一种胰腺炎型鸭1型甲肝病毒弱毒疫苗株A75及其应用.pdf

本发明公开了一种胰腺炎型鸭1型甲肝病毒弱毒疫苗株A75，该毒株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.10492。该弱毒株，对雏鸭无致病力、免疫原性良好、适于细胞大量增殖、制备出的弱毒活疫苗应用于雏鸭，具有良好的免疫预防作用。弱毒活疫苗的制作方法，成本低，为现有鸭1型甲肝病毒活疫苗成本的1/8，且适于细胞培养规模化批量生产；不仅能有效预防胰腺炎型鸭1型甲肝病毒病，还可避免鸭胚液中所携带病毒的交叉污染疫苗免疫原性好，免疫保护率高，在96.7%以上，具有广阔的应用前景。

权利要求书
1.  一种胰腺炎型鸭1型甲肝病毒弱毒疫苗株A75，其特征在于，该毒株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.10492。

2.  如权利要求1所述的一种胰腺炎型鸭1型甲肝病毒弱毒疫苗株A75，其特征在于，采用以下步骤制备：
1）、在未感染疾病的11日龄番鸭胚上将胰腺炎型鸭1型甲肝病毒MPZJ1206连续传30代吗，收集第30代的病毒尿囊液作为在细胞上培养的病毒液；
2）、将第30代的番鸭胚尿囊液在鸭胚成纤维细胞上，接种量为鸭胚成纤维细胞体积的1/10，培养60分钟后，补加含有1%体积浓度的小牛血清和抗生素的培养基维持液进行病毒增殖；连续传代到50～80代；测定每代的TCID50和致病性，对无致病性的传代毒进行免疫原性和稳定性测定，直至获得符合制备弱毒活疫苗用的候选毒种；
3）、当细胞病变达到80%时，将T25细胞培养瓶置于-80℃冰箱冻存，结冻后取出细胞瓶放室温解冻，冻融两次后，于生物安全柜里用移液管用力吹打细胞，将病毒悬液移至离心管，以10000rpm离心15分钟，收集离心后的上清液，获得含胰腺炎型鸭1型甲肝病毒MPZJ1206弱毒疫苗株的液体，待用于后续的病毒滴度测定和弱毒疫苗制备。

3.  如权利要求2所述的一种胰腺炎型鸭1型甲肝病毒弱毒疫苗株A75，其特征在于，所述步骤2）中鸭胚成纤维细胞的制作方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）、取11日未感染疾病的龄番鸭胚，消毒；
2）、在无菌的生物安全柜内，用高压灭菌的镊子取出1）中的鸭胚，放于含PBS缓冲液的平皿内，洗涤两次后，剪掉鸭胚的头部、颈部、四肢及内脏，将剩余的胚体部分剪碎接着用体积浓度为0.25%的胰蛋白酶消化，再用移液管吹打细胞成单个的鸭胚成纤维细胞，用体积浓度为6%为小牛血清稀释成105/mL的细胞密度后，移至T25细胞培养瓶内，于37℃，5%CO2的细胞培养箱培养过夜。

4.  权利要求1所述的一种胰腺炎型鸭1型甲肝病毒弱毒疫苗株A75在预防雏鸭胰腺炎型鸭1型甲肝病毒病中的应用。

5.  如权利要求4所述的一种胰腺炎型鸭1型甲肝病毒弱毒疫苗株A75在雏鸭胰腺炎型鸭1型甲肝病毒病疫苗制作中的应用。

说明书一种胰腺炎型鸭1型甲肝病毒弱毒疫苗株A75及其应用
技术领域
本发明涉生物疫苗研发领域，具体为一种胰腺炎型鸭1型甲肝病毒弱毒疫苗株A75及其应用。
背景技术
鸭甲肝病毒（duck hepatitis A virus, DHAV）是引起雏鸭病毒性肝炎的病原，属小RNA病毒科禽肝病毒属成员。
鸭甲肝病毒可分为DHAV-1、DHAV-2和DHAV-3三种基因型。
自1999年以来，我国鸭群流行的鸭肝炎病毒除主要的DHAV-1外，DHAV-3日渐增多，且两者主要侵害3周龄内的雏鸭，其中以北京雏鸭、樱桃谷雏鸭最易感，发病率高达70%、病死率高达60%，病死鸭主要临床特征多呈角弓反张和肝脏肿大、出血，这些特征为临床快速诊断该病的重要依据。
然而2011年9月，我国浙江省金华等地区和福建省莆田等地区7~30日龄雏番鸭发生以胰腺发黄（暂称为胰腺炎）为特征的疫病，发病率20%~30%、病死率25%~40%。至今，浙江、福建、广东、广西等六省（市、自治区）的雏番鸭和雏半番鸭均有发生此病，对我国养鸭业构成了较大危害。
我们经过大量试验研究确定其病原为鸭1型甲肝病毒，但所致特征病变却为胰腺发黄、胰腺上皮细胞严重变性和坏死，完全不同于引起典型肝炎的DHAV-1（称为肝炎型DHAV-1）所致的肝脏严重出血、肝细胞严重变性和坏死的特征病变。
为区别起见，将新流行的致胰腺发黄的鸭1型甲肝病毒暂定名为胰腺炎型鸭1型甲肝病毒（胰腺炎型鸭1型甲肝病毒）。
经过与肝炎型鸭1型甲肝病毒血清发生交叉中和试验，确定其为鸭1型甲肝病毒亚型。
由于使用现有的鸭1型甲肝病毒疫苗对其预防效果不理想，亚型的出现给DHAV-1的预防带来了新的挑战，因此对于胰腺炎型鸭1型甲肝病毒疫苗的研发刻不容缓。
疫苗免疫是预防畜禽病毒病的首选。
由于我国中养鸭生产大国，其饲养量占全球总量的75%以上，胰腺炎型鸭1型甲肝病毒发生地域广、危害大，因此获得适于研制活疫苗用的胰腺炎型鸭1型甲肝病毒的致弱毒株对其疫苗的研发至关重要。
目前尚未见胰腺炎型鸭1型甲肝病毒弱毒株的相关报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有的缺陷，提供一种胰腺炎型鸭1型甲肝病毒弱毒疫苗株A75。
本发明将4株新分离鉴定的胰腺炎型鸭1型甲肝病毒MPZJ1206毒株经过在鸭胚传代适应后，又在鸭胚成纤维细胞上进行连续传代，经过多代细胞连续培养致弱了胰腺炎型鸭1型甲肝病毒，并获得了1株对雏鸭无致病力、免疫原性良好、适于细胞大量增殖、符合制备活疫苗用的候选弱毒株A75，其特征在于，该毒株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.10492；用该弱毒株A75制备出的弱毒活疫苗应用于雏鸭，具有良好的免疫预防作用，免疫雏番鸭保护率96.7%以上。
该胰腺炎型鸭1型甲肝病毒弱毒疫苗株A75，的制备方法包括以下步骤制备：
1）、在未感染疾病的11日龄番鸭胚上将胰腺炎型鸭1型甲肝病毒MPZJ1206连续传30代吗，收集第30代的病毒尿囊液作为在细胞上培养的病毒液；每代接3枚胚，并观察和纪录每一代番鸭胚胚体病变情况、死亡时间和死亡率；
结果：MPZJ1206毒株盲传到第17代至第30代，100%的番鸭胚于接种后72h~96h死亡。剖检鸭胚的病变为胚头、颈部、胸部、翅膀及爪部均有出血。
2）、将第30代的番鸭胚尿囊液在鸭胚成纤维细胞上，接种量为鸭胚成纤维细胞体积的1/10，培养60分钟后，补加含有1%体积浓度的小牛血清和抗生素（2000IU青霉素和2000μg/mL链霉素）的培养基维持液进行病毒增殖；连续传代到50～80代；测定每代的TCID50和致病性，对无致病性的传代毒进行免疫原性和稳定性测定，直至获得符合制备弱毒活疫苗用的候选毒种；
3）、当细胞病变达到80%时，将T25细胞培养瓶置于-80℃冰箱冻存，结冻后取出细胞瓶放室温解冻，冻融两次后，于生物安全柜里用移液管用力吹打细胞，将病毒悬液移至离心管，以10000rpm离心15分钟，收集离心后的上清液，获得含胰腺炎型鸭1型甲肝病毒MPZJ1206弱毒疫苗株的液体，待用于后续的病毒滴度测定和弱毒疫苗制备。
进一步的，鸭胚成纤维细胞的制作方法
1）、取11日未感染疾病的龄番鸭胚（无胰腺炎型DHAV-1母源抗体），消毒；
2）、在无菌的生物安全柜内，用高压灭菌的镊子取出1）中的鸭胚，放于含PBS缓冲液的平皿内，洗涤两次后，剪掉鸭胚的头部、颈部、四肢及内脏，将剩余的胚体部分剪碎接着用体积浓度为0.25%的胰蛋白酶消化，再用移液管吹打细胞成单个的鸭胚成纤维细胞，用体积浓度为6%为小牛血清稀释成105/mL的细胞密度后，移至T25细胞培养瓶内，于37℃，5%CO2的细胞培养箱培养过夜，，次日用于接种胰腺炎型DHAV-1。
该胰腺炎型鸭1型甲肝病毒弱毒疫苗株A75在预防雏鸭胰腺炎型鸭1型甲肝病毒病中，特别是疫苗的制作中具有很好的效果。
用该胰腺炎型鸭1型甲肝病毒弱毒疫苗株A75制作疫苗的方法如下：
将该胰腺炎型鸭1型甲肝病毒弱毒疫苗株A75，作为疫苗生产种子，以细胞培养基维持液作稀释10倍，接种在鸭成纤维细胞上，当细胞病变达到80%时，把细胞培养瓶转入-80℃冰箱反复冻融两次后，收集病毒悬液，进行无菌检验达标后，以10000rpm离心15分钟，收集离心后的上清液，分装5mL（用于纯净性检验和TCID50测定），其余冷藏保存。
致弱病毒活疫苗的安全性检验：
将1日龄雏番鸭（无鸭1型甲肝病毒母源抗体）60只随机均分为甲乙丙丁组，甲组每只肌肉注射病毒液0.1mL，乙组每只肌肉注射病毒液0.5mL，丙组每只肌肉注射病毒液1mL，丁组为空白对照，观察症状，于免疫后第3d，7d，14d，21d和28d时每组抽3只番鸭剖解，观察病理变化，取胰腺和肝脏固定于10%福尔马林溶液中，制作病理切片，观察组织显微变化，评价致弱株安全性。
结果：每只肌肉注射，观察35d，结果一、二、三和四组番鸭胰脏和肝脏均未出现眼观病理变化和显微变化。不管是大剂量、中等剂量还是小剂量病毒液免疫1日龄雏番鸭，在观察时间内，均未出现不良反应，表明制备的致弱病毒疫苗安全性良好。
致弱病毒活疫苗的免疫保护试验：
　　将1日龄雏番鸭（无鸭1型甲肝病毒母源抗体）60只，随机分为2组，30只/组，其中1组每只腿部肌肉注射致弱病毒液0.1mL（TCID5010-7.75/0.1mL），另一组注射细胞培养基维持液作为对照，免疫后7d，对所有鸭进行采血、分离血清和抗胰腺炎型鸭1型甲肝病毒抗体测定，同时每只鸭肌注5╳104.5TCID50胰腺炎型鸭1型甲肝病毒，观察14d，纪录数据。
结果：30只雏番鸭免疫后中和抗体滴度平均为25.6。细胞培养基维持液对照鸭抗体为阴性。
肌注5╳104.5TCID50胰腺炎型鸭1型甲肝病毒：疫苗免疫组有1只出现临床症状，5天后逐渐康复，保护率达到96.7%。
胰腺炎型鸭1型甲肝病毒弱毒活疫苗的应用
取1日龄雏番鸭（无鸭1型甲肝病毒母源抗体）330只，每只腿部肌肉注射致弱病毒液0.1mL（TCID5010-7.75/0.1mL），免疫后7d，对所有鸭进行采血、分离血清和抗胰腺炎型鸭1型甲肝病毒抗体测定。
结果：330只雏番鸭免疫后中和抗体滴度平均为25.4。
本发明首次利用鸭胚及其成纤维细胞，经多代传接成功致弱了胰腺炎型鸭1型甲肝病毒，并获得了对雏鸭无致病力、免疫原性良好、适于细胞大量增殖、符合制备活疫苗用的候选弱毒株，且制备出的弱毒活疫苗应用于雏鸭，具有良好的免疫预防作用。弱毒活疫苗的制作方法，成本低，为现有鸭1型甲肝病毒活疫苗成本的1/8，且适于细胞培养规模化批量生产；不仅能有效预防胰腺炎型鸭1型甲肝病毒病，还可避免鸭胚液中所携带病毒的交叉污染疫苗免疫原性好，免疫保护率高，在96.7%以上，具有广阔的应用前景。
具体实施方式
以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
该胰腺炎型鸭1型甲肝病毒弱毒疫苗株A75，的制备方法包括以下步骤制备：
1）、在未感染疾病的11日龄番鸭胚上将胰腺炎型鸭1型甲肝病毒MPZJ1206连续传30代吗，收集第30代的病毒尿囊液作为在细胞上培养的病毒液；每代接3枚胚，并观察和纪录每一代番鸭胚胚体病变情况、死亡时间和死亡率；
结果：MPZJ1206毒株盲传到第17代至第30代，100%的番鸭胚于接种后72h~96h死亡。剖检鸭胚的病变为胚头、颈部、胸部、翅膀及爪部均有出血。
2）、取11日未感染疾病的龄番鸭胚（无胰腺炎型DHAV-1母源抗体），消毒；在无菌的生物安全柜内，用高压灭菌的镊子取出1）中的鸭胚，放于含PBS缓冲液的平皿内，洗涤两次后，剪掉鸭胚的头部、颈部、四肢及内脏，将剩余的胚体部分剪碎接着用体积浓度为0.25%的胰蛋白酶消化，再用移液管吹打细胞成单个的鸭胚成纤维细胞，用体积浓度为6%为小牛血清稀释成105/mL的细胞密度后，移至T25细胞培养瓶内，于37℃，5%CO2的细胞培养箱培养过夜，，次日用于接种胰腺炎型DHAV-1。
3）将第30代的番鸭胚尿囊液在鸭胚成纤维细胞上，接种量为鸭胚成纤维细胞体积的1/10，培养60分钟后，补加含有1%体积浓度的小牛血清和抗生素（2000IU青霉素和2000μg/mL链霉素）的培养基维持液进行病毒增殖；连续传代到50～80代；测定每代的TCID50和致病性，对无致病性的传代毒进行免疫原性和稳定性测定，直至获得符合制备弱毒活疫苗用的候选毒种；
4）、当细胞病变达到80%时，将T25细胞培养瓶置于-80℃冰箱冻存，结冻后取出细胞瓶放室温解冻，冻融两次后，于生物安全柜里用移液管用力吹打细胞，将病毒悬液移至离心管，以10000rpm离心15分钟，收集离心后的上清液，获得含胰腺炎型鸭1型甲肝病毒MPZJ1206弱毒疫苗株的液体，待用于后续的病毒滴度测定和弱毒疫苗制备。
病毒滴度（TCID50）测定
将待检病毒液进行一系列倍比稀释（10-1~10-10），在96孔细胞培养板上感染鸭胚成纤维细胞，纪录细胞病变情况，在病毒感染5天后，按Reed-Muench法计算病毒滴度TCID50值。
结果：选取第20、30、40、50、60、70、75、80代细胞毒测定其的TCID50和毒株的安全性、免疫原性和稳定性。第20代的细胞毒的病毒效价为10-4.75/0.1mL，随后的传代毒病毒滴度逐步增加，当第70-75代的病毒效价基本稳定在左右10-7.75；不同代次的细胞毒引起细胞病变的时间也随着传代次数的增加有所缩短，第20代时该病毒的病变时间为72h左右，到第70代在48h时即可明显的细胞病变。选用75代作为弱毒疫苗的预备毒种，为了证明该毒株在鸭胚成纤维细胞已稳定遗传，此基础上再传了5代，且在第80代时TCID50在10-7.75/0.1mL左右和病变时间仍为48h。因此，选用75代作为弱毒疫苗的预备毒种（结果见表1）。
表1 不同代次传代毒对鸭胚成纤维细胞的致病性研究
病毒代次TCID50（/0.1mL）CPE形成时间（h）2010-4.75723010-5.5704010-6.25645010-6.75606010-7.5507010-7.75487510-7.75488010-7.748
纯净性检验
按照常规方法排除致弱病毒内无细菌、支原体和其他外源病毒的污染。
致病性试验
选取第20、30、40、50、60、70、75、80代细胞毒分别对15只1日龄雏番鸭（无鸭1型甲肝病毒母源抗体）进行感染试验，攻毒剂量为5╳104.5TCID50，同时设计空白对照，感染后观察雏鸭的临床症状和病理变化，观察14d，记录数据。
结果：不同代次的细胞毒的攻毒试验结果表明，当20-30代时，雏鸭的发病率为93.3%，随着病毒代次的升高，雏鸭的发病率越来越低。当病毒代次达70代时，雏鸭不发病，连续再传5代，雏鸭仍然不发病。因此选择75代病毒作为疫苗的候选毒株，为了验证该病毒已致弱，再传5代，该病毒对其易感动物（番鸭）仍无致病性。结果表明这株病毒在细胞上连续传代后已经致弱（见表2）。
表2 不同代次传代毒对易感动物的致病性研究
病毒代次发病数发病率（%）201493.3301493.340128050853.360426.7700075008000
攻毒保护试验
1日龄雏番鸭（无鸭1型甲肝病毒母源抗体）90只，随机分为6组，15只/组，其中5组每只腿部肌肉分别注射以细胞培养基维持液 10、 100、1000和10000倍稀释的致弱病毒液与病毒原液0.1mL，另外1组细胞培养基维持液，接种后7d，对所有鸭进行采血、分离血清和对最小免疫剂量组进行抗胰腺炎型鸭1型甲肝病毒抗体的测定，同时以胰腺炎型鸭1型甲肝病毒肌注，每羽0.5mL（5╳104.5TCID50），观察14d，纪录数据。
结果：致弱病毒原液和10倍稀释（106.75TCID50）的剂量接种组鸭均健康，攻毒保护指数即为100%；100倍稀释（105.75TCID50）的剂量接种组1只鸭发病，5天后逐渐康复，攻毒保护指数达83.3%；而细胞培养基维持液对照组全发病。攻毒保护试验结果见表3。
表3攻毒保护试验

致弱病毒安全性检验
1日龄雏番鸭（无鸭1型甲肝病毒母源抗体）60只均分4组，一组每只肌肉注射病毒液0.1mL，二组每只肌肉注射病毒液0.5mL，三组每只肌肉注射病毒液1mL，四组为空白对照，观察症状，于免疫后第3d，7d，14d，21d和28d时每组抽3只番鸭剖解，观察病理变化，取胰腺和肝脏固定于10%福尔马林溶液中，制作病理切片，观察组织显微变化，评价致弱株安全性。
结果：每只肌肉注射，观察28d，结果一、二、三和四组番鸭胰脏和肝脏均未出现眼观病理变化和显微变化。不管是大剂量、中等剂量还是小剂量病毒液免疫1日龄雏番鸭，在观察时间内，均未出现不良反应，表明制备的致弱病毒株安全性良好。
胰腺炎型鸭1型甲肝病毒细胞弱毒活疫苗的制备
①基础种子批建立
    取第75代细胞冻干毒种，以细胞培养基维持液作l：10稀释，接种鸭成纤维细胞，当细胞病变达到80%时，把细胞培养瓶转入-80℃冰箱反复冻融两次后，收集病毒悬液，进行无菌检验达标后，以10000rpm离心15分钟，收集离心后的上清液，获得含胰腺炎型DHAV-1的液体作为基础种子，置-80℃冰箱保存备用。
②生产种子批建立
    将基础毒种接种于成纤维细胞，当细胞病变达到80%时，把细胞培养瓶转入-80℃冰箱反复冻融两次后，收集病毒悬液，以10000rpm离心15分钟，收集离心后的上清液，获得含胰腺炎型DHAV-1的液体，按生产种子批指定的检验标准进行检验，即得生产毒种。
③弱毒活疫苗的制备
取生产用胰腺炎型鸭1型甲肝病毒MPZJ1206株毒种，以细胞培养基维持液作l：10稀释，接种鸭成纤维细胞，当细胞病变达到80%时，把细胞培养瓶转入-80℃冰箱反复冻融两次后，收集病毒悬液，进行无菌检验达标后，以10000rpm离心15分钟，收集离心后的上清液，分装5mL（用于纯净性检验和TCID50测定），其余冷藏保存。
胰腺炎型鸭1型甲肝病毒弱毒活疫苗的测定
致弱病毒活疫苗的安全性检验：
将1日龄雏番鸭（无鸭1型甲肝病毒母源抗体）60只随机均分为甲乙丙丁组，甲组每只肌肉注射病毒液0.1mL，乙组每只肌肉注射病毒液0.5mL，丙组每只肌肉注射病毒液1mL，丁组为空白对照，观察症状，于免疫后第3d，7d，14d，21d和28d时每组抽3只番鸭剖解，观察病理变化，取胰腺和肝脏固定于10%福尔马林溶液中，制作病理切片，观察组织显微变化，评价致弱株安全性。
结果：每只肌肉注射，观察35d，结果一、二、三和四组番鸭胰脏和肝脏均未出现眼观病理变化和显微变化。不管是大剂量、中等剂量还是小剂量病毒液免疫1日龄雏番鸭，在观察时间内，均未出现不良反应，表明制备的致弱病毒疫苗安全性良好。
致弱病毒活疫苗的免疫保护试验：
将1日龄雏番鸭（无鸭1型甲肝病毒母源抗体）60只，随机分为2组，30只/组，其中1组每只腿部肌肉注射致弱病毒液0.1mL（TCID5010-7.75/0.1mL），另一组注射细胞培养基维持液作为对照，免疫后7d，对所有鸭进行采血、分离血清和抗胰腺炎型鸭1型甲肝病毒抗体测定，同时每只鸭肌注5╳104.5TCID50胰腺炎型鸭1型甲肝病毒，观察14d，纪录数据。
结果：30只雏番鸭免疫后中和抗体滴度平均为25.6。细胞培养基维持液对照鸭抗体为阴性。
肌注5╳104.5TCID50胰腺炎型鸭1型甲肝病毒：疫苗免疫组有1只出现临床症状，5天后逐渐康复，保护率达到96.7%。
胰腺炎型鸭1型甲肝病毒弱毒活疫苗的应用
取1日龄雏番鸭（无鸭1型甲肝病毒母源抗体）330只，每只腿部肌肉注射致弱病毒液0.1mL（TCID5010-7.75/0.1mL），免疫后7d，对所有鸭进行采血、分离血清和抗胰腺炎型鸭1型甲肝病毒抗体测定。
结果：330只雏番鸭免疫后中和抗体滴度平均为25.4。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。
凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。