高GC含量大片段DNA的体外组装方法及应用.pdf

本发明涉及一种DNA体外组装方法，具体地，本发明涉及高GC含量大片段DNA的体外组装方法及应用。更具体地，本发明人利用改进的Gibson组装方法，在体外成功拼接了来自始旋链霉菌的原始霉素II生物合成基因簇，其可适用于高GC含量DNA大片段组装，并可以明显提高组装效率并简化组装过程。

1.  一种靶核酸序列的体外组装方法，其特征在于，包括步骤：
(a)提供用于拼接的n个结构单元，各结构单元的序列记为Ln，其中所述的n为≥2的正整数；和线性化的载体元件；
其中，
(i)所述的n个所述结构单元可拼接成式I所示结构的、两端分别带有第一和第二重叠区以及第一和第二限制性内切酶酶切位点的第一级拼接序列：
L1-L2-L3-…-LN(I)
式中，
L1、L2、……、Ln为各结构单元的核苷酸序列；
并且，位于第一级拼接序列的5'端的L1具有从5'至3'方向的式II所示的结构：
X0-X1-X2-X3-L1'(II)
式中，
X0为无或任意的长度为1-100bp核苷酸序列；
X1为第一重叠区；
X2为第一限制性内切酶酶切位点；
X3为无或任意的长度为1-20bp核苷酸序列；
L1'为待保留的拼接单元序列；
其中，X0-X1-X2-X3构成位于5'端的第一侧翼序列；
并且，位于第一级拼接序列的3'端的Ln具有从5'至3'方向的式III所示的结构：
Ln'-X4-X5-X6-X7(III)
式中，
X7为无或任意的长度为1-100bp核苷酸序列；
X6为第二重叠区；
X5为第二限制性内切酶酶切位点；
X4为无或任意的长度为1-20bp核苷酸序列；
Ln'为待保留的拼接单元序列；
其中，X4-X5-X6-X7构成位于3'端的第二侧翼序列；
并且，第一重叠区和第二重叠区是互不相同的，且GC含量为0-50％；
(ii)所述线性化的载体元件的结构如式IV所示，
X0b-X1b-X2b-X3b-Z-X4b-X5b-X6b-X7b(IV)
式中，
X0b为X0的互补序列；
X1b为X1的互补序列，即第一重叠区的互补序列；
X2b为所述的第二限制性内切酶酶切位点；
X3b为X3的互补序列；
Z为载体的结构序列；
X4b为X4的互补序列；
X5b为所述第二限制性内切酶酶切位点；；
X6b为X6的互补序列，即第二重叠区的互补序列；
X7b为X7的互补序列；
(b)在外切酶、聚合酶和/或连接酶酶存在下，使上述的n个结构单元和线性化的载体元件进行组装，从而形成式V所述的第一级连接产物，其中所述连接产物为环状；
L₁-L₂-L₃-…-L_n-X0b-X1b-X2b-X3b-Z-X4b-X5b-X6b-X7b(V)
式中，L1、L2、L3、Ln、X0b、X1b、X2b、X3b、Z、X4b、X5b、X6b、X7b的定义如上所述；
(c)任选地用所述的第一限制性内切酶和/或第二限制性内切酶上一步骤的连接产物，从而获得用于下一级组装的结构单元；并且任选地重复步骤(a)和步骤(b)共j次，从而形成j+1级组装产物，其中j为≥1的正整数。

2.  如权利要求1所述的方法，其特征在于，X0、X3、X4、和X7中的一个或多个为无。

3.  如权利要求1所述的方法，其特征在于，X0b、X3b、X4b、和X7b中的一个或多个为无。

4.  如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的第一侧翼序列为SEQIDNO.:1和/或所述的第二侧翼序列为SEQIDNO.:2。

5.  如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的靶核酸序列为放线菌的核苷酸序列。

6.  一种用于DNA体外组装的构建物，其特征在于，所述构建物包括：
用于拼接的n个结构单元，各结构单元的序列记为L_n，其中所述的n为≥2的正整数；和
线性化的载体元件；
其中，
(i)所述的n个所述结构单元可拼接成式I所示结构的、两端分别带有第一和第二重叠区以及第一和第二限制性内切酶酶切位点的第一级拼接序列：
L₁-L₂-L₃-…-L_n(I)
式中，
L1、L2、……、Ln为各结构单元的核苷酸序列；
并且，位于第一级拼接序列的5'端的L1具有从5'至3'方向的式II所示的结构：
X0-X1-X2-X3-L1'(II)
式中，
X0为无或任意的长度为1-100bp核苷酸序列；
X1为第一重叠区；
X2为第一限制性内切酶酶切位点；
X3为无或任意的长度为1-20bp核苷酸序列；
L1'为待保留的拼接单元序列；
其中，X0-X1-X2-X3构成位于5'端的第一侧翼序列；
并且，位于第一级拼接序列的3'端的Ln具有从5'至3'方向的式III所示的结构：
Ln'-X4-X5-X6-X7(III)
式中，
X7为无或任意的长度为1-100bp核苷酸序列；
X6为第二重叠区；
X5为第二限制性内切酶酶切位点；
X4为无或任意的长度为1-20bp核苷酸序列；
Ln'为待保留的拼接单元序列；
其中，X4-X5-X6-X7构成位于3'端的第二侧翼序列；
并且，第一重叠区和第二重叠区是互不相同的，且GC含量为0-50％；
(ii)所述线性化的载体元件的结构如式IV所示，
X0b-X1b-X2b-X3b-Z-X4b-X5b-X6b-X7b(IV)
式中，
X0b为X0的互补序列；
X1b为X1的互补序列，即第一重叠区的互补序列；
X2b为所述的第二限制性内切酶酶切位点；
X3b为X3的互补序列；
Z为载体的结构序列；
X4b为X4的互补序列；
X5b为所述第二限制性内切酶酶切位点；；
X6b为X6的互补序列，即第二重叠区的互补序列；
X7b为X7的互补序列。

7.  一种用于DNA体外组装的载体，其特征在于，所述载体是线性化的载体元件，或所述载体经酶切后可形成所述的线性化的载体元件；
其中，所述线性化的载体元件的结构如式IV所示，
X0b-X1b-X2b-X3b-Z-X4b-X5b-X6b-X7b(IV)
式中，
X0b为X0的互补序列；
X1b为X1的互补序列，即第一重叠区的互补序列；
X2b为所述的第二限制性内切酶酶切位点；
X3b为X3的互补序列；
Z为载体的结构序列；
X4b为X4的互补序列；
X5b为所述第二限制性内切酶酶切位点；；
X6b为X6的互补序列，即第二重叠区的互补序列；
X7b为X7的互补序列。

8.  一种权利要求6所述的用于DNA体外组装的构建物或权利要求7所述的用于DNA体外组装的载体的用途，其特征在于，用于高GC含量的大片段DNA的体外组装。

高GC含量大片段DNA的体外组装方法及应用
技术领域
本发明属于合成生物学技术领域，具体地，本发明涉及一种高GC含量大片段DNA的体外组装方法及应用。
背景技术
微生物(尤其是放线菌)产生的具有生物活性的天然产物(次级代谢产物)，是人类抵抗癌症、衰老和感染性疾病等的宝贵财富。据统计，在已报道的天然药物中，有50％左右是由放线菌科的细菌产生的。同时，生物信息学分析显示，已完成测序的放线菌基因组中除了已知功能天然药物的生物合成基因簇外，还含有大量的隐形天然产物生物成基因簇，这些信息为将来新功能天然药物的筛选挖掘提供了宝贵的资源库。随着细菌耐药性问题日益严峻，从放线菌资源库中开发挖掘抗耐药性菌株感染的新天然药物变得尤为重要，而其中天然产物生物合成基因簇(一般可达20-150kb)的快速克隆，将是重要的关键技术之一。传统建库筛选的方法操作步骤繁琐，耗时耗力。随着合成生物学的发展，各种DNA体外组装方法相继诞生，如DNAassembler与Gibson等温一步法。由于体外操作与方法设计的简便性，它们为快速克隆天然药物的生物合成基因簇提供了一种新方式。Gibson等温一步法由于操作简单、组装尺度大(目前拼接的最大分子尺度为580kb)，已被广泛用于各个实验室，但还未见报道用于高GC含量DNA大片段(主要针对放线菌天然产物生物合成基因簇)的组装。
Gibson等温一步法主要利用体外同源重组原理，在一个反应体系中，可一次同时组装多个片段。该方法涉及三种酶，T5外切酶产生片段间重叠区的粘性末端，Phusion聚合酶与Taq连接酶修补缺口。在拼接低GC含量片段(小于40％)时，组装效率可达100％。但文献报道显示，随着片段与载体重叠区GC含量的增加，组装效率逐级下降，当GC含量为40％时，效率为80％，而当GC含量升高至60％时，效率仅有30％。推测主要原因是反应在较低温度(50℃)进行，当GC含量升高后，片段末端由于退火温度过高不易解链或者解链后易发生错配，导致载体自连或者片段间错误连接。而放线菌来源DNA的GC含量一般都超过 70％，用传统的Gibson等温一步法显然无法满足拼接要求。本发明人的实验结果也证实了这一点，当在载体末端引入来自组装片段的40bp重叠区，组装3个5kb的DNA片段时(片段GC含量大于75％)，其组装效率为0。于是，本发明人对这种方法进行了改进，改进后可明显提高组装效率。最后，运用改进的方法应用于始旋链霉菌原始霉素II生物合成基因簇(67kb)的组装，验证了方法的有效性，因此，该方法为放线菌来源的天然产物生物合成基因簇以及各种高GC含量大片段DNA的快速克隆提供了很好的操作工具，本方法的推广应用将能有效地推动新天然药物挖掘开发的进度。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的高GC含量DNA大片段的体外组装方法，并用于原始霉素II生物合成基因簇的快速克隆。
在本发明的第一方面，提供了一种靶核酸序列的体外组装方法，包括步骤：
(a)提供用于拼接的n个结构单元，各结构单元的序列记为Ln，其中所述的n为≥2的正整数；和线性化的载体元件；
其中，
(i)所述的n个所述结构单元可拼接成式I所示结构的、两端分别带有第一和第二重叠区以及第一和第二限制性内切酶酶切位点的第一级拼接序列：
L1-L2-L3-…-LN(I)
式中，
L1、L2、……、Ln为各结构单元的核苷酸序列；
并且，位于第一级拼接序列的5'端的L1具有从5'至3'方向的式II所示的结构：
X0-X1-X2-X3-L1'(II)
式中，
X0为无或任意的长度为1-100bp核苷酸序列；
X1为第一重叠区；
X2为第一限制性内切酶酶切位点；
X3为无或任意的长度为1-20bp核苷酸序列；
L1'为待保留的拼接单元序列；
其中，X0-X1-X2-X3构成位于5'端的第一侧翼序列；
并且，位于第一级拼接序列的3'端的Ln具有从5'至3'方向的式III所示的结构：
Ln'-X4-X5-X6-X7(III)
式中，
X7为无或任意的长度为1-100bp核苷酸序列；
X6为第二重叠区；
X5为第二限制性内切酶酶切位点；
X4为无或任意的长度为1-20bp核苷酸序列；
Ln'为待保留的拼接单元序列；
其中，X4-X5-X6-X7构成位于3'端的第二侧翼序列；
并且，第一重叠区和第二重叠区是互不相同的，且GC含量为0-50％；
(ii)所述线性化的载体元件的结构如式IV所示，
X0b-X1b-X2b-X3b-Z-X4b-X5b-X6b-X7b(IV)
式中，
X0b为X0的互补序列；
X1b为X1的互补序列，即第一重叠区的互补序列；
X2b为所述的第二限制性内切酶酶切位点；
X3b为X3的互补序列；
Z为载体的结构序列；
X4b为X4的互补序列；
X5b为所述第二限制性内切酶酶切位点；；
X6b为X6的互补序列，即第二重叠区的互补序列；
X7b为X7的互补序列；
(b)在外切酶、聚合酶和/或连接酶酶存在下，使上述的n个结构单元和线性化的载体元件进行组装，从而形成式V所述的第一级连接产物，其中所述连接产物为环状；
L1-L2-L3-…-Ln-X0b-X1b-X2b-X3b-Z-X4b-X5b-X6b-X7b(V)
式中，L1、L2、L3、Ln、X0b、X1b、X2b、X3b、Z、X4b、X5b、X6b、X7b的定义如上所述；
(c)任选地用所述的第一限制性内切酶和/或第二限制性内切酶上一步骤 的连接产物，从而获得用于下一级组装的结构单元；并且任选地重复步骤(a)和步骤(b)共j次，从而形成j+1级组装产物，其中j为≥1的正整数。
在另一优选例中，X0、X3、X4、和X7中的一个或多个为无。
在另一优选例中，X0b、X3b、X4b、和X7b中的一个或多个为无。
在另一优选例中，所述的第一侧翼序列为SEQIDNO.:1和/或所述的第二侧翼序列为SEQIDNO.:2。
在另一优选例中，所述的两个相邻的结构单元之间设有长度为10-50bp的粘性末端。
在另一优选例中，所述粘性末端的序列来自或不来自靶核苷酸序列的结构基因的序列，优选地来自靶核苷酸序列的结构基因序列。
在另一优选例中，j为1-5的正整数，较佳地为1-3的正整数。
在另一优选例中，所述的第一限制性内切酶选自下组：NheI、NdeI。
在另一优选例中，所述的第二限制性内切酶选自下组：NheI、NdeI。
在另一优选例中，所述的第一限制性内切酶和第二限制性内切酶是不同的酶。
在另一优选例中，n为2-6的正整数，较佳地为2-4的正整数。
在另一优选例中，所述的核酸序列的长度大于15kb，较佳地为20-500kb，更佳地为30-300kb。
在另一优选例中，所述的靶核酸序列的CG含量≥55％，较佳地≥60％，更佳地≥65％或≥70％(如70-80％)。
在另一优选例中，所述的第一重叠区的CG含量为0-50％。
在另一优选例中，所述的第二重叠区的CG含量为0-50％。
在另一优选例中，所述的第一侧翼序列的CG含量为0-50％。
在另一优选例中，所述的第二侧翼序列的CG含量为0-50％。
在另一优选例中，所述的靶核酸序列为DNA序列。
在另一优选例中，所述的靶核酸序列为基因簇序列。
在另一优选例中，所述的靶核酸序列为放线菌的核苷酸序列。
在本发明的第二方面，提供了一种用于DNA体外组装的构建物，所述构建物包括：
用于拼接的n个结构单元，各结构单元的序列记为Ln，其中所述的n为≥2的正整数；和
线性化的载体元件；
其中，
(i)所述的n个所述结构单元可拼接成式I所示结构的、两端分别带有第一和第二重叠区以及第一和第二限制性内切酶酶切位点的第一级拼接序列：
L1-L2-L3-…-Ln(I)
式中，
L1、L2、……、Ln为各结构单元的核苷酸序列；
并且，位于第一级拼接序列的5'端的L1具有从5'至3'方向的式II所示的结构：
X0-X1-X2-X3-L1'(II)
式中，
X0为无或任意的长度为1-100bp核苷酸序列；
X1为第一重叠区；
X2为第一限制性内切酶酶切位点；
X3为无或任意的长度为1-20bp核苷酸序列；
L1'为待保留的拼接单元序列；
其中，X0-X1-X2-X3构成位于5'端的第一侧翼序列；
并且，位于第一级拼接序列的3'端的Ln具有从5'至3'方向的式III所示的结构：
Ln'-X4-X5-X6-X7(III)
式中，
X7为无或任意的长度为1-100bp核苷酸序列；
X6为第二重叠区；
X5为第二限制性内切酶酶切位点；
X4为无或任意的长度为1-20bp核苷酸序列；
Ln'为待保留的拼接单元序列；
其中，X4-X5-X6-X7构成位于3'端的第二侧翼序列；
并且，第一重叠区和第二重叠区是互不相同的，且GC含量为0-50％；
(ii)所述线性化的载体元件的结构如式IV所示，
X0b-X1b-X2b-X3b-Z-X4b-X5b-X6b-X7b(IV)
式中，
X0b为X0的互补序列；
X1b为X1的互补序列，即第一重叠区的互补序列；
X2b为所述的第二限制性内切酶酶切位点；
X3b为X3的互补序列；
Z为载体的结构序列；
X4b为X4的互补序列；
X5b为所述第二限制性内切酶酶切位点；；
X6b为X6的互补序列，即第二重叠区的互补序列；
X7b为X7的互补序列。
在本发明的第三方面，提供了一种用于DNA体外组装的载体，所述载体是线性化的载体元件，或所述载体经酶切后可形成所述的线性化的载体元件；
其中，所述线性化的载体元件的结构如式IV所示，
X0b-X1b-X2b-X3b-Z-X4b-X5b-X6b-X7b(IV)
式中，
X0b为X0的互补序列；
X1b为X1的互补序列，即第一重叠区的互补序列；
X2b为所述的第二限制性内切酶酶切位点；
X3b为X3的互补序列；
Z为载体的结构序列；
X4b为X4的互补序列；
X5b为所述第二限制性内切酶酶切位点；；
X6b为X6的互补序列，即第二重叠区的互补序列；
X7b为X7的互补序列。
在本发明的第四个方面，提供了一种如本发明第二方面所述的的用于DNA体外组装的构建物或如本发明第三方面所述的用于DNA体外组装的载体的用途，用于高GC含量的大片段DNA的体外组装。
在另一优选例中，所述的高GC含量的大片段DNA包括靶核酸序列，较佳地，所述的靶核酸序列包括基因簇序列。
在另一优选例中，所述的靶核酸序列为放线菌的核苷酸序列。
在另一优选例中，所述的高GC含量指GC含量H满足：50％＜H≤90％，较佳地55％＜H≤80％。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了改进的Gibson组装方法示意图。其中，在第一级组装(A)中采用PCR将通用重叠区(21bp的A或AG间隔出现)与限制性内切酶酶切位点(NdeI或NheI)引入到载体或片段中，获得一级组装的出发片段。片段间重叠区长度为30bp；在第二级组装(B)中，分别采用NdeI、NdeI与NheI、NheI对上一级片段进行酶切，获得第二级组装的出发片段F1-F3、F4-F6与F7-F9，片段间重叠区长度为45bp。
图2显示了改进的Gibson组装方法与原有方法的组装效率对比。从5kb至15kb，采用两组片段(F7-F9与F10-F12)进行鉴定。其中：
图2A代表原有Gibson组装方法的酶切鉴定结果；
图2B代表改进方法的鉴定结果；
图2C代表从15kb至45kb的组装时，改进方法的鉴定结果。每种方法均随机挑选20个转化子，两次生物学重复。图2C代表阴性对照(空载体pCC1BAC的酶切结果)，“*”表示正确组装，M1与M2分别表示1kbDNA梯状条带(DNAladder)和λHindIIIDNA梯状条带(DNAladder)。
图3显示了改进方法用于组装原始霉素II生物合成基因簇。
图3A显示基因簇体外组装时的等级化拼接模式。
图3B显示了最终的原始霉素II生物合成基因簇组装产物四种酶切鉴定结果。
图3C显示了组装产物功能互补结果，图示中Ia与IIa分别表示原始霉素I(PI)与原始霉素II(PII)的主要成分。HCCB10218表示始旋链霉菌出发菌株(购自上海来益生物药物研究开发中心)，10218ΔPII表示PII生物合成基因簇的缺失菌株、10218ΔPII/BAC-F15与10218ΔPII/BAC-F1F15分别表示10218ΔPII中导入空载体(BAC-F15)与PII生物合成基因簇体外组装产物 (BAC-F1F15)的互补菌株。
具体实施方式
发明人经过广泛而深入的研究，出乎意料地发现将经典的Gibson等温一步法经过特殊设计的结构进行适当的改进，可适用于高GC含量DNA片段(来源于PII生物合成基因簇)的组装，并设计了实验对此方法的拼接效率等效果进行了验证，在此基础上完成了本发明。
具体而言，本发明人利用建立的DNA组装新方法，其主要为以下2点：
1)引入载体与片段间通用的低GC含量的DNA重叠区；2)重叠区两侧设计交错的限制性内切酶酶切位点以实现等级化组装等策略；将组装效率从原有方法的0提升至20-30％。
实验验证过程：本发明人对来自于始旋链霉菌的PII生物合成基因簇进行了体外克隆，酶切与全长测序结果显示组装正确；接着，发明人通过对PCR引入的突变进行修复和功能互补，获得了具有生理功能的PII生物合成基因簇，为后续的代谢工程改造提供了突破性的改良的拼接技术。
术语
如本文所用，术语“Gibson等温一步法”是指一种由DanielGibson等人在2009年建立的一种高效的体外DNA组装方法，该方法利用“Chew-back”策略(即体外同源重组原理)，实现了生殖道支原体基因组(大小为580kb)的体外合成。
如本文所用，术语“始旋链霉菌(Streptomycespristinaespiralis)”是一种在适当的条件下，可以生产原始霉素(Pristinamycin)的链霉菌。
Gibson等温一步法
Gibson等温一步法具体操作步骤如下：
(1)采用PCR或酶切的方法制备出发片段，采用PCR获得线性载体，同时将重叠区与限制性内切酶酶切位点引入；
(2)在15μlGibson反应体系中加入总体积为5μl等摩尔量的DNA片段(线性载体用量为50-100ng)，50℃反应一小时；
(3)取1μl电转30μlE.coliEPI300感受态(1mm电击杯，1200V， 25μF,200Ω)，加入1mLSOC复苏两小时，涂板于含有12.5μg/mL氯霉素的LB固体平板上，37℃培养16-24h；
(4)挑单菌接入含有25μg/mL氯霉素的液体LB中，培养至OD600为0.4-0.6，加入1/1000的CopyControl^TMInductionSolution，继续培养12-16h；
(5)离心收集菌体，采用BAC/PACDNAKit进行BAC回收。
在本发明中，可采用常规的Gibson反应体系和方法。一种典型的Gibson反应体系和电转感受态高效制备方法如下：
(1)Gibson反应体系(600μl)

(2)5*等温反应缓冲液(600μl)

(3)E.coliEPI300电转感受态高效制备方法
1)挑EPI300单菌落接入SOB液体试管中，37℃过夜培养；
2)转接200μl菌液至含有200mlSOB的500ml摇瓶中(一次3个)，37度培养2-3h，至OD550＝0.5；
3)离心收集菌体，10％甘油洗涤2-3次，最后重悬至OD550＝200-250，大约400μl/每200mL菌液；
4)分装30μl/管，保存于-80℃。
本发明的主要优点在于：
本发明采用了改进了Gibson组装方法，使组装效率从0提升至20-30％，从而建立了一种适用于高GC含量DNA大片段的组装方法；同时，由于使用了通用的载体与片段间的重叠区片段，所以不再像原有Gibson组装方法，需要每一步扩增载体，即每次组装时均可采用相同载体，极大地提高了重组效率。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
菌株、质粒与试剂：
本发明涉及始旋链霉菌StreptomycespristinaespiralisHCCB10218，于2011年11月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号CGMCCNO.5486。E.coliEPI300(用于大片段体内拼接)购自Epicentre公司。E.coliS17-1(用于接合转移)购自BiomedalLifeScience公司。
本发明中pSET152与pKC1139均购自中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心)。pCC1BAC购自于Epicentre公司。
本发明中使用的DNA胶回收纯化以及质粒提取试剂盒购自Axygen公司，BAC/PACDNAKit购自OmegaBio-Tek公司。限制性内切酶NdeI，NheI，SphI与MluI购自Fermentas公司(用于图3B中酶切鉴定)；Taq连接酶与PhusionDNA聚合酶购自NEB公司，T5核酸外切酶与CopyControl^TMInductionSolution购自Epicentre公司。其他常规试剂均为国产分析纯或进口分装。
培养基：
1.液体LB培养基(1L)
蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl10g、蒸馏水1L；121℃灭菌20分钟。
2.固体LB培养基(1L)
蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl10g、琼脂粉20g、蒸馏水1L；121℃灭菌20分钟。
3.液体SOB培养基(1L)
蛋白胨20g、酵母粉5g、氯化钠0.5g、氯化钾0.186g、蒸馏水1L、用氢氧化钠调节pH至7.0；121℃灭菌20分钟。
4.液体SOC培养基
液体SOB培养基添加20mM葡萄糖；121℃灭菌20分钟。
5.液体RP培养基配方(1L)
可溶性淀粉10g、葡萄糖10g、黄豆粉15g、酵母粉5g、KNO₃2.5g、NaCl1g、CaCO₃4g；蒸馏水1L。调pH7.0～7.2，121℃灭菌20分钟。
6.固体RP培养基配方(1L)
可溶性淀粉20g、黄豆饼粉10g、NaCl2g、KH₂PO₄0.5g、MgSO₄.7H₂O1g、CaCO₃3g、琼脂粉20g、蒸馏水1L；调pH6.4，121℃灭菌20分钟。
7.始旋链霉菌种子培养基(1L)
可溶性淀粉10g，葡萄糖10g，黄豆粉15g，酵母粉5g，KNO₃2.5g，NaCl1g，CaCO₃4g。先将淀粉用热水糊化，加入其它原料，定容，调pH7.0～7.2，最后加入碳酸钙，搅拌均匀，分装灭菌。
8.始旋链霉菌发酵培养基(1L)
可溶性淀粉10g，葡萄糖15g，黄豆粉25g，酵母粉3.5g，棉籽蛋白粉5gKH₂PO₄0.1g，MgSO₄·7H₂O2g，。先将淀粉用热水糊化，再加入其它原料，定容，调pH6.0，然后加入碳酸钙6g，搅拌均匀，分装灭菌。
实施例1
改进的Gibson组装方法与原有方法组装效率对比
前期，采用Gibson等温一步法直接组装来自于原始霉素II生物合成基因簇中的3个片段(F7-F9，尺度均大约5kb,其中，各片段的GC含量均大于70％)，载体基本全部自连，组装效率为0。更换其他一组3个片段(F10-F12，尺度均大约5kb，各片段的GC含量为均大于70％)进行组装，结果类似(图2)。该实 验结果提示，高GC含量重叠区(GC含量约75％)导致如此低的组装效率。
于是本发明人对原有方法进行了如下改进(图1)：
1)针对链霉菌基因组高GC含量的特点，此次设计主要在载体pCC1BAC或片段两侧添加21bp富含A或者AG的接头(序列如SEQIDNO.:1和2所示)，以降低载体自连频率，提高组装效率，其中序列如下：
SEQIDNO.:1:TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT；
SEQIDNO.:2:TCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTC。
2)由于使用了相同的载体与片段间重叠区，所以不再像原有Gibson组装方法，需要每一步扩增载体，即每次组装时均可采用相同载体；
3)重叠区两侧设计了两个相互交错的限制性内切酶酶切位点(NdeI和NheI)，以获得上一级的组装产物，实现等级化拼接。
本发明人采用改进方法，对上述两组片段(从5kb至15kb)进行了组装，结果如表1所示：组装效率从原有的0提升至30％。在下一级组装过程中(从15kb至45kb)，效率为20％。每一次组装结果均随机挑选20个转化子进行鉴定，两次生物学重复。
表1组装效率结果的总结

其中，本实施例1和实施例2中所采用的各拼接元件的GC含量如表2所示。
表2拼接元件的GC含量