一种裂解病毒的方法 【技术领域】
本发明涉及一种裂解病毒的方法，更具体地说，涉及一种用超临界流体萃取技术裂解具有脂膜或类脂膜病毒的方法。
背景技术
具有脂膜或类脂膜的病毒存在以下共性：①脂膜和类脂膜对病毒具有保护性，脂膜和类脂膜被破坏后将导致病毒丧失活性和感染性；②脂膜和类脂膜上均嵌有病毒的结构蛋白，该蛋白对维持病毒结构的稳定性以及病毒感染生物机体使机体产生中和抗体具有重要的生物学意义；③使用可以刺激机体产生中和抗体的病毒蛋白，可以制备用于预防该病毒引起感染的裂解疫苗或亚单位疫苗。
目前，具有脂膜或类脂膜病毒的裂解主要采用广泛用于医药卫生工业的裂解剂，这些裂解剂有表面活性剂、去污剂以及有机溶剂，例如吐温-80、Triton系列、脱氧胆酸钠、乙醚等。使用这些裂解剂破坏病毒的脂膜或类脂膜后，使其上的蛋白或包裹的蛋白处于溶解状态，经过纯化，用于其功能的研究和应用。以流感疫苗为例，在裂解疫苗的制备过程中，加入裂解剂将经过纯化的病毒裂解，使血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)两种抗原处于溶解状态后再纯化，然后还要经过去除裂解剂的工序，以及对去除的效果进行验证后，才能制成安全地疫苗。
这些表面活性剂、去污剂以及有机溶剂的使用给操作者带来人体危害，尤其在裂解疫苗工业化生产过程中，裂解剂的大量使用对环境造成极大污染。另外，去除残留裂解剂的工序使工艺过程变得繁杂，如果这些溶剂(和试剂)有残存，就会对后续的研究工作产生影响，尤其对于制成供人体直接使用的裂解疫苗或亚单位疫苗，即使裂解剂有微量的残存也将对使用者产生潜在的危害。
另外，由于使用裂解剂裂解病毒的过程是一个渐变的过程，裂解剂随机地破坏病毒脂膜或类脂膜的部分区域，使脂膜或类脂膜发生破裂，形成带有缺口的半裂解病毒(见图2中标号2)，只有部分血凝素从病毒表面脱落，因此裂解过程终止后，通过电镜仍然会观察到完整病毒颗粒的存在(见图2中标号1)，所以其裂解并不是完全充分和均匀的。
【发明内容】
本发明的目的是针对现有技术中大量使用具有一定毒性的化学裂解剂，造成对环境的污染和人体的危害，以及裂解效果不佳致使有效物质不能完全获取的问题，提供了应用超临界流体萃取技术裂解病毒的方法。
本方法是利用某些处于超临界状态下的流体裂解具有脂膜或类脂膜的病毒。具体的做法是将病毒置于带有通气管路的密封良好的容器中，通入处于超临界状态下的流体，保持一定时间后，再将该流体导出，完成裂解。
本发明使用的超临界流体一般是在常温常压条件下为气体的流体，在本发明中，用于裂解病毒时，使该流体的温度和压力都处于高于其临界温度和临界压力的超临界状态下。这种处于超临界状态下的流体具有液体的溶解度、气体的流动性和介于两者之间的粘性，在临界点附近，压力微小的变化就会导致体积很大的变化，所产生的能量很大，能够使病毒的脂膜或类脂膜被均一地完全破坏，血凝素从病毒表面完全脱落而使病毒完全裂解。
对于适用于本发明的超临界流体没有特别限制，只要该流体的临界温度不使病毒变性、活性物质不被破坏即可；临界压力只要是容器能够耐受的压力即可。例如，这样的流体可以是二氧化碳(CO2)、氮(N2)、一氧化二氮(N2O)、氧(O2)等。其中，临界点时温度为31.1℃，临界压力为7.32Mpa的二氧化碳和临界点时温度为-147.1℃，临界压力为3.35Mpa的氮其临界条件容易达到，且本身化学性质稳定并且容易获得，所以优选使用这两种气体。另外，由于二氧化碳的临界温度最接近一般病毒裂解的最佳温度，而且来源丰富、价格便宜、无爆炸性、无污染而特别适宜于裂解病毒。
同时，处于超临界状态下的流体对病毒表面的脂膜和类脂膜还具有萃取的作用，通过该作用能够破坏病毒表面的化学结构，造成病毒表面的某些位置产生结构缺陷，从而使膜上物质和内容物脱离病毒，有助于实现良好的裂解效果。
作为具有脂膜或类脂膜的病毒可以列举出正粘病毒科病毒(Orthomyxoviridae)、弹状病毒科病毒(Rhabdoviridaes)、布尼亚病毒科(Bunyaviridae)的汉坦病毒属(Hantavirus)、风疹病毒(rubella virus)、副粘病毒科病毒、披膜病毒科的甲病毒属、乙型脑炎病毒(又称日本脑炎病毒)、登革病毒、丙型肝炎病毒等。其中，正粘病毒科病毒例如有流行性感冒病毒甲1型、甲3型和乙型等各亚型；弹状病毒科病毒例如有狂犬病病毒属的狂犬病病毒等；布尼亚病毒科(Bunyaviridae)的汉坦病毒属例如有肾综合征出血热病毒等和它们的不同血清型；副粘病毒科病毒例如有人类呼吸道合胞病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒等。
本发明采用的超临界流体萃取技术为物理方法，完全能够替代现有技术中的化学试剂裂解病毒，并且采用本发明的方法，由于脂膜或类脂膜被均一地完全破坏，血凝素和神经氨酸酶从病毒表面完全脱落，从而提高了病毒的裂解效果。
另外，由于裂解过程中避免使用了化学试剂，所用的超临界流体在完成裂解后易于从体系中除去，并可以循环使用，因此大大减少了对环境造成的不良影响。
再有，在利用裂解后的病毒的有效成分制成疫苗时，采用本发明的方法由于超临界流体无残留，得到的疫苗纯度很高，不会对使用者产生潜在危害，因此疫苗的安全性大大提高。
【附图说明】
图1为全病毒的透视电镜照片；
图2为利用化学试剂裂解病毒颗粒后观察到的透视电镜照片；
图3为按实施例1的方法裂解甲1型流感病毒后观察到的透视电镜照片；
图4为按实施例2的方法裂解甲3型流感病毒后观察到的透视电镜照片；
图5为按实施例3的方法裂解乙型流感病毒后观察到的透视电镜照片；
图6为按实施例4的方法裂解乙型流感病毒后观察到的透视电镜照片；
图7为按实施例1～4的方法裂解的病毒和使用化学裂解剂裂解相应病毒的蛋白电泳照片。
【具体实施方式】
流行性感冒病毒属于正粘病毒科，其外壳为类脂膜，膜上有可以产生中和抗体的血凝素蛋白和对预防流行性感冒病毒具有一定意义的神经氨酸酶，在具有脂膜或类脂膜病毒中具有一定的代表性，所以选取不同亚型的流感病毒，即甲1、甲3及乙型流感病毒，采用超临界萃取技术进行裂解，进而具体说明本发明。
病毒的预处理
分别取甲1、甲3及乙型流感病毒接种于9-11日龄的清洁级(SPF)鸡胚，48小时(乙型为72小时)后冷胚，收集尿囊液，向其中加入甲醛，使甲醛的终浓度达到0.03～0.05g/100ml(W/V)，放置10天，或者向其中加入β-丙内酯，使β-丙内酯的终浓度为1∶4000-1∶2000(V/V)，放置24小时使病毒灭活，再放置7天使β-丙内酯水解，上述放置条件为2～8℃。灭活后使用超滤的方法进行浓缩，使用分子筛凝胶过滤的方法进行纯化，将纯化后的灭活病毒浓缩，浓缩后病毒的血凝效价为1∶10000到1∶100000以上，选取适量病毒浓缩液进行以下裂解试验。
以二氧化碳作流体为例，其裂解病毒的具体过程为：
1.将上述纯化浓缩的病毒装入洁净的超临界萃取仪的萃取釜内，将萃取釜密闭。
2.通入CO2，将萃取釜内CO2的温度调节为31.1～75℃、压力为7.32～110Mpa的状态，维持此状态2～30分钟或更长时间。
3.裂解完成后，关闭进气阀门，从萃取釜导出裂解的病毒，收集排出的液体，即获得裂解的流感病毒。
上述超临界萃取釜内温度调节原则是：当萃取釜内的压力在临界压力以上时，温度的提高有利于病毒表面的脂膜和类脂膜在流体中溶解度的提高，有利于均匀快速的裂解。但由于病毒对热的不稳定性，当温度超过75℃时，病毒就会被破坏，会影响其抗原性，因此萃取釜内的温度应控制在75℃以内。
当超临界流体为CO2时，适用的温度范围为31.1～75℃，适宜的压力范围为7.32～110Mpa，温度范围较佳为32～38℃，压力范围较佳为7.5～50Mpa。当超临界流体为N2时，适用的温度范围为-147.1～75℃，适宜的压力范围为3.35～110Mpa。当超临界流体为N2O时，适用的温度范围为36.5～75℃，适宜的压力范围为7.2～110Mpa。
对裂解的时间没有特殊的限制，以达到裂解为目的，通常为2～30分钟。延长裂解时间，并不会进一步增加裂解效果，因此实际操作中可尽量减少裂解的时间，以便提高生产效率，较佳裂解时间为2～10分钟。
裂解后取样，通过电镜观察病毒形态以验证裂解效果。
实施例1：甲1型流行性感冒病毒(A/New Caledonia/20/99(H1N1))的裂解
取来源于世界卫生组织(WHO)的甲1型流行性感冒病毒(A/NewCaledonia/20/99(H1N1))接种于9-11日龄的清洁级(SPF)鸡胚，按上述的病毒预处理方法，进行预处理，制备成血凝效价为1∶51200的病毒液。取200ml该病毒液将其置于洁净的超临界萃取仪(南通华安超临界萃取设备有限公司，超临界CO2萃取仪)的萃取釜内，通入二氧化碳，控制温度为32℃，压力为25MPa，保持该状态2分钟后，将压力降至常压，完成裂解。裂解后取样通过电镜观察病毒形态以验证裂解效果。(结果见图3)
从图3可见，超临界流体裂解后的溶液中无完整的病毒颗粒存在，由于脂膜或类脂膜被均一完全地破坏，血凝素从病毒表面完全脱落，从而形成均匀的弥散状态。完成了裂解操作的病毒液通过超速离心进行纯化，纯化也可以采用柱层析的方法进行。将纯化后的样品进行稀释，使稀释后血凝素含量为32μg/ml，进行效力实验，其结果是接种小白鼠后产生50％中和抗体的效价为1∶640，达到疫苗要求的标准。该稀释液分别接种小白鼠和豚鼠，接种后观察7天。全部小白鼠及豚鼠体重增加，健康存活，无任何异常表现。证明疫苗无异常毒性，并经过敏原性实验证明该方法制备的疫苗中不存在过敏原。
实施例2：甲3型流感病毒(A/Panama/2007/99(H3N2))
将来源于世界卫生组织(WHO)的甲3型流感病毒(A/Panama/2007/99(H3N2))按与实施例1相同的方法进行预处理，制备成血凝效价为1∶51200的病毒液。取200ml该病毒液将其置于洁净的超临界萃取仪的萃取釜内，通入二氧化碳，控制温度为35℃，压力为10MPa，保持该状态4分钟后，将压力降至常压，完成裂解。裂解后取样通过电镜观察病毒形态以验证裂解效果。(结果见图4)
从图4可见，超临界流体裂解后的溶液中无完整的病毒颗粒存在，由于脂膜或类脂膜被均一完全地破坏，血凝素从病毒表面完全脱落，从而形成均匀的弥散状态。完成了裂解操作的病毒液通过超速离心进行纯化，纯化也可以采用柱层析的方法进行。将纯化后的样品稀释，稀释后血凝素含量为31μg/ml，进行效力实验，其结果是接种小白鼠后产生50％中和抗体的效价为1∶480，达到疫苗要求的标准。该稀释液分别接种小白鼠和豚鼠，接种后观察7天。全部小白鼠及豚鼠体重增加，健康存活，无任何异常表现。证明疫苗无异常毒性，并经过敏原性实验证明该方法制备的疫苗中不存在过敏原。
实施例3：乙型流感病毒(B/Johannesburg/5/99)
将来源于世界卫生组织(WHO)的乙型流感病毒(B/Johannesburg/5/99)按与实施例1相同的方法进行预处理，制备成血凝效价为1∶51200的病毒液。取200ml该病毒液将其置于洁净的超临界萃取仪的萃取釜内，通入二氧化碳，控制温度为32℃，压力为20MPa，保持该状态10分钟后，将压力降至常压，完成裂解。裂解后取样通过电镜观察病毒形态以验证裂解效果。(结果见图5)
从图5可见，超临界流体裂解后的溶液中无完整的病毒颗粒存在，由于脂膜或类脂膜被均一完全地破坏，血凝素从病毒表面完全脱落，从而形成均匀的弥散状态。完成了裂解操作的病毒液通过超速离心进行纯化，纯化也可以采用柱层析的方法进行。将纯化后的样品进行稀释，使稀释后血凝素含量为34μg/ml，进行效力实验，其结果是接种小白鼠后产生50％中和抗体的效价为1∶640，达到疫苗要求的标准。该稀释液分别接种小白鼠和豚鼠，接种后观察7天。全部小白鼠及豚鼠体重增加，健康存活，无任何异常表现。证明疫苗无异常毒性，并经过敏原性实验证明该方法制备的疫苗中不存在过敏原。
实施例4：乙型流感病毒(B/Shangdong/7/97)
将来源于世界卫生组织(WHO)的乙型流感病毒(B/Shangdong/7/97)按与实施例1相同的方法进行预处理，制备成血凝效价为1∶51200的病毒液，取200ml该病毒液将其置于洁净的超临界萃取仪的萃取釜内，通入二氧化碳，控制温度为32℃，压力为45MPa，保持该状态20分钟后，将压力降至常压，完成裂解。裂解后取样通过电镜观察病毒形态以验证裂解效果。(结果见图6)
从图6可见，超临界流体裂解后的溶液中无完整的病毒颗粒存在，由于脂膜或类脂膜被均一完全地破坏，血凝素从病毒表面完全脱落，从而形成均匀的弥散状态。完成了裂解操作的病毒液通过超速离心进行纯化，纯化也可以采用柱层析的方法进行。将纯化后的样品进行稀释，稀释后血凝素含量为32μg/ml，进行效力实验，其结果是接种小白鼠后产生50％中和抗体的效价为1∶640，达到疫苗要求的标准。该稀释液分别接种小白鼠和豚鼠，接种后观察7天。全部小白鼠及豚鼠体重增加，健康存活，无任何异常表现。证明疫苗无异常毒性，并经过敏原性实验证明该方法制备的疫苗中不存在过敏原。
另外，为进一步说明本发明方法裂解病毒的效果，将实施例1～4裂解的病毒和使用化学裂解剂裂解的相应的病毒一起做了蛋白电泳实验，其结果见图7。图中标号1、2、3、4依次为实施例1～4分别裂解甲1、甲3、乙型病毒的两个毒株后，再经纯化的样品；5、6、7、8依次为用化学裂解剂裂解甲1、甲3、乙型病毒的两个毒株后，再经纯化的样品；9为标记物的蛋白分子量，从标号9原点处开始，分子量依次为116KD、66.2KD、45KD、35KD、25KD、18.4KD和14.4KD。从图7可看出，分子量为61KD的神经氨酸酶和分子量为50KD的血凝素呈现清晰的两条条带，化学裂解剂裂解的样品5～8与超临界裂解的样品1～4相比，多了小分子量的蛋白，同时还存在由于未完全裂解而残存于类脂膜上的大分子量的蛋白。因此，采用本发明的方法裂解病毒，可以获得蛋白成分更均一、纯度更高、含量更高的血凝素和神经氨酸酶。