一种利用无色透明EVA热熔胶棒制作真菌分生孢子器临时玻片标本的方法.pdf

本发明公开一种利用无色透明EVA热熔胶棒制作真菌分生孢子器临时玻片标本的方法。该方法包括在真菌分生孢子器上用无水乙醇脱水进行固定和脱水，用无色透明EVA热熔胶棒的一端置于酒精灯上至熔而不滴后包埋真菌分生孢子器。用本发明方法制作真菌分生孢子器临时玻片标本步骤节省、省去了FAA固定液固定及透明等的程序，节省时间、效率高，无需专用贵重设备、成本大为降低，本发明采用了全新的包埋物，制片效果较好，完全能满足真菌界分生孢子器形态学鉴定的需要。

权利要求书
1.  一种利用无色透明EVA热熔胶棒制作真菌分生孢子器临时玻片标本的方 法，其特征在于包括以下步骤：
(1)取材
在5倍的体视显微镜下，从PDA培养基平板上挑取真菌分生孢子器，放到载 玻片上备用；
(2)固定和脱水
在所述真菌分生孢子器上滴加25μL～200μL无水乙醇脱水，待所述真菌 分生孢子器表面硬化；
(3)包埋
将无色透明EVA热熔胶棒的一端置于酒精灯上加热至其熔而不滴，室温冷却 1s～2s后，用针将步骤(2)所述真菌分生孢子器挑入经过酒精灯上加热至熔 而不滴的无色透明EVA热熔胶棒的该端内包埋，将包埋了所述真菌分生孢子器的 无色透明EVA热熔胶棒的该端置于水中冷却至该端固化；
(4)切片
在5倍的体视显微镜下，用刀片对包埋好的真菌分生孢子器进行切片，切片 厚度为100μm～150μm，切成3-5片，切片长度为4mm～6mm；
(5)染色和/或脱水处理
①染色和脱水处理：每个切片采用苏木精伊红染色法染色后，再加25μL～ 50μL无水乙醇脱水10min；或②脱水处理：在每个切片上加25μL～50μL无 水乙醇脱水10min；
(6)选片和整理
选取步骤(5)①或步骤(5)②所述切片中真菌分生孢子器完整的切片，用 刀片将其整理成面积大小为2mm×3mm小片，至于载玻片上备用；
(7)封片
在步骤(6)所述载玻片上的切片上滴加混合液25μL～50μL，再将盖玻片 盖在该载玻片的切片上，用滤纸擦净盖玻片周围的混合液，再将载玻片置于酒精 灯上烘至载玻片上包埋切片的EVA热熔胶熔化，即制成真菌分生孢子器临时玻片 标本，所述混合液有甘油和水按2:1的体积比混合而成。

说明书一种利用无色透明EVA热熔胶棒制作真菌分生孢子器临时玻片标本的方法
技术领域
本发明属于生物检测技术领域。具体涉及子囊菌门真菌分生孢子器的显微制 片。
背景技术
显微技术已成为在细胞学、组织学、胚胎学、植物解剖学、微生物学、古生 物学及孢粉学发展中的一个重要研究手段。在光学显微镜下观察生物体内部的微 细结构之前，由于生活时的生物器官组织过大或过厚不能在显微镜下观察，或者 能放在显微镜下，光线也不能透过，而且一些微细结构的折光率相同，即使光线 能透过也看不清楚。所以，必须根据材料的特性，采用不同的方法，对材料进行 处理，把材料制成透明的玻片标本。根据材料的性质和制作方法的不同，常用的 显微制片技术可以分为切片法和非切片法两大类。
切片法常用的有石蜡切片法、火棉胶切片法、徒手切片法、冰(冷)冻切片 法等，其中以石蜡切片法最为常用。
对于子囊菌门(Ascomycota)的真菌而言，观察其分生孢子器内子囊及子囊 孢子的数量、大小、排列方式等形态特征，是鉴定其分类地位的主要方法。真菌 界子囊菌门的分生孢子器大小约为100μm～200μm，小而易碎，采用徒手切片法 难以制片，通常采用石蜡切片法进行制片，其操作流程如下：
(1)取材：从PDA培养基平板上取分生孢子器，分别放入烧杯中备用；
(2)固定：将FAA固定液倒入有材料的烧杯中，固定24h；
(3)冲洗：用70％乙醇换洗3次，每次0.5h～2h；
(4)脱水：用80％、90％乙醇脱水各10min，无水乙醇(中间换一次)10min；
(5)透明：无水乙醇及二甲苯(1:1，体积比)混合液中10min，二甲苯(中 间换一次)7min～8min；
(6)透(浸)蜡：预备有石蜡与二甲苯(1:1，体积比)制成的石蜡盒3个， 将透明后的材料分别放入石蜡盒Ⅰ、石蜡盒Ⅱ各1h,放入石蜡盒Ⅲ12h～24h。 透蜡在恒温箱内进行，并保持箱内温度在55℃～60℃左右；
(7)包埋：将完全渗透好的石蜡材料置于装有纯石蜡的纸盒中，待完全凝固 后取出备用；
(8)切片：使用切片机将已固定好的石蜡块进行切片，切片厚度一般为4μm～
10μm，蜡带长度10mm～20mm；
(9)贴片：将切好的蜡带放入45℃蒸馏水中使其舒展后，贴于涂抹有蛋白甘 油的载玻片上，置于47℃的烘片机上烘干固定；
(10)染色：根据实际需要，可用HE染色法，即苏木精(Hematoxylin)和 伊红(曙红，Eosin)染色法进行染色。经95％及无水乙醇梯度脱水，二甲苯透明 后，迅速擦去材料周围多余液体后封片；也可不经染色直接封片；
(11)封片：滴加适量(1滴～2滴)中性树胶，再将洁净盖玻片倾斜放下， 以免出现气泡，封片后即制成永久性玻片标本，在光镜下可长期反复观察。
应用传统的石蜡切片法制作真菌细胞器玻片标本具有切片薄、制片效果好、 能制作连续切片、封片后能长期保存、可反复观察的优点；但其耗时长(耗时约2 d～3d)、步骤复杂、且需要切片机(国产价格约6万元/台、进口价格约30万元/台) 等复杂、贵重的专用设备。
市售的无色透明EVA热熔胶棒的规格通用的是直径在11.2mm±0.3mm和11.2 mm±0.7mm，长度在200mm到300mm,多应用于塑料、金属、木材、纸类、皮革、 陶瓷等粘合。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有徒手切片法无法处理小而软的真菌分生 孢子器、传统石蜡切片法用时长、且工序复杂、效率较低、所需专用设备昂贵、 制片成本高的缺陷。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是一种利用无色透明EVA热熔胶棒 制作真菌分生孢子器临时玻片标本的方法，包括步骤以下：
(1)取材
在5倍的体视显微镜下，从PDA培养基平板上挑取真菌分生孢子器，放到载 玻片上备用；
(2)固定和脱水
在所述真菌分生孢子器上滴加25μL～200μL无水乙醇脱水，待真菌分生孢 子器表面发硬；
(3)包埋
将无色透明EVA热熔胶棒的一端置于酒精灯上加热其熔而不滴，室温冷却1 s～2s后，用针将步骤(2)所述真菌分生孢子器挑入经过酒精灯上加热至熔而不 滴的无色透明EVA热熔胶棒的该端内包埋，将包埋了所述真菌分生孢子器的无色 透明EVA热熔胶棒的该端置于水中冷却至该端固化；
(4)切片
在5倍的体视显微镜下，用刀片对包埋好的真菌分生孢子器进行切片，切片 厚度为100μm～150μm，切成3-5片，切片长度为4mm～6mm；
(5)染色和/或脱水处理
①染色和脱水处理：每个切片采用苏木精—伊红染色法染色(即HE染色法染 色)后，再加25μL～50μL无水乙醇脱水10min；或②脱水处理：在每个切片上 加25μL～50μL无水乙醇脱水10min；
(6)选片和整理
选取步骤(5)①或步骤(5)②所述切片中真菌分生孢子器完整的切片，用 刀片将其整理成面积大小为2mm×3mm小片，至于载玻片上备用；
(7)封片
在步骤(6)所述载玻片上的切片上滴加混合液25μL～50μL，再将盖玻片盖 在该载玻片的切片上，用滤纸擦净盖玻片周围的混合液，再将载玻片置于酒精灯 上烘至载玻片上包埋切片的EVA热熔胶熔化，即制成真菌分生孢子器临时玻片标 本，所述混合液有甘油和水按2:1的体积比混合而成。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1、本发明方法步骤节省、节省时间、效率高
相对石蜡切片法而言，本发明提出了新的技术方案，本发明步骤较少，使用 试剂简单(主要为无水乙醇)，固定和脱水过程均采用无水乙醇，省去了FAA固定 液固定及透明等的程序，制作一个玻片标本耗时25min～35min，较石蜡切片法 耗时2d～3d而言效率大为提高。
2、无需专用贵重设备、成本大为降低
较石蜡切片法而言，本发明所需设备体视显微镜，为实验室常用设备，且造 价较低(普通的价格约4000元/台)；无色透明EVA热熔胶棒及刀片在市面上均有 销售且价格低廉(1条20cm长无色透明EVA热熔胶棒售价约1.5元，可制作玻片 标本约500个，一个合金刀片售价约1.5元，可制作玻片标本约50个)。
3、制片效果较好
本发明方法采用了全新的包埋物，完全能满足真菌分生孢子器形态学鉴定的 需要(见图3)。
附图说明
图1是本发明操作流程中无色透明EVA热熔胶棒一端熔化示意图。
图2是本发明操作流程中包埋示意图。
图3是本发明方法制成的真菌分生孢子器临时玻片标本效果图。
具体实施方式
以下实施例无特殊说明的为常规操作方法。
实施例1本发明方法，其步骤以下：
(1)取材
在5倍的体视显微镜下，从PDA培养基平板上取真菌分生孢子器，放到载玻 片上备用。
所述PDA培养基即常用的马铃薯葡萄糖琼脂培养基的简称，即Potato  Dextrose Agar(Medium)，PDA，所述PDA培养基配方是：马铃薯200g；葡萄糖 20g，20g琼脂，自来水1000mL。其制备方法是将马铃薯先洗净去皮,称取200g后 切成小块，加水煮烂(煮沸20～30分钟)，用纱布过滤后，在滤液中加入10g琼脂， 继续加热搅拌混匀，待琼脂溶解完后，加入葡萄糖，搅拌均匀，稍冷却后再补足 水分至1000毫升，分装试管或者锥形瓶，加塞、包扎，(121℃)灭菌20分钟左 右后取出试管摆斜面或者摇匀，冷却后贮存备用。
(2)固定和脱水
在所述真菌分生孢子器上先滴加25μL～50μL无水乙醇脱水，待真菌分生 孢子器表面发硬即可用于以下步骤；如果滴加无水乙醇后脱水尚不充分，可再滴 加无水乙醇25μL～50μL进行处理。通常滴加1～2次，处理10min～20min即 可。
(3)包埋
将无色透明EVA热熔胶棒的一端置于酒精灯上加热至所述无色透明EVA热熔 胶棒的该端熔而不滴，室温冷却1s～2s后，将步骤(2)所述真菌分生孢子器 用针迅速挑入经过酒精灯上加热至熔而不滴的无色透明EVA热熔胶棒的该端的 0.4mm～0.6mm内包埋(见图1-图2)，将包埋了真菌分生孢子器的无色透明EVA 热熔胶棒的该端置于水中迅速冷却1s～2s至所述无色透明EVA热熔胶棒的该端 固化。
(4)切片
在5倍的体视显微镜下，用刀片对包埋了的真菌分生孢子器进行手工切片， 切片厚度为100μm～150μm，切成3片(切成的片的数量根据真菌分生孢子器的 大小确定)，切片长度为4mm～6mm。
(5)脱水处理
本实施例采用不染色直接在每个切片上加25μL或50μL无水乙醇脱水10min。
(6)选片和整理
选取所述切片中真菌分生孢子器完整的切片用刀片将其整理成面积大小为2 mm×3mm小片，至于载玻片上备用。
(7)封片
在步骤(6)所述载玻片上的切片上滴加混合液25μL～50μL作为浮载剂， 再将盖玻片盖该载玻片的切片上，用滤纸擦净盖玻片周围的混合液，再将载玻片 置于酒精灯上烘至载玻片上包埋切片的EVA热熔胶熔化(约0.5s)，即制成真菌 分生孢子器临时玻片标本(见图3)，所述混合液有甘油和水按2:1的体积比混合 而成。
为了避免载玻片上出现气泡影响观察，操作时可将载玻片倾斜，再将盖玻片 倾斜盖在载玻片的切片上，并用手指轻压盖玻片，将多余的混合液轻微挤出，用 滤纸擦净盖玻片周围的混合液。
图3是实施例1采用本方法不染色直接用无水乙醇脱水制作的毛壳菌[子囊菌 门(Ascomycota)子囊菌纲(Ascomycetes)粪壳目(Sordariales)毛壳菌科 (Chaetomiaceae)毛壳菌属(Chaetomium)球毛壳菌(种)(Chaetomium globasum  Kunze ex Fries)]真菌分生孢子器临时玻片标本，该临时玻片标本可以清晰看到 子囊壳(即真菌分生孢子器)的切面形态特征，刚毛状的附属丝可清晰看到，而 附属丝的形态、长度是毛壳菌的分类重要依据之一，本方法制作的标本可以对附 属丝的长度进行有效观察，除此之外还可以看到子囊壳内部子囊及子囊孢子的形 态，制片效果较好，可满足真菌界子囊菌门分生孢子器内子囊及子囊孢子形态学 鉴定的需要。
步骤(5)是采用染色和脱水处理方式，还是不染色直接只用无水乙醇脱水处 理，即是否染色根据所用的真菌分生孢子器材料决定，有些真菌分生孢子器及内 部子囊等结构需要染色才清楚，则按本发明步骤(5)①染色和脱水处理：每个切 片采用苏木精—伊红染色法染色(即HE染色法染色)后，再加25μL～50μL无 水乙醇脱水10min，所述苏木精—伊红染色法为包埋制片技术中常用的染色法。 对于有些真菌分生孢子器不需要染色即能清楚观察，即可采用本发明方法步骤(5) ②所述的脱水处理：不染色直接在切片上加25μL～50μL无水乙醇脱水10min。