猪流行性腹泻病毒M蛋白亲和肽及其筛选方法.pdf

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摘要
申请专利号:

CN201510190932.1

申请日:

2015.04.21

公开号:

CN104774249A

公开日:

2015.07.15

当前法律状态:

实审

有效性:

审中

法律详情:

实质审查的生效IPC(主分类):C07K 7/08申请日:20150421|||公开

IPC分类号:

C07K7/08; C07K1/14

主分类号:

C07K7/08

申请人:

东北农业大学

发明人:

李广兴; 高玉; 任玉东; 黄小丹; 葛旭影

地址:

150000黑龙江省哈尔滨市香坊区公滨路木材街59号

优先权:

专利代理机构:

哈尔滨龙科专利代理有限公司23206

代理人:

高媛

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内容摘要

本发明公开了一种猪流行性腹泻病毒M蛋白亲和肽及其筛选方法,所述M蛋白亲和肽的氨基酸序列为AGWYCTEVLCVQ或AYCTRHVCYLDN。本发明利用噬菌体展示技术获得能特异性结合PEDV及其重组蛋白M的短肽,并对该短肽人工合成,分析其抗病毒的生物学功能,结果表明本发明首次筛选合成的2种PEDV M蛋白的亲和多肽均能够有效的抑制PEDV的复制,这为今后对PEDV小分子诊断和治疗制剂的开发提供了一定的理论基础和试验依据。

权利要求书

1.  猪流行性腹泻病毒M蛋白亲和肽,其特征在于所述M蛋白 亲和肽的氨基酸序列为AGWYCTEVLCVQ或AYCTRHVCYLDN。

2.
  一种权利要求1所述猪流行性腹泻病毒M蛋白亲和肽的筛选 方法,其特征在于所述方法步骤如下:
(1)猪流行性腹泻病毒M蛋白的原核表达,得到纯化的重组M 蛋白;
(2)M蛋白亲和肽的筛选:
将浓度为15μg/100μL的M蛋白包被在酶标板中,4℃过夜,封 闭,用0.1%TBST洗6次,每次10s;洗过后加入稀释好的噬菌体 文库100μL,震摇10min停歇10min,共40min,用0.1%TBST洗 10次,加洗脱液100μL,震摇30min,将上清加到EP管中,加入 15μL中和液,完成一次筛选;按上述步骤进行以后三轮筛选,并逐 步增加选择压力,即以后每轮M蛋白的包被浓度依次减半,TBST洗 涤次数每轮增加5次;
(3)随机挑取第4轮筛选后的10个噬斑,扩增后提取单链DNA, 进行PCR,引物序列为:上游:5’-TCACCTCGAAAGCAAGCTGA-3’; 下游:M13:5’-CCCTCATAGTTAGCG TAACG-3’,序列测定并推导其 氨基酸序列为AGWYCTEVLCVQ或AYCTRHVCYLDN。

3.
  根据权利要求2所述的猪流行性腹泻病毒M蛋白亲和肽的筛 选方法,其特征在于每次筛选之后,都进行噬菌体滴度测定和噬菌体 扩增。

4.
  根据权利要求3所述的猪流行性腹泻病毒M蛋白亲和肽的筛 选方法,其特征在于所述噬菌体的扩增方法如下:挑取每次筛选后的 阳性噬菌体,加入ER2738培养液,37℃震摇5h;转移至离心管,4 ℃,9000r/min,15min,取上清,加1/6体积的PEG-NaCl,4℃沉 降过夜,离心弃上清,用1mL TBS悬浮沉淀,离心取上清;加1/6 体积的PEG-NaCl,沉降1h,离心后用100μL TBS悬沉淀,离心1min, 取上清,进行滴度测定。

5.
  根据权利要求3所述的猪流行性腹泻病毒M蛋白亲和肽的筛 选方法,其特征在于所述噬菌体滴度测定方法如下:取底层琼脂板, 取4-5个EP管,每管100μL ER2738菌液,向第一管中加入10μL 噬菌体洗脱物,倍比稀释,4-5个稀释度,将熔化后的顶层琼脂倒入 离心管中,加入稀释的混合物,弹匀后倒在底层琼脂上,温箱避光倒 置培养过夜。

说明书

猪流行性腹泻病毒M蛋白亲和肽及其筛选方法
技术领域
本发明涉及一种猪流行性腹泻病毒M蛋白的亲和多肽及其筛选方法。
背景技术
猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的一种猪的接触性肠道传染病。常以腹泻、呕吐、脱水和对哺乳仔猪的高致死率为主要特征。PEDV的结构蛋白与其他冠状病毒相似,该病毒有糖基化纤突蛋白(Spike,S)、糖基化囊膜蛋白(Membrane,M)和核衣壳蛋白(Nucleocapsid,N)三种结构蛋白。其中M蛋白是一种糖蛋白,是由226个氨基酸组成的,分子质量为20-32ku,是PEDV刺激机体产生免疫保护的重要结构蛋白之一。其氨基酸序列非常保守,在病毒装配期间将核衣壳连接到囊膜上,决定病毒粒子的装配位点、病毒成熟及出芽位点。另外,抗M蛋白抗体在补体存在的情况下可中和病毒的感染性。
噬菌体展示技术(Phage display technique)是近年发展起来的一项新的分子生物学技术,是将外源蛋白或多肽与噬菌体的外壳蛋白在噬菌体的表面融合表达,再利用特异性的抗体对改造的噬菌体进行淘选,通过几轮淘选将得到含有目的蛋白的重组噬菌体,然后提取噬菌体的基因组并测序,从而获得编码目的基因序列,进而可以知道目的蛋白或多肽的氨基酸序列组成。噬菌体展示技术作为一种新兴的研究蛋白质相互作用的方法,被广泛应用到了生物学的各个领域中。
近年来PED频繁爆发,目前该病尚无特效药物的应用,主要依靠疫苗接种进行防治。但由于PEDV常发生突变的原因而使疫苗接种保护失败,给世界养猪业造成严重的损失。噬菌体展示技术是一种探索蛋白质分子间相互作用的有效工具,利用随机肽库,通过数轮生物 淘选,快速获得相应靶分子的多肽配体。PEDV M蛋白具有很高的保守性,是病毒刺激机体产生免疫保护的重要结构蛋白之一,是冠状病毒外膜最主要的成分,它的一级结构对病毒的装配是非常重要的。故通过对PEDV M蛋白的噬菌体亲和多肽的筛选及其抗病毒生物学功能的鉴定,为PED开发研制新型多肽疫苗与小分子抗病毒药物的开发提供参考。
发明内容
本发明的目的是提供一种猪流行性腹泻病毒M蛋白亲和肽及其筛选方法,利用噬菌体展示技术获得能特异性结合PEDV及其重组蛋白M的短肽,并对该短肽人工合成,分析其抗病毒的生物学功能,结果表明本发明首次筛选合成的2种PEDV M蛋白的亲和多肽均能够有效的抑制PEDV的复制,这为今后对PEDV小分子诊断和治疗制剂的开发提供了一定的理论基础和试验依据。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的:
一种猪流行性腹泻病毒M蛋白亲和肽,其序列为AGWYCTEVLCVQ或AYCTRHVCYLDN。
上述猪流行性腹泻病毒M蛋白亲和肽的筛选方法,包括如下步骤:
1、猪流行性腹泻病毒M蛋白的原核表达,得到纯化的重组M蛋白。
2、M蛋白亲和肽的筛选
M蛋白的包被:将浓度为15μg/100μL的M蛋白包被在酶标板中,4℃过夜,封闭,用0.1%TBST洗6次,每次10s。洗过后加入稀释好的噬菌体文库100μL,震摇10min停歇10min,共40min,用0.1%TBST洗10次,加洗脱液100μL,震摇30min,将上清加到EP管中,加入15μL中和液,分别进行噬菌体滴度测定和扩增,并进行后续筛选。按上述步骤进行以后三轮筛选,并逐步增加选择压力,即以后每轮M蛋白的包被浓度依次减半,TBST洗涤次数每轮增加5次。
噬菌体的扩增:挑取每次筛选后的阳性噬菌体,加入ER2738培养液,37℃震摇5h。转移至离心管,4℃,9 000r/min,15min,取上清,加1/6体积的PEG-NaCl,4℃沉降过夜,离心弃上清,用1mL TBS悬浮沉淀,离心取上清。加1/6体积的PEG-NaCl,沉降1h,离心后用100μL TBS悬沉淀,离心1min,取上清,进行滴度测定。
噬菌体滴度测定:取底层琼脂板,取4-5个EP管,每管100μL ER2738菌液,向第一管中加入10μL噬菌体洗脱物,倍比稀释,4-5个稀释度,将熔化后的顶层琼脂倒入离心管中,加入稀释的混合物,弹匀后倒在底层琼脂上,温箱避光倒置培养过夜。
3、M蛋白亲和噬菌体测序和亲和肽的合成:
随机挑取第4轮筛选后的10个噬斑,扩增后提取单链DNA,参照《噬菌体表面展示肽库快速筛选肽配体使用手册》提供的特异性噬菌体引物序列,由北京六合华大基因科技有限公司合成一对引物:
+130M13:5’-TCACCTCGAAAGCAAGCTGA-3’;
-28M13:5’-CCCTCATAGTTAGCG TAACG-3’。
经基因测序公司测序,扩增片段大小为250bp。
在随机十二肽的gIII融合蛋白N末端有一段信号肽前导序列,在表达融合蛋白后前导序列可以被切除,所以随机肽就位于成熟蛋白的N末端。设计一对特异性引物直接扩增出包含淘选肽配体在内的核苷酸序列,从而推导出所淘选肽配体的36个核苷酸序列。分析10个单克隆噬菌斑的序列并翻译成氨基酸,送到上海强耀生物公司合成纯度为95%的短肽,命名为M-2、M-9。
4、M蛋白亲和肽的功能鉴定
间接免疫荧光检测多肽的抗病毒作用:将100μL 100TCID50的病毒分别与系列倍比稀释的M-2、M-9(400、200、100、50、25、12.5μg/mL)或者M-2与M-9联合多肽等体积混合后37℃5%CO2培养1h,再将混合物加入到96孔细胞培养板中铺满单层的VeroE6细胞中1h,弃去上清,补液,至出现明显的CPE后停止培养。进行间接免疫荧光检测,抗体为制备的抗PEDV全病毒阳性血清,二抗为 FITC标记山羊抗兔IgG。
实时荧光定量PCR检测多肽的抗病毒作用:通过实时定量PCR扩增PEDV的N基因来检测多肽在体外对病毒的浓度依赖性抑制作用。将100μL 100TCID50的病毒分别与系列倍比稀释的M-2、M-9(400、200、100、50、25、12.5μg/mL)或者M-2与M-9联合多肽等体积混合后37℃5%CO2培养1h,再将混合物加入到6孔细胞培养板中铺满单层的VeroE6细胞,36h后收集细胞板中的病毒液。根据RNA提取试剂盒的操作说明,提取病毒总RNA,反转录。同样用TGEV-M作为无关多肽对照。随后用ABI PRISM 7500实时定量PCR仪器进行实时定量PCR。
本发明相对于现有研究,具有如下的优点及有益效果:
(1)由于表达M全基因存在困难,即使表达,表达量也会受到一定限制,导致实验当中M蛋白的表达十分困难。本发明通过pET-32a原核表达载体,建立高效表达M全长基因的原核表达体系,获取大量M蛋白,为PEDV相关研究提供重要的实验材料。
(2)噬菌体展示技术是一种探索蛋白质分子间相互作用的有效工具,利用随机肽库,通过数轮淘选,快速获得相应靶分子的多肽配体。本发明以表达纯化复性后的M蛋白作为靶蛋白,利用噬菌体展示随机十二肽库进行筛选,4轮淘选后,挑选10个与PEDV M蛋白特异性结合力高的噬菌体单克隆,序列测定并推导其氨基酸序列为AGWYCTEVLCVQ、AYCTRHVCYLDN,命名为M-2、M-9多肽。合成多肽的体外抗病毒试验中,间接免疫荧光实验和实时荧光定量PCR实验证明M-2、M-9多肽单独与PEDV作用或者M-2与M-9多肽联合与PEDV作用都能够有效的抑制病毒的复制,M-2与M-9多肽联合抗病毒作用更好,且都呈剂量依赖性。为进一步研究PEDV M蛋白功能性配体以及为进一步研究PEDV新型多肽疫苗与小分子诊断和抗病毒药物的开发提供了参考。
附图说明
图1为重组质粒pET32a-M的PCR鉴定图,其中,M:DNA marker; 1:pET-32a-M重组质粒的PCR产物;2:ET-32a-M重组质粒的EcoR I/Xho I酶切产物;
图2为PEDV M蛋白的表达及纯化,其中,A:M:低分子质量蛋白质标准;1:pET32a-M经IPTG诱导超声后的上清;2:pET32a-M经IPTG诱导超声后的沉淀;3-9:分别代表质粒诱导0-6h;B:M:低分子质量蛋白质标准;1:纯化的M重组蛋白;
图3为PEDV M重组蛋白的Western blot分析,其中,M:低分子质量蛋白质标准;1:空载体;2:未纯化PEDV M蛋白;3:纯化PEDV M蛋白;
图4为亲和噬菌体与PEDV亲和性ELISA检测;
图5为亲和噬菌体与PEDV M蛋白亲和性ELISA检测;
图6为亲和多肽M-2、M-9单独与联合抑制PEDV感染的间接免疫荧光检测,其中,A:阳性对照组;B:M-2多肽处理组;C:M-9多肽处理组;D:M-2与M-9联合多肽处理组;E:VeroE6细胞对照;
图7为亲和多肽M-2、M-9单独与联合抑制PEDV感染的实时荧光定量PCR检测。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的技术方案作进一步的说明,但并不局限于此,凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的精神和范围,均应涵盖在本发明的保护范围中。
实施例1
重组质粒pET32a-M的原核表达: 
根据GenBank已发表的PEDV M基因序列,设计引物P1和P2:
P1:5’-CGCGAATTCGCCATGTCTAACGGTTCTAT-3’(下划线表示引入的酶切位点为EcoR I)
P2:5’-CGCCTCGAGTTAGACTAAATGAAGCAC-3’(下划线表示引入的酶切位点为Xho I)
选取标准病毒株CV777,提取基因组DNA,利用PCR扩增PEDV M基因片段,扩增条件:94℃预变性10min、94℃变性30s、50.2℃退火30s、72℃延伸1min和94℃预变性10min、94℃变性30s、49.6℃退火30s、72℃延伸1min,共进行30个循环,72℃终延伸10min。PCR产物用质量分数为1%的琼脂糖凝胶电泳进行分析,在681bp附近存在单一的目标条带,结果如图1所示,表明实验获得了与预期相符的特异DNA片段即M基因片段。与载体pET32a分别用EcoR I和Xho I双酶切处理,连接后转入表达感受态细胞BL21中,将菌液涂布于固体LB培养基(NaCl 1g,蛋白胨1g,酵母提取物0.5g,琼脂粉1.5g,用100mL去离子水溶解后高压灭菌),挑取单菌落接种于含有氨苄青霉素(Amp+)的液体LB培养基中,37℃培养3h至OD为0.4-0.6时,加入IPTG(异丙基硫代半乳糖苷,终浓度1mmol/L)诱导表达6h,菌体超声破碎后,经切胶纯化制备的M重组蛋白;利用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹法(Western-blot)验证纯化后的M重组蛋白的纯度和免疫原性(见图1),用于后续噬菌体筛选实验。
实施例2
PEDV M多克隆抗体的制备:
选取2-3kg新西兰大白兔,首免为纯化的重组M蛋白与等体积弗式完全佐剂完全乳化后背部皮下多点注射,剂量为2mg/只,以后为弗式不完全佐剂与等体积纯化的重组M蛋白完全乳化,间隔1周免疫一次,3免后1周用不加佐剂的纯化的重组M蛋白加强免疫,7d后兔心脏采血获得血清,得到抗PEDV M蛋白多克隆抗体,通过间接ELISA法检测抗体效价,蛋白质印迹法用于多抗特性鉴定。SDS-PAGE分析结果表明,重组质粒菌液诱导后在41ku处出现特异性条带,重组M蛋白以包涵体形式表达,切胶纯化后可获得较好结果(见图2A和2B)。以抗PEDV全病毒阳性血清为一抗,HRP标记的山羊抗兔IgG为二抗,进行Western-blot分析,结果在24ku处可见特异性条带(见图3)
实施例3
PEDV M亲和肽的筛选及功能测定:
(1)M蛋白的包被 
将浓度为15μg/100μL的M蛋白包被在酶标板中,4℃封闭过夜,用0.1%TBST洗6次。洗过后加入稀释好的噬菌体文库100μL,震摇10min,间停10min,共40min,用0.1%TBST洗10次,加洗脱液100μL,震摇30min,将上清加到EP管中,加入15μL中和液,分别进行噬菌体滴度测定和扩增,并进行后续筛选。按上述步骤进行以后三轮筛选,并逐步增加选择压力,即以后每轮M蛋白的包被浓度依次减半,TBST洗涤次数每轮增加5次。
(2)亲和噬菌体的扩增:挑取每次筛选后的阳性噬菌体,加入ER2738培养液,37℃震摇5h。转移至离心管,4℃,9 000r/min,15min,取上清,加1/6体积的PEG-NaCl,4℃沉降过夜,离心弃上清,用1mL TBS悬浮沉淀,离心取上清。加1/6体积的PEG-NaCl,沉降1h,离心后用100μL TBS悬沉淀,离心1min,取上清,进行滴度测定。
(3)亲和噬菌体滴度测定
取底层琼脂板,取4-5个EP管,每管100μL ER2738菌液,向第一管中加入10μL噬菌体洗脱物,倍比稀释,4-5个稀释度,将熔化后的顶层琼脂倒入离心管中,加入稀释的混合物,弹匀后倒在底层琼脂上。温箱中倒置培养。利用噬菌体随机十二肽库,对M蛋白通过4轮“结合-洗脱-扩增”过程,文库滴度先下降后升高并趋于稳定过程,当文库滴度趋于稳定时,说明噬菌体结合能力已经到饱和状态,与M蛋白特异性结合的噬菌体得到了富集,筛选结果见表1。
(4)间接ELISA检测阳性克隆特异性
以重组M蛋白、PEDV病毒作为包被抗原进行间接ELISA,所筛选的噬菌体(1-10)扩增产物37℃孵育1h。M13抗体1∶1000倍稀释,同时37℃作用1h。检测噬菌体单克隆与M蛋白和PEDV的结合效果,包被液、封阻液、噬菌体稀释液分别为对照1、对照2、对照3。第四轮洗脱物的滴度测定时,取噬菌斑总数小于100的平板, 无菌随机挑取10个单克隆菌落(编号1-10),扩增处理后,利用抗噬菌体M13抗体,通过间接ELISA对其与M蛋白及PEDV的亲和力进行检测。结果显示经四轮淘选的10个噬菌体单克隆均能与靶分子M蛋白及PEDV发生特异性结合(见图4和图5)
(5)噬菌体单克隆序列的测定
随机挑取第4轮筛选后的10个噬斑,扩增后提取单链DNA,进行PCR,引物序列为:上游:5’-TCACCTCGAAAGCAAGCTGA-3’;下游:M13:5’-CCCTCATAGTTAGCG TAACG-3’。将PCR产物送博士公司测序,扩增片段大小为250bp。根据测序结果,推导氨基酸序列如表2。其中1,3,7,9号噬菌体序列一致,为AGWYCTEVLCVQ;2,4,5,6,8,10号噬菌体一致,AYCTRHVCYLDN。上海强耀公司合成多肽,纯度为95%。
实施例4
多肽的抗病毒作用:
(1)间接免疫荧光检测多肽的抗病毒作用
将100μL 100TCID50的病毒分别与系列倍比稀释的M-2、M-9(400、200、100、50、25、12.5μg/mL)或者M-2与M-9联合多肽等体积混合后37℃培养1h,再将混合物加入到96孔细胞培养板中铺满单层的VeroE6细胞中1h,弃去上清,补液,至出现明显的CPE后停止培养。进行间接免疫荧光检测,一抗为抗PEDV全病毒阳性血清,二抗为FITC标记山羊抗兔IgG。实验证明M-2、M-9多肽及M-2与M-9多肽联合与PEDV作用都能够有效抑制病毒的复制。单独作用时,M-2病毒的抑制作用强于M-9;而M-2、M-9多肽联合作用的抗病毒效果比多肽单独作用的效果更好(见图6)
(2)实时荧光定量PCR检测多肽的抗病毒作用
通过实时定量PCR扩增PEDV的N基因来检测多肽在体外对病毒的浓度依赖性抑制作用。将100μL 100TCID50的病毒分别与系列倍比稀释的M-2、M-9(400、200、100、50、25、12.5μg/mL)或者M-2与M-9联合多肽等体积混合后37℃培养1h,再将混合物加入 到6孔细胞培养板中铺满单层的VeroE6细胞,36h后收集细胞板中的病毒液。根据RNA提取试剂盒的操作说明,提取病毒总RNA,反转录。随后用ABI PRISM 7500实时定量PCR仪器进行实时定量PCR。实验证明M-2、M-9多肽单独与PEDV作用或者M-2与M-9多肽联合与PEDV作用均能有效的抑制病毒复制,M-2与M-9多肽联合作用的抗病毒效果极显著比单独作用的效果好。同时,检测结果显示多肽呈剂量依赖性的方式抑制病毒。浓度同为400μg/mL时,M-2多肽病毒最大抑制率为48%,M-9多肽病毒最大抑制率为37%;当M-2与M-9多肽联合作用时,病毒最大抑制率为53%,随着多肽浓度的下降,抑制率下降(见图7)。
表1噬菌体淘洗产物滴度测定(pfu)

表2噬菌体结合克隆的序列测定

<110>东北农业大学
<120>猪流行性腹泻病毒M蛋白亲和肽及其筛选方法
<210>1
<211>250 bp
<212> mRNA
<213> 猪流行性腹泻病毒M蛋白亲和肽M-2的氨基酸序列
<400>SEQ ID NO. 1
AGWYCTEVLCVQ
 
<210>2
<211>250 bp
<212> mRNA
<213> 猪流行性腹泻病毒M蛋白亲和肽M-9的氨基酸序列
<400>SEQ ID NO. 2
AYCTRHVCYLDN

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本发明公开了一种猪流行性腹泻病毒M蛋白亲和肽及其筛选方法,所述M蛋白亲和肽的氨基酸序列为AGWYCTEVLCVQ或AYCTRHVCYLDN。本发明利用噬菌体展示技术获得能特异性结合PEDV及其重组蛋白M的短肽,并对该短肽人工合成,分析其抗病毒的生物学功能,结果表明本发明首次筛选合成的2种PEDV M蛋白的亲和多肽均能够有效的抑制PEDV的复制,这为今后对PEDV小分子诊断和治疗制剂的开发提供了一定。

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