马齿苋提取物及其抗缺氧用途 技术领域
本发明涉及医药技术领域，是马齿苋提取物及其抗缺氧用途。
背景技术
氧是绝大多数生命形式存在所必需的。许多病理过程如心脏病、严重哮喘、一氧化碳中毒、窒息、麻醉和中毒等情况下都会引起机体缺氧或供氧不足，航空航天、潜水、高原作业都极易发生缺氧。即使是短暂的局部的氧供不足都可能产生细胞、组织、器官不可逆的损伤，引起一些重要的生理病理变化。如何提高人类对低氧耐受能力和有效的干预低氧对人体损害的措施是我们必须面临和解决的重大问题。
目前，常用的抗缺氧方法是通过习服锻炼，即预先在可耐受的低氧环境中暴露一段时间，在产生耐受性以后再进入更低氧浓度的低氧环境。虽然习服锻炼可在一定程度上增强机体对缺氧的适应能力，但受到身体素质、时间、地点等多方面条件的限制，对许多人来说难以实施。而西药主要是用于对缺氧造成的各种症状的改善，如：乙酰唑胺是通过利尿减少有效循环血量，减轻心脏负荷而缓解因高原缺氧所引起的肺水肿；盐酸可乐定是通过降低平均动脉血压，减轻大脑灌注压，减少大脑血流量，从而避免大脑水肿等高原病症状的发生；地塞米松主要用于急性危重高原病的治疗等等，而且西药都存在不同程度的副作用。我国有不少学者对中草药抗缺氧作用进行了研究， 据报道具有抗缺氧效应的中药或中药有效成分有：人参(人参皂苷)、银杏内酯、红景天、川芎嗪、黄芪、丹参等。但是这些中草药有的分布局限、资源很少、价格比较昂贵，有的效果不明显。
发明内容
本发明提供一种能提高机体抗缺氧能力的马齿苋提取物。马齿苋为马齿苋科植物马齿苋Portulaca oleracea L.的全草。别名有瓜子菜、耐旱菜、安乐菜、酸苋、长命菜、长命苋等。一年生肉质草本植物，是药食两用资源植物。茎叶可食用，民间常做蔬菜，也可作家畜饲料。马齿苋具有分布广泛、易于种植采集、价格低廉等优点。
中医认为马齿苋味酸，性寒，可清热解毒，散盅消肿。体外试验表明有效成分有广谱抗菌作用，特别是对各型痢疾杆菌有抑制和杀灭作用。对百日咳、伤寒、肺结核也有较好的治疗效果，并对某些致病真菌也有不同程度的抑制作用。近年又发现其有增强免疫、清除氧自由基、抗衰老、降低血脂血糖等功效。有关化学成分分析发现马齿苋全草含有大量去甲肾上腺素(Noradrenaline，2.5mg/g鲜草)和多量钾盐，如：硝酸钾、氯化钾、硫酸钾等，以K20计算，鲜草含钾盐1％，干草含钾盐17％、此外尚含二羟基苯乙胺(Dopamine)，二羟基苯丙氨酸(DOPA)、苯甲酸、柠檬酸、谷氨酸、天冬氨酸、丙氨酸及蔗糖、葡萄糖、果糖等。国外资料[1.Ezekwe MO，Omara-Alwala TR，Membrahtu T，Nutritive characterizationof purslane accessions as influenced by planting date，Plant Foods Hum Nutr.1999；54(3)：183-91. 2.Simopoulos AP，Norman HA，Gillaspy JE，Duke JA，Common purslane：a source of omega-3 fatty acids and antioxidants，J Am Coll Nutr.1992 Aug；11(4)：374-82.3.Palaniswamy UR，McAvoy RJ，Bible BB，Stage of harvest and polyunsaturated essential fattyacid concentrations in purslane(Portulaca oleraceae)leaves，J Agric Food Chem.2001Jul；49(7)：3490-3.]报道，新鲜马齿苋全草所含组分(％)为：水分92.61、脂肪0.80、含氮可提取物2.24、不含氮可提取物2.16、粗纤准1.03、灰分1.56。近期研究报道100g新鲜马齿苋叶含有300-400mg α-亚麻酸1.22mg、维生素E 26.6mg维生素C 1.9mg、1.48mg谷胱甘肽。每百克可食部分中含蛋白质2.3g、脂肪0.5g、粗纤维0.7g、钙85mg、磷56mg、铁1.5mg、胡萝卜素2.23mg、硫胺素0.03mg、核黄素0.11mg、尼克酸0.7mg、维生素C 23mg。还发现马齿苋内含有ω-3不饱合脂肪酸，可用于防治心脏病发生。
本发明马齿苋提取物的制备方法如下：
将马齿苋地上部分或全草低温烘干，干品以石油醚(60～90℃)回流2小时，以去除脂溶性物质，在常温下挥干溶剂后，按常规将马齿苋用蒸馏水煎煮2次，第一次2小时，第二次1小时30分钟，合并两次煎煮液，以2500～3000转/分钟离心20～30分钟，弃沉淀，将上清液置100℃水浴浓缩，再加乙醇至醇浓度为80％，搅匀，在5～10℃下静置24～48小时，过滤后留取滤液，将滤液置旋转蒸发仪中浓缩干燥，得马齿苋提取物。
经动物实验证明(详见实施例)，本发明马齿苋提取物具有提高机体耐受缺氧能力地功能，主要的功效学或药效学作用如下：
一、提高机体缺氧耐受能力
1、明显延长小鼠在窒息性缺氧条件下的存活时间；
2、明显延长小鼠在常压缺氧条件下的存活时间；
3、明显延长小鼠在减压缺氧条件下的存活时间
4、明显延长小鼠在氰化钾缺氧条件下的存活时间；
二、促进机体在缺氧条件下的能量代谢
1、增强小鼠在缺氧条件下的线粒体增生和线粒体的呼吸功能；
2、增强小鼠在低氧条件下的葡萄糖转运体的功能；
3、增强小鼠在低氧条件下的无氧酵解限速酶的活性；
三、促进机体在低氧条件下对氧的利用率
1、促进小鼠在低氧条件下红细胞释放、生成和血红蛋白生成；
2、提高小鼠在低氧条件下红细胞的携氧能力；
3、促进小鼠在低氧条件下心机和骨骼肌的毛细血管增生；
四、促进机体在低氧条件下的抗氧化损伤能力
1、促进小鼠在低氧条件下脑、肝、血清SOD酶、CAT酶的活性；
2、减少小鼠在低氧条件下脑、肝等组织脂褐质和丙二醛的含量。
五、提高机体在缺氧条件下对感染的抵抗力
1、可缓解低氧条件下对白细胞的抑制作用
2、提高T细胞和白细胞的功能
本发明马齿苋提取物可用于制备抗缺氧保健食品和药物制剂。所述的保健食品包括日常食品加工工艺可以制成的各种食物形式，如：干粮、饮料、冲剂等；药物包括常规药物制剂工艺可以制成能够在临床上使用的药物剂型，如：丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊、片剂、口服液、注射剂、气雾剂、膜剂、微囊及各类长效制剂和复方制剂。
具体实施方式
本发明的马齿苋提取物制备方法为：取马齿苋地上部分或全草，低温烘干，石油醚(馏程60～90℃，下同)回流提取2小时，挥干溶剂后，按常规加蒸馏水煎煮2次，第一次为2小时，第二次为1小时30分钟，合并煎煮液，以2500～3000转/分钟离心20～30分钟，弃沉淀，上清液置100℃水浴浓缩后，以醇沉法去除杂质，即加入乙醇至醇浓度为80％，搅匀，在5～10℃条件下静置24～48小时，过滤后取滤液，将滤液浓缩干燥后，即为马齿苋提取物，分装密封备用即可。
实施例一：制备马齿苋提取物
采集新鲜马齿苋全草，洗净泥沙，以60℃低温烘干，称取马齿苋干品1000g，以石油醚回流提取2小时，于常温下挥干溶剂后加蒸馏水2000ml煎煮2次，第一次为2小时，第二次为1小时30分钟，合并两次煎煮液，以3000转/分钟离心20分钟，弃沉淀，上清液以100℃水浴浓缩至200ml，加入乙醇至醇浓度为80％，搅匀，在5℃条件下静置48小时，以滤纸过滤去除沉淀物，滤液置旋转蒸发仪浓缩干燥后得干粉75g，按1g/袋分装密封，即为马齿苋提取物成品。
实施例二：制备马齿苋提取物与人参皂苷复方制剂
将马齿苋提取物与人参皂苷以10∶1比例混匀，即为复方制剂。分装密封即可。
动物实验：以实施例一制备的马齿苋提取物及实施例二制备的复方制剂为例，以人参皂苷为对照品，进行如下实验。
实施例三：对小鼠常压缺氧耐受实验
1、配制药液：
(1)复方制剂溶液制备：取16.5g实施例二制备的复方制剂，溶于200ml蒸馏水，微热溶解。
(2)马齿苋提取物溶液制备：取15g实施例一制备的马齿苋提取物，溶于200ml蒸馏水，微热溶解。
(3)人参皂苷溶液制备：取3g人参皂苷溶于200ml蒸馏水，加热溶解。
2.动物及分组：昆明种小鼠60只(购自第二军医大学动物实验中心，下同)，随机分为4组，每组15只，分别为对照组、马齿苋组、人参皂苷组和复方制剂组。
3、实验方法：取上述各组药液，分别对各组小鼠施灌胃，每天一次，每只小鼠每次1ml，连续5天，对照组小鼠以等体积蒸馏水灌胃。缺氧实验使用150ml堆型瓶，密闭缺氧，观察小鼠存活时间，结果见表1。
表1对小鼠常压缺氧耐受时间的影响
组别 小鼠存活时间
对照组 13.11±1.66
马齿苋组 16.03±2.62*
人参皂苷组 15.91±2.33*
复方组 19.43±1.75**
*与对照组比P＜0.05；**与对照组比P＜0.01
由表1可见，马齿苋提取物与人参皂苷提高小鼠常压对缺氧耐受力的作用相近，复方制剂具有显著延长常压下小鼠缺氧耐受时间的作用。
实施例四、不同剂量马齿苋提取物的抗缺氧作用
1、配制药液：
将实施例一制备的马齿苋提取物以蒸馏水分别配成浓度为37.5mg/ml、75mg/ml、150mg/ml的溶液，作为低剂量、中剂量、高剂量三种溶液。
2、动物及分组：昆明种小鼠60只，随机分为高、中、低剂量组和对照组，每组15只。
3、灌胃与实验方法同实施例三，结果见表2。
表2不同剂量马齿苋提取物对小鼠缺氧耐受时间的影响
组别 小鼠存活时间
对照组 11.46±2.73
低剂量组 14.15±3.24
中剂量组 16.82±2.91*
高剂量组 19.58±1.87**
*与对照组比P＜0.05，**与对照组比P＜0.01
由表2可见，马齿苋提取物在75mg/ml以上剂量时表现出明显的抗缺氧作用，并随剂量的增加而增大，呈明显的量效关系。
实例五、对小鼠腹腔注射KCN急性缺氧耐受时间的影响
1.药液配制同实施例三。
2、昆明种小鼠60只小鼠，随机分成4组，各组小鼠分别灌胃给药，方法同实施例三，对照组灌胃等体积蒸馏水，连续5天。末次给药后1小时各组小鼠分别腹腔注射KCN 10mg/kg，记录小鼠死亡时间，结果见表3。
表3对小鼠腹腔注射KCN急性缺氧耐受时间的影响
组别 存活时间(m)
对照组 2.70±0.42
马齿苋组 3.51±0.56*
人参皂苷组 2.90±0.23
复方组 5.30±0.71**
与对照组比较*p＜0.05，**与对照组比P＜0.01
由表3可见，马齿苋提取物和复方制剂组都能提高小鼠对腹腔注射KCN急性缺氧耐受时间，而复方制剂的作用更为明显。
实施例六、对缺氧小鼠线粒体功能的影响
1、药液配制方法同实施例三，复方制剂的浓度为82.5mg/ml，马齿苋提取物浓度为75mg/ml，人参皂苷浓度为15mg/ml。
2、B/C小鼠48只，购自第二军医大学动物实验中心，随机分为4组，分别为正常对照组、缺氧对照组、马齿苋组、人参皂苷组和复方组。
3、缺氧及灌胃：将各组小鼠按实施例三方法灌胃5天，1ml/只/日。第6天，除正常对照组外，将其他4组小鼠置缺氧环境，缺氧采用500ml广口瓶，内放10克钠石灰，以吸收二氧化碳和水气，密闭缺氧90分钟，立即宰杀，速取大脑，冰冻生理盐水洗净，按文献[汤依群，戴德哉，赵健等，氯苄四氢小檗碱对小鼠大脑线粒体德保护作用(J)，中国药理学与毒理学杂志，1996，10(1)：31～3]方法分离线粒体，用Clark氧电极法测定线粒体呼吸功能，结果见表4。
表4小鼠大脑线粒体呼吸功能测定(呼吸控制率，P/O比)
组别 呼吸控制率(N) 呼吸控制率(F)
正常对照组 5.07±0.58 4.01±0.32
马齿苋组 3.85±0.26***## 3.34±0.39***##
人参皂苷组 3.51±0.35***# 3.00±0.33***
复方组 3.97±0.46***## 3.48±0.21***##
缺氧对照组 3.00±0.43*** 2.74±0.40***
与空白组比*P＜0.05，**＜0.01，***P＜0.001；与对照组比#P＜0.05，##＜0.01，
由表4可见，马齿苋提取物和复方制剂都具有增强小鼠在缺氧条件下线粒体呼吸功能的作用。
实施例七、对慢性缺氧小鼠红细胞、红细胞压积和血红蛋白的影响
1、药液配制方法同实施例三，复方制剂的浓度为82.5mg/ml，马齿苋提取物浓度为75mg/ml，人参皂苷浓度为15mg/ml。
2、动物及分组：ICR小鼠60只，购自第二军医大学动物实验中心，随机分为对照组、马齿苋组、人参皂苷组和复方组。
3、缺氧及灌胃：灌胃1ml/只/日，连续5天。缺氧采用上海701所杨园医用氧仓厂生产的医用氧仓，仓内氧浓度恒定在10％，并放入250克钠石灰以吸收二氧化碳和水气，小鼠在末次灌胃后放入氧仓，于12小时后摘除眼球取血，以血细胞自动分析仪分析各项指标，结果见表5。
表5马齿苋对缺氧12小时小鼠红细胞、红细胞压积和血红蛋白的影响
组别 红细胞数 血红蛋白 红细胞压积
马齿苋组 7.92±0.52* 133.86±10.37* 0.413±0.031*
人参皂苷组 7.89±0.78* 129.25±14.20 0.409±0.044
复方组 8.11±0.26* 145.37±11.49* 0.472±0.037*
对照组 7.11±0.76 117.13±13.59 0.371±0.037
与对照组比*P＜0.05
由表5可见，马齿苋提取物和复方制剂对小鼠红细胞、红细胞压积和血红蛋白皆具有明显升高作用。
实施例八、对慢性缺氧小鼠白细胞的影响
1、药液配制方法同实施例三，复方制剂的浓度为82.5mg/ml，马齿苋提取物浓度为75mg/ml，人参皂苷浓度为15mg/ml。
2、动物及分组
ICR小鼠75只，随机分为5组，分别为正常对照组、缺氧对照组、马齿苋组、人参皂苷组和复方组。
3、实验方法：灌胃5天，1ml/只/日。缺氧采用上海701所杨园医用氧仓厂生产的医用氧仓，仓内氧浓度恒定在10％，并放入250克钠石灰以吸收二氧化碳和水气，小鼠在末次灌胃后放入氧仓，分别于24小时后摘除眼球取血，以血细胞自动分析仪计数白细胞，结果见表6。
表6马齿苋提取物对慢性缺氧24小时小鼠白细胞数的影响
组别 白细胞(109/L)
马齿苋组 6.79±0.78**
人参皂苷组 4.78±0.57
复方组 6.88±0.59**
缺氧对照组 3.38±0.34
正常对照组 6.81±0.87**
注：**与缺氧对照组比P＜0.01
由表6可见，马齿苋提取物和复方制剂可显著升高白细胞数，缓解低氧条件下对白细胞的抑制作用。
由上可见，本发明制备的马齿苋提取物以及以马齿苋提取物为主与人参皂苷组成的复方制剂均具有明显的抗缺氧作用。本发明马齿苋提取物制备方法简单，成本低廉，抗缺氧效果显著，因此可用于制备抗缺氧药物或食品。