菌数都无变化，随着时间的延长，pH会看出些变化，但很微弱，这证明20℃下菌体只有微弱的代谢。55℃为菌体生长的上限，也没有代谢，而且菌体数量随着时间的延长递减，这证明该温度对菌体产生严重的伤害；30℃作为嗜温性乳酸菌的最适生长温度，杆菌和球菌有一定程度的代谢：比20℃强，但比42℃弱很多。在这些预培养温度中，以42℃时的菌体变化最显著，证明菌体在此温度下开始变得活跃。但在该温度下，菌体细胞生长不符合微生物在液体中发酵生长的一般规律，菌体数量从3h后开始下降，而在正常的液体发酵时，乳酸菌在这段时间正处于生长旺盛的对数期，分析原因可能是由于在如此一种体系中，细胞密度过大，营养成分的构成、渗透压等都不如100／o的牛奶中好，随着时间的 延长，有害代谢产物积累增多，很快就到了不适合菌体生长的程度。
20℃时菌体处于休眠状态，菌体没有发生变化，存活串随着时间的延长仍维持在初始状态的值71％，但由于3h后菌体休眠时间过长，菌体趋于不活跃，所以冻干后的凝乳时间延长5min。
30℃预培养的结果在存活率方面表现得较好，预培养3h时的存活率达到83％，比任何对照组都高。这可能是菌体细胞在此低温下产生的应激反应，体内或细胞膜产生了抵御冷冻、干燥等损伤的脂肪酸、蛋白质，这印证了国外大部分学者的报道，Mary等曾将这种应激状态产生的蛋白质分离出来。在42℃(最适生长温度)下，
预培养1h左右的存活率仅次于30℃3h的值，达到81％。但预培养3h后的存活率较低，只有68％。这可能是由于42℃预培养菌体代谢旺盛，在如此一种高菌体浓度的环境下，环境很快变得不适应菌体生长，代谢产物对菌体产生了损伤，所以2h后存活率开始下降。最重要的发现是：42℃预培养的细胞冻干后，比其他组的冻干活性要大得多，预培养1h的凝乳时间只有185min，比对照组不经过预培养的细胞要快25min，这表明经过42℃预培养的细胞，单个细胞的冻干活性得到了加强，印证了预培养设计的思路。
42℃被选择作为最佳预培养温度，再在此温度下对预培养时间做一个优化，选择能使菌体细胞达到最大冻干活性的预培养时间。将悬浮菌体于42℃分别预培养0、30、60、90、120、150min后测培养过程中pH和菌数的变化。冻干后测活性和存活率。
表142℃预培养时间对菌体冻干活性的影响

由上表可知，在42℃预培养过程中，菌体数量的变化{良微小，从0min到120min
菌体数量仅由2.6X109cfu／ml增加到3.0X109cfu／ml。继续培养，则菌体数量会下降，
150min后，菌体水平下降到初始浓度2.6X109cfu／ml。这可能是由于在此体系中，
细胞密度过大，营养成分的构成、渗透压等都不如10％的牛奶中好，所以生长代谢
相对微弱。至于pH为什么变化快，可能是能量代谢仍然可以顺利进行的缘故在活性方面，预培养到60min冻干后的凝乳时间为185min，活性最强。随着预培养时间的延长，菌体周围的环境恶化，菌体受到损伤，所以90m／n以后的细胞冻干活性开始下降。
综上所述，从存活率、凝乳时间等综合考察，选择预培养温度范围为30-45℃，优选为42℃：预培养时间为30-120分钟，优选为60分钟。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更 或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。