一种肾上腺素的制备方法.pdf

本发明涉及一种肾上腺素的制备方法，底物在酮还原酶、辅酶和辅酶再生系统的存在下，发生还原反应生成肾上腺素，所述的辅酶再生系统包括葡萄糖和葡萄糖脱氢酶，所述的还原反应在pH为5~7的缓冲溶液中进行，反应温度为0℃~15℃。本发明通过采用邻位双羟基保护的底物，利用酮还原酶一锅法制备肾上腺素，实现了高效不对称酶还原，然后调节pH水解脱去保护基，与现有化学拆分法或化学金属不对称合成法相比，收率和光学纯度更高，成本更低。

权利要求书
1.   一种肾上腺素的制备方法，其特征在于：底物在酮还原酶、辅酶和辅酶再生系统的存在下，发生还原反应生成肾上腺素，所述的辅酶再生系统包括葡萄糖和葡萄糖脱氢酶，所述的还原反应在pH为5~7的缓冲溶液中进行，反应温度为0℃~15℃，
所述的底物为                                                和对甲苯磺酸的盐。

2.   根据权利要求1所述的肾上腺素的制备方法，其特征在于：所述的辅酶为NADP。

3.   根据权利要求1所述的肾上腺素的制备方法，其特征在于：所述的酮还原酶为购自苏州汉酶生物技术有限公司的牌号为EW077的酮还原酶。

4.   根据权利要求1所述的肾上腺素的制备方法，其特征在于：在起始反应体系中，所述的底物的浓度为0.15~0.3g/mL，所述的酮还原酶、所述的辅酶、所述的葡萄糖、所述的葡萄糖脱氢酶、所述的底物的质量比为0.18~0.23:0.003~0.005:0.6~0.7:0.01~0.03:1。

5.   根据权利要求1所述的肾上腺素的制备方法，其特征在于：所述的缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液。

6.   根据权利要求5所述的肾上腺素的制备方法，其特征在于：所述的缓冲溶液的摩尔浓度为0.2 mol/ L ~0.4mol/L，pH为5~6。

7.   根据权利要求1所述的肾上腺素的制备方法，其特征在于：采用0.4 mol/ L ~0.6mol/L的磷酸氢二钠溶液控制反应体系的pH。

8.   根据权利要求7所述的肾上腺素的制备方法，其特征在于：所述的反应体系的pH控制在5~6。

9.   根据权利要求1至8中任一项所述的肾上腺素的制备方法，其特征在于：将所述的底物、所述的缓冲溶液、所述的葡萄糖、所述的酮还原酶、所述的葡萄糖脱氢酶、所述的辅酶加入反应器中，并控制反应体系的pH5~6，在0℃~10℃下反应40~55h，反应结束后，经过滤结晶并脱去双乙酰基，得到所述的肾上腺素。

10.   根据权利要求9所述的肾上腺素的制备方法，其特征在于：反应结束后，调节反应体系的pH至2.5~3.5，过滤除去蛋白，然后浓缩反应液至起始反应体系时的体积，再调节pH至8~9，脱去所述的双乙酰基，然后降温至-8℃~-3℃，析出所述的肾上腺素。

说明书一种肾上腺素的制备方法
技术领域
本发明属于生物制药和生物化工技术领域，具体涉及一种肾上腺素的制备方法。
背景技术
肾上腺素(adrenaline或epinephrine) ，主要用于治疗心脏骤停、支气管哮喘、过敏性休克，也可治疗荨麻疹、枯草热及鼻粘膜或齿龈出血。其结构如为：。
肾上腺素含有手性羟基中心，其制备方法主要有不对称合成法和拆分法，不对称合成利用手性金属催化剂进行加氢还原获得手性羟基中心，如图1，目前的方法需要利用昂贵的过渡态金属催化剂和手性配体，并使用大量有机试剂，成本高，同时环境友好性不高（如姚金水等，高等学校化学学报，2002，23（1），68-70），尚未见产业化报道。拆分法应用较多，通常利用酒石酸进行拆分，如WO 2009/004593等，但存在理论收率低于50%的问题，原料成本高（如图2所示）。
将含有羰基的底物前体直接还原成手性醇无疑是较为理想的方法，酮还原酶催化此类反应具有环保高效的特点，但是目前尚无能够高效催化此反应的生物催化剂被发现，原因可能为底物苯环上的邻位双羟基的结构与酶的催化位点附近结构存在较强的排斥。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种收率和光学纯度高、成本低的肾上腺素的制备方法。
为解决以上技术问题，本发明采取如下技术方案：
一种肾上腺素的制备方法，底物在酮还原酶、辅酶和辅酶再生系统的存在下，发生还原反应生成肾上腺素，所述的辅酶再生系统包括葡萄糖和葡萄糖脱氢酶，所述的还原反应在pH为5~7的缓冲溶液中进行，反应温度为0℃~15℃，
所述的底物为和对甲苯磺酸的盐。
具体地，本发明中底物的获得方法为：将肾上腺素酮、乙酸和对甲苯磺酸，在40℃~50℃下反应20 min ~40min，加入乙酸酐，在氮气保护下反应，然后加入异丙醇抽滤取滤饼，滤饼用二氯甲烷洗涤得到所述的底物，肾上腺素酮的结构式为：。
底物的获得方法也可以采用其他常规方法获得。
具体地，所述的辅酶为NADP。
具体地，所述的酮还原酶为购自苏州汉酶生物技术有限公司的牌号为EW077的酮还原酶。
具体地，在起始反应体系中，所述的底物的浓度为0.15~0.3g/mL，所述的酮还原酶、所述的辅酶、所述的葡萄糖、所述的葡萄糖脱氢酶、所述的底物的质量比为0.18~0.23:0.003~0.005:0.6~0.7:0.01~0.03:1。
更具体地，在起始反应体系中，所述的底物的浓度为0.2~0.25g/mL，所述的酮还原酶、所述的辅酶、所述的葡萄糖、所述的葡萄糖脱氢酶、所述的底物的质量比为0.19~0.21:0.004~0.0045:0.65~0.69:0.018~0.022:1。
具体地，所述的缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液。
更具体地，所述的缓冲溶液的摩尔浓度为0.2 mol/ L ~0.4mol/L，pH为5~6。
再具体地，所述的缓冲溶液的摩尔浓度为0.28 mol/ L ~0.33mol/L，pH为5.4~5.6。
具体地，采用0.4 mol/ L ~0.6mol/L的磷酸氢二钠溶液控制反应体系的pH。
更具体地，所述的反应体系的pH控制在5~6。
再具体地，采用0.48 mol/ L ~0.52mol/L的磷酸氢二钠溶液控制反应体系的pH为5.4~5.6。
具体地，将所述的底物、所述的缓冲溶液、所述的葡萄糖、所述的酮还原酶、所述的葡萄糖脱氢酶、所述的辅酶加入反应器中，并控制反应体系的pH5~6，在0℃~10℃下反应40~55h，反应结束后，经过滤结晶并脱去双乙酰基，得到所述的肾上腺素。
更具体地，反应温度为3℃~5℃，反应时间为45~50 h。
更具体地，反应结束后，调节反应体系的pH至2.5~3.5，过滤除去蛋白，然后浓缩反应液至起始反应体系时的体积，再调节pH至8~9，脱去所述的双乙酰基，然后降温至-8℃~-3℃，析出所述的肾上腺素。
本发明中的反应物均可市购获得。
由于以上技术方案的实施，本发明与现有技术相比具有如下优点：
本发明通过采用邻位双羟基保护的底物，利用酮还原酶一锅法制备肾上腺素，实现了高效不对称酶还原，然后调节pH水解脱去保护基，与现有化学拆分法或化学金属不对称合成法相比，收率和光学纯度更高，成本更低。
另外，化学金属不对称合成法需要的贵金属钌的采购价格为数万元每公斤，且易残留于反应物中，排放于环境中有毒，难降解，手性配体无法购得，只能通过合成的方法获得；本方法所用的催化剂为蛋白质，易分离，排放于环境中易降解；化学金属不对称合成法中底物溶解于有毒溶剂苯中，本方法底物溶解于水中。
附图说明
附图1为不对称合成法的合成路线图；
附图2为拆分法的合成路线图；
附图3为本发明的合成路线图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明并不限于以下实施例。实施例中采用的实施条件可以根据具体使用的不同要求做进一步调整，未注明的实施条件为常规实验中的条件。
实施例1
底物的获得方法：肾上腺素酮 10 g(1 eq)、乙酸20 ml与对甲苯磺酸 14.3 g(1.5 eq)加至100 mL反应瓶中，在45度下搅拌30分钟；加入乙酸酐 27.78 mL(5.5 eq)，氮气保护下常温过夜，旋蒸后冷却至室温，加入异丙醇20 mL抽滤取滤饼；二氯甲烷洗涤滤饼得到产物18.6 g固体粉末，收率77 %, HPLC纯度99.9%。
实施例2（产物的制备）：合成路线见图3
反应器中加入2.4 g底物，0.3 M、 pH 5.5磷酸盐缓冲溶液10 mL，葡萄糖1.6 g，酮还原酶EW077 0.48 g，葡萄糖脱氢酶GDH01 0.05 g，NADP 0.01 g，0.5 M磷酸氢二钠溶液控制pH 5.5，5摄氏度下搅拌反应48小时，HPLC检测底物转化率大于99%，调节pH至3.0过滤除去蛋白，浓缩反应液至10 mL后调节pH至8.5，使产物脱去双乙酰基，然后缓慢降温至-5摄氏度析出晶体0.9 g，收率90%，HPLC纯度99.9%，光学纯度99.5%，肾上腺素含量99.0%。
对比例1
反应器中加入2.4 g底物，0.3 M、 pH 5.5磷酸盐缓冲溶液10 mL，葡萄糖1.6 g，酮还原酶EW077 0.48 g，葡萄糖脱氢酶GDH01 0.05 g，NADP 0.01 g，0.5 M磷酸氢二钠溶液控制pH 5.5，10摄氏度下搅拌反应24小时，HPLC检测底物转化率76%。
对比例2
反应器中加入2.4 g底物，0.3 M、 pH 5.5磷酸盐缓冲溶液10 mL，葡萄糖1.6 g，酮还原酶EW077 0.48 g，葡萄糖脱氢酶GDH01 0.05 g，NADP 0.01 g，0.5 M磷酸氢二钠溶液控制pH 5.5，15摄氏度下搅拌反应24小时，HPLC检测底物转化率71%。
对比例3
反应器中加入2.4 g底物，0.3 M、 pH 5.5磷酸盐缓冲溶液10 mL，葡萄糖1.6 g，酮还原酶EW077 0.48 g，葡萄糖脱氢酶GDH01 0.05 g，NADP 0.01 g，0.5 M磷酸氢二钠溶液控制pH 7.0，5摄氏度下搅拌反应24小时，HPLC检测底物转化率54%。
以上对本发明做了详尽的描述，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明的精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。