一种植物乳杆菌液体培养基及植物乳杆菌的发酵培养方法.pdf

本发明公开了一种植物乳杆菌液体培养基植物乳杆菌的发酵培养方法，以糖蜜、玉米浆、鱼溶浆、磷酸氢二铵等为原料，糖蜜替代MRS葡萄糖，玉米浆替代牛肉膏，鱼溶浆替代酵母粉，无机氮源替代蛋白胨。采用低成本的农业副产品部分或全部替代MRS培养基中的葡萄糖和有机氮源，同时优化培养基组合，不仅提高了植物乳杆菌的菌体数量和有机酸含量，同时明显降低了生产成本。

权利要求书
1.  一种植物乳杆菌液体培养基，其特征在于，其配方组成如下：
糖蜜10-50g/L，玉米浆10-50g/L，鱼溶浆10-50g/L，磷酸氢二铵5-25g/L， 乙酸钠2-8g/L，硫酸镁0.5-1g/L，硫酸锰0.1-0.5g/L，吐温1-3mL/L；
其中，培养基的pH值为6.0-6.8左右。

2.  根据权利要求1所述的植物乳杆菌液体培养基，其特征在于，其配方组 成如下：
糖蜜40g/L，玉米浆10g/L，鱼溶浆15g/L，磷酸氢二铵5g/L，乙酸钠5g/L， 硫酸镁0.58g/L，硫酸锰0.25g/L，吐温1mL/L。

3.  根据权利要求1或2所述的植物乳杆菌液体培养基，其特征在于，所述 鱼溶浆用鱼粉替代。

4.  根据权利要求3所述的植物乳杆菌液体培养基，其特征在于，所述玉米 浆用大豆提取液替代。

5.  根据权利要求1或2所述的植物乳杆菌液体培养基，其特征在于，所述 玉米浆用大豆提取液替代。

6.  一种植物乳杆菌的发酵培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
以植物乳杆菌为发酵菌株，接入MRS液体培养基中活化处理；将活化后的 植物乳杆菌，接入如权利要求1～5任一所述的植物乳杆菌液体培养基中，接种 量为4％～10％，进行发酵培养18～24小时；
其中，发酵培养的条件为在30～35℃下厌氧静置培养。

7.  根据权利要求6所述的植物乳杆菌的发酵培养方法，其特征在于，所述 活化处理的过程为在MRS液体培养基中30℃培养24小时。

说明书一种植物乳杆菌液体培养基及植物乳杆菌的发酵培养方法
技术领域
本发明涉及乳酸菌培养技术领域，尤其涉及的是一种植物乳杆菌液体培养 基植物乳杆菌的发酵培养方法。
背景技术
植物乳杆菌可以产生有机酸、细菌素、过氧化氢、双乙酰等多种天然抑菌 物质，因此应用于生物饲料中既可以产更多的益生菌活菌数，又可以产生天然 的抑菌物质，起到饲料防腐的同时，饲喂动物又能更好的维持肠道内菌群平衡， 提高机体免疫抗病能力，促进动物更加健康生长。由于在固态发酵基质中的水 溶性碳氮源比较少，所以植物乳杆菌利用豆粕、玉米粉效果不好，在固态发酵 时要迅速增长繁殖也比较困难。
采用乳酸菌专用MRS培养基进行生产，可以使乳酸菌生长迅速。但是，利 用实验室MRS培养基进行工业化大生产的成本也较昂贵，不适合饲用乳酸菌生 产。
国内外研究表明，植物乳杆菌培养基中利用葡萄糖或蔗糖作碳源比较常见， 薛德林等利用葡萄糖、蔗糖、蔗糖蜜、玉米浆等原材料，发酵生产了高密度的 酿酒酵母与嗜酸乳杆菌的饲料用复合微生物制剂(CN103173371A，酿酒酵母与 嗜酸乳杆菌的饲料用复合微生物制剂的生产)。虽然菌数达到高数量级，但该 工艺需要将酿酒酵母与嗜酸乳杆菌分开发酵并离心浓缩再复配，工艺流程复杂， 成本不低。
国内利用果蔬类如菊芋汁、番茄汁替代葡萄糖作碳源的专利也较多，其中 田洪涛等利用菊芋汁、番茄汁培养保加利亚乳杆菌，效果不错，成本降低了1600 元(CN184435保加利亚乳杆菌复合增菌培养基)。贾英民利用菊芋汁培养双歧 杆菌，使双歧杆菌最高生长量达109cfu/mL(CN1584013，一种双歧杆菌发酵用 复合培养基及其制备方法)。韩瑨植物乳杆菌ST-Ⅲ接种于灭菌番茄汁中，植物 乳杆菌ST-III在该培养基中的发酵增殖效果与实验室常用的MRS培养基相当； 但发酵获得相同剂量ST-III活菌花费的成本比MRS培养基降低80％ (CN102732470A，一种纯天然、低成本的植物乳杆菌ST-Ⅲ培养方法及其产品 和应用)。利用果蔬类原材料做发酵培养基虽然成本有明显降低，但由于菊芋 与番茄是人畜共用果蔬，作为饲料添加大量使用将会带来对人类供应的紧张， 价格不易控制。
因此，现有技术还有待于改进和发展。
发明内容
本发明的目的在于提供一种植物乳杆菌液体培养基及植物乳杆菌的发酵培 养方法，配方中采用糖蜜替代MRS葡萄糖，玉米浆替代牛肉膏，鱼溶浆替代酵 母粉，无机氮源替代蛋白胨，同时简化对植物乳杆菌生长影响因素不大的原料， 以解决上述现有技术中植物乳杆菌发酵培养存在的成本过高或培养工艺流程复 杂的问题。
本发明的技术方案如下：
一种植物乳杆菌液体培养基，其中，其配方组成如下：
糖蜜10-50g/L，玉米浆10-50g/L，鱼溶浆10-50g/L，磷酸氢二铵5-25g/L， 乙酸钠2-8g/L，硫酸镁0.5-1g/L，硫酸锰0.1-0.5g/L，吐温1-3mL/L；
其中，培养基的pH值为6.0-6.8左右。
所述的植物乳杆菌液体培养基，其中，其配方组成如下：
糖蜜40g/L，玉米浆10g/L，鱼溶浆15g/L，磷酸氢二铵5g/L，乙酸钠5g/L， 硫酸镁0.58g/L，硫酸锰0.25g/L，吐温1mL/L。
所述的植物乳杆菌液体培养基，其中，所述鱼溶浆用鱼粉替代。
所述的植物乳杆菌液体培养基，其中，所述玉米浆用大豆提取液替代。
一种植物乳杆菌的发酵培养方法，其中，包括以下步骤：
以植物乳杆菌为发酵菌株，接入MRS液体培养基中活化处理；将活化后的 植物乳杆菌，接入如权利要求1～5任一所述的植物乳杆菌液体培养基中，接种 量为4％～10％，进行发酵培养18～24小时；
其中，发酵培养的条件为在30～35℃下厌氧静置培养。
所述的植物乳杆菌的发酵培养方法，其中，所述活化处理的过程为在MRS 液体培养基中30℃培养24小时。
本发明所提供的植物乳杆菌液体培养基，以糖蜜、玉米浆、鱼溶浆、磷酸 氢二铵等为原料，糖蜜替代MRS葡萄糖，玉米浆替代牛肉膏，鱼溶浆替代酵母 粉，无机氮源替代蛋白胨。采用低成本的农业副产品部分或全部替代MRS培养 基中的葡萄糖和有机氮源，同时优化培养基组合，不仅提高了植物乳杆菌的菌 体数量和有机酸含量，同时明显降低了生产成本。
附图说明
图1为本发明实施例1中实验组和对照组的生长曲线图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚、明确，以下通过详细描述 以及举实施例对本发明进一步详细说明。
本发明提供一种植物乳杆菌液体培养基，以糖蜜、玉米浆、鱼溶浆、磷酸 氢二铵等为原料，糖蜜替代MRS葡萄糖，玉米浆替代牛肉膏，鱼溶浆替代酵母 粉，无机氮源替代蛋白胨。糖蜜为制糖副产物，含有大量的可发酵糖(主要是 蔗糖)，因此是很好的发酵原料。玉米浆是制玉米淀粉的副产物，含有丰富的 可溶性蛋白、生长素和一些前体物质，是微生物生长很普遍应用的有机氮源。 鱼溶浆主要成分为游离氨基酸、低分子肽、核酸和水溶性维生素及微量元素， 不仅补充原MRS培养基生长因子不足的缺点，还可替代蛋白胨、牛肉膏、酵母 膏，降低成本，而且具有很强的诱食性，为后期生产固态生物饲料提供良好的 原材料。所述植物乳杆菌液体培养基既作为种子培养基配方，也作为发酵培养 基配方，在使用前需要采用MRS液体培养基进行活化。
具体地，所述植物乳杆菌液体培养基，其配方组成如下：
糖蜜10-50g/L，玉米浆10-50g/L，鱼溶浆10-50g/L，磷酸氢二铵5-25g/L， 乙酸钠2-8g/L，硫酸镁0.5-1g/L，硫酸锰0.1-0.5g/L，吐温801-3mL/L。
其中，培养基的pH值为6.0-6.8左右。鱼溶浆可以采用鱼粉替代；玉米浆 可以采用大豆提取液替代。
进一步地，本发明中还提供最佳实施方案，所述植物乳杆菌液体培养基， 其配方组成如下：
糖蜜40g/L，玉米浆10g/L，鱼溶浆15g/L，磷酸氢二铵5g/L，乙酸钠5g/L， 硫酸镁0.58g/L，硫酸锰0.25g/L，吐温801mL/L。
本发明中还提供一种植物乳杆菌的发酵培养方法，采用本发明植物乳杆菌 液体培养基对植物乳杆菌进行发酵培养，其步骤如下：
以植物乳杆菌为发酵菌株，取斜面菌种一环，接入MRS液体培养基中进行 活化处理，将活化后的植物乳杆菌，接入本发明液体培养基中，接种量为4％～ 10％，进行发酵培养18～24h。其中，发酵培养的条件为：在30～35℃下厌氧静 置培养。
本发明通过改变优化种子培养基，驯化培养植物乳杆菌，使植物乳杆菌既 能提前适应后期发酵的环境，又能快速生长，使植物乳杆菌活菌数在生物饲料 中达到一定数量级，植物乳杆菌菌体数量可达30～50亿cfu/mL以上，较优化前 培养基10～20亿cfu/mL，活菌数提高了2～5倍，总酸含量从1.0-1.5％提高到 1.7～3％以上。而且，采用低成本的农业副产品部分或全部替代MRS培养基中的 葡萄糖和有机氮源，既成本低廉，又充分利用了资源。培养基成本从MRS培养 基2855元/吨左右降低至843元/吨左右，降低2000元左右成本。另外，本发明 所提供的植物乳杆菌液体培养基，不仅适用于植物乳杆菌的发酵培养，也可以 用于嗜酸乳杆菌的发酵培养。
下面结合实施例对本发明作进一步描述。
实施例1
1、本发明液体培养基：
糖蜜40g，玉米浆10g，鱼溶浆15g，磷酸氢二铵5g，乙酸钠5g，硫酸镁 0.58g，硫酸锰0.25g，吐温80 1mL，蒸馏水1L，pH值为6.8。
2、对比例配方：
(1)种子培养基：蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母粉5.0g、葡萄糖5.0g、 吐温80 1.0mL、柠檬酸氢二铵2.0g、无水乙酸钠5.0g、K2HPO42.0g、 MnSO4·H2O 0.25g、MgSO4·7H2O 0.58g、蒸馏水1.0L，pH值6.8。
(2)MRS固体培养基：蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0g、酵母膏5.0g、葡萄 糖20.0g、无水乙酸钠5.0g、柠檬酸氢二铵2.0g、吐温80 1.0mL、K2HPO42.0 g、MgSO4·7H2O 0.58g、MnSO4·H2O 0.25g、琼脂20.0g、蒸馏水1.0L，pH 值6.8。
(3)MRS液体培养基：蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0g、酵母粉5.0g、葡萄 糖20.0g、吐温80 1.0mL、柠檬酸氢二铵2.0g、无水乙酸钠5.0g、K2HPO42.0 g、MnSO4·H2O 0.25g、MgSO4·7H2O 0.58g、蒸馏水1.0L，pH值6.8。
3、配置方法如下：
称取培养基各配方进行溶解，调配最适pH值。
将上述溶解的培养基配方进行121℃灭菌20min，含葡萄糖培养基单独115℃ 灭菌30min。
4、植物乳杆菌的培养方法如下：
培养条件：以植物乳杆菌为发酵菌株，接种至MRS液体培养基中活化后再 转接种至本发明液体培养基中，初始pH值6.2～6.8，在30～35℃下厌氧静置培 养18～24h，接种量(v/v)为4～10％。以本发明培养基配方培养植物乳杆菌为 实验组，在相同条件下转接至以MRS液体培养基中培养植物乳杆菌作对照组。
5、生长曲线的测定
取斜面菌种一环，接入MRS液体培养基中，30℃培养24h活化，将活化后 的植物乳杆菌，分别接入50mL的本发明液体培养基和50mL的MRS液体培养 基中，接种量为4％。在35℃下厌氧静置培养24h，每隔2h取样，直到发酵终 止。以对应的未接入菌种的液体培养基作参比，测定样品OD600nm值。绘制植 物乳杆菌在不同培养基中的生长曲线，生长曲线如图1所示。
6、植物乳杆菌生物量的测定
取培养结束的发酵液2mL至离心管中，在8000r/min转速下离心8min，倒 去上清液，加入1mL蒸馏水后震荡溶解成菌悬液，最后稀释成适当倍数后，利 用分光光度计测得OD600nm值，以对应的未接入菌种的液体培养基为参比。
实验组培养20h后植物乳杆菌OD600nm值为10.33，对照组培养18h后植 物乳杆菌OD600nm达最高为9.01。
7、植物乳杆菌活菌数的测定
培养结束后摇匀取样，采用平板梯度稀释涂布法检测发酵液中的植物乳杆 菌的活菌数。
其中，实验组培养20h后植物乳杆菌活菌数达40亿cfu/mL以上，对照组 培养18h后植物乳杆菌活菌数达18亿cfu/mL左右。
8、总有机酸含量的测定
培养结束后取5mL发酵液于烧杯中，采用酸碱滴定的方法测定总有机酸含 量。
其中，实验组培养20h后总有机酸含量为1.8％，对照组培养18h后总有机 酸含量1.5％。
9、成本对照
将实验组配方成本与对照组进行对比，对比结果如下表1所示，实验组的 成本为843元/吨左右，对照组MRS培养基的成本为2855元/吨左右，实验组比 对照组成本低2000元左右。
表1 两种培养基配方成本对照表

实施例2
所述植物乳杆菌液体培养基，其配方组成如下：
糖蜜20g/L，玉米浆30g/L，鱼溶浆50g/L，磷酸氢二铵15g/L，乙酸钠5g/L， 硫酸镁0.85g/L，硫酸锰0.5g/L，吐温80 1.5mL/L。
取斜面菌种一环，接入MRS液体培养基中，30℃培养24h活化，将活化后 的植物乳杆菌，接入50mL本实施例的液体培养基中，初始pH值6.2。在30℃ 下厌氧静置培养20h，接种量(v/v)为4％。
培养结束后摇匀取样，采用平板梯度稀释涂布法检测发酵液中的植物乳杆 菌的活菌数，本实施例中植物乳杆菌菌体数量达30亿cfu/mL以上。
培养结束后取5mL发酵液于烧杯中，采用酸碱滴定的方法测定总有机酸含 量，本实施例中总有机酸含量为1.7％。
实施例3
所述植物乳杆菌液体培养基，其配方组成如下：
糖蜜50g/L，玉米浆5g/L，鱼溶浆15g/L，磷酸氢二铵5g/L，乙酸钠3g/L， 硫酸镁0.7g/L，硫酸锰0.35g/L，吐温80 3mL/L。
其中，培养基的pH值为6.3。
取斜面菌种一环，接入MRS液体培养基中，30℃培养24h活化，将活化后 的植物乳杆菌，接入50mL本实施例的液体培养基中，初始pH值6.3。在30℃ 下厌氧静置培养20h，接种量(v/v)为4％。
培养结束后摇匀取样，采用平板梯度稀释涂布法检测发酵液中的植物乳杆 菌的活菌数，本实施例中植物乳杆菌菌体数量达37亿cfu/mL以上。
培养结束后取5mL发酵液于烧杯中，采用酸碱滴定的方法测定总有机酸含 量，本实施例中总有机酸含量为2.0％。
实施例4
所述植物乳杆菌液体培养基，其配方组成如下：
糖蜜40g/L，大豆提取液10g/L，鱼粉15g/L，磷酸氢二铵5g/L，乙酸钠5g/L， 硫酸镁0.58g/L，硫酸锰0.25g/L，吐温80 1mL/L。其中，培养基的pH值为6.8。
取斜面菌种一环，接入MRS液体培养基中，30℃培养24h活化，将活化后 的植物乳杆菌，接入50mL本实施例的液体培养基中，初始pH值6.8。在30℃ 下厌氧静置培养24h，接种量(v/v)为4％。
培养结束后摇匀取样，采用平板梯度稀释涂布法检测发酵液中的植物乳杆 菌的活菌数，本实施例中植物乳杆菌菌体数量达35亿cfu/mL以上。
培养结束后取5mL发酵液于烧杯中，采用酸碱滴定的方法测定总有机酸含 量，本实施例中总有机酸含量为2.0％。
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员 来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发 明所附权利要求的保护范围。