一种女性阳虚质不孕症的筛查试剂盒.pdf

本发明公开了一种女性阳虚质不孕症的筛查试剂盒，它包括任选的用于检测testisin基因表达水平的试剂。本发明还公开了检测testisin基因表达水平的试剂在制备女性阳虚质不孕症筛查用试剂中的用途。本发明试剂盒通过检测testisin基因的表达水平，可以判断待检人群患女性阳虚质不孕症的风险，可用于临床女性阳虚质不孕症的辅助诊断，为患者采取相关的治疗措施或者决策提供有效的依据，临床应用前景良好。

1.一种女性阳虚质不孕症的筛查试剂盒，其特征在于：它包括任选的用
于检测testisin基因表达水平的试剂。
2.根据权利要求1所述的的筛查试剂盒，其特征在于：所述试剂是用于
检测血清中testisin基因表达水平的试剂。
3.根据权利要求1或2所述的的筛查试剂盒，其特征在于：所述testisin
基因的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。
4.根据权利要求1～3任意一项所述的筛查试剂盒，其特征在于：所述
检测testisin基因表达水平的试剂时Northern-blot检测方法用试剂、RT-PCR
检测方法用试剂或原位杂交检测方法用试剂。
5.根据权利要求4所述的筛查试剂盒，其特征在于：所述RT-PCR检测
方法用试剂包括SEQIDNO:2～3所示的引物对。
6.检测testisin基因表达水平的试剂在制备女性阳虚质不孕症筛查用试
剂中的用途。
7.根据权利要求5所述的用途，其特征在于：所述试剂是用于检测血清
中testisin基因表达水平的试剂。
8.根据权利要求5或6所述的用途，其特征在于：所述testisin基因的
核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。
9.根据权利要求6～8任意一项所述的用途，其特征在于：所述检测testisin
基因表达水平的试剂时Northern-blot检测方法用试剂、RT-PCR检测方法用
试剂或原位杂交检测方法用试剂。
10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于：所述RT-PCR检测方法
用试剂包括SEQIDNO:2～3所示的引物对。

一种女性阳虚质不孕症的筛查试剂盒

技术领域

本发明涉及一种女性阳虚质不孕症的筛查试剂盒。

背景技术

不孕的医学定义为一年未采取任何避孕措施，性生活正常而没有成功妊娠。主要分为原发不孕及继发不孕。原发不孕为从未受孕；继发不孕为曾经怀孕以后又不孕。根据这种严格的定义，不孕是一种常见的问题，大约影响到至少10％～15％的育龄夫妇。引起不孕的发病原因分为男性不孕和女性不孕。

阳虚是阳虚证和阳虚体质的共同病理机制，其主要病机为体内阳气虚衰，以肢寒身冷等寒象为主要表现。阳虚质是阳气不足、以虚寒现象为主要特征的体质状态。先天不足，或病后阳亏，是形成阳虚质的主要原因。

近年来研究发现不孕患者中阳虚质所占比例位居首位。女性阳虚质不孕症患者，临床上多由肾气虚弱，经血不足，冲任失调；或胞宫虚寒，胞脉失养，运用中医专方治疗效果较佳。

但是，关于女性阳虚质不孕症的中医诊断和评价，目前均必须依赖于医生对患者的访问，技术性强，对检测人员的专业要求高，而且工作量非常大。

testisin是一种糖基磷脂酰肌醇锚定的丝氨酸蛋白酶，其在精子生成、附睾精子成熟和受精中起重要作用。

未见testisin与阳虚不孕之间的关系的报道。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种女性阳虚质不孕症的筛查试剂盒。

本发明女性阳虚质不孕症的筛查试剂盒，它包括任选的用于检测testisin基因表达水平的试剂。

优选地，所述试剂是用于检测血清中testisin基因表达水平的试剂。

优选地，所述testisin基因的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。

testisin基因的核苷酸序列如下：

优选地，所述检测testisin基因表达水平的试剂时Northern-blot检测方法用试剂、RT-PCR检测方法用试剂或原位杂交检测方法用试剂。进一步优选地，所述RT-PCR检测方法用试剂包括SEQIDNO:2～3所示的引物对。

本发明还提供了检测testisin基因表达水平的试剂在制备女性阳虚质不孕症筛查用试剂中的用途。

优选地，所述试剂是用于检测血清中testisin基因表达水平的试剂。

优选地，所述testisin基因的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。

优选地，所述检测testisin基因表达水平的试剂时Northern-blot检测方法用试剂、RT-PCR检测方法用试剂或原位杂交检测方法用试剂。进一步优选地，所述RT-PCR检测方法用试剂包括SEQIDNO:2～3所示的引物对。

本发明试剂盒通过检测testisin基因的表达水平，可以判断待检人群患女性阳虚质不孕症的风险：若testisin基因的表达水平高，则患女性阳虚质不孕症的风险低，若testisin基因的表达水平低，则患女性阳虚质不孕症的风险高，可用于临床女性阳虚质不孕症的辅助诊断，临床应用前景良好。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

具体实施方式

实施例1testisin基因的表达水平与女性阳虚质不孕症的关系

1.材料与方法

1.1实验材料

1.1.1主要实验仪器

定量PCR仪MJResearch,PTC-200

紫外分光光度仪BECKMAN

C1000ThermalCyclerBIO-RAD

1.1.2主要实验材料与试剂

1.1.3试剂配制：

(1)PBS缓冲液(g/1,000mL)：

加入DEPC处理的RNase-Free的水，pH值为7.3左右，定容至1000mL，高压灭菌。

(2)红细胞裂解液：

加入DEPC处理的RNase-Free的水，定容至1000mL，过滤除菌。

(3)血液抗凝剂：10μL0.5MEDTA/ml血液

1.2临床资料

1.2.1对象来源

来源于2013年12月～2015年1月于成都中医药大学第二附属医院门诊，选取典型女性阳虚质不孕患者为研究对象，选取典型平和体质正常健康人为对照组。

1.2.2不孕的诊断标准(参照第七版全国高等学校教材《妇产科学》)

婚后夫妇同居一年以上，有正常性生活，男方生殖功能正常，未避孕而未能受孕者称为不孕症。婚后未避孕而从未妊娠者，称为原发不孕。曾经妊娠，而后未避孕连续一年未再妊娠者，称为继发不孕。

1.2.3中医体质类型分类标准(参照中华中医药学会《中医体质分类与判定》)

阳虚质：

主项：平素畏冷，手足不温，喜热饮食，精神不振，睡眠偏多。

副项：面色晄白，目胞晦暗，口唇色淡，毛发易落，易出汗，大便溏薄，小便清长，舌淡胖嫩，边有齿痕，苔润，脉象沉迟。

平和质：

主项：阴阳气血调和，以体态适中、面色红润、精力充沛等。

副项：面色、肤色润泽，头发稠密有光泽，目光有神，鼻色明润，嗅觉通利，唇色红润，不宜疲劳，精力充沛，耐受寒热，睡眠良好，胃纳佳，二便正常，舌色淡红，苔薄白，脉和缓有力。

1.2.4纳入标准

(1)年龄21～49岁的育龄期女性；

(2)自愿参加实验，签署知情同意书。

1.2.5排除标准

(1)合并有肝、肾、心血管和造血系统等严重原发性疾病者；

(2)有严重视听和语言障碍，可能影响对调查问卷的正确理解和回答者；

(3)严重精神病患者。

1.2.6剔除标准

(1)不符合纳入标准或符合排除标准者；

(2)未按规定完整填写调查表者。

1.2.7一般资料分析

(1)病例分布情况

本实验共纳入受试者28例，最终进入评价的受试者28例：病例组22例，对照组6例。

(2)两组患者基本资料

表1对照组体质类型

表2阳虚组体质类型

1.3实验方法

1.3.1中医体质评定标准

依据最新2009版中华中医药学会《中医体质分类与判定》标准进行体质筛选。阳虚体质诊断标准为：阳虚亚量表转化分≥40分，且平和质亚量表中转化分<60分；平和体质诊断标准为：平和质亚量表中转化分≥60分，且阳虚及其他偏颇体质亚量表转化分<40分。具体量表见附录1。

1.3.2qRT-PCR技术检测testisin基因的研究

(1)样品制备

抽取每例患者新鲜EDTA抗凝血2ml，400-500g离心5min，弃上清；

加入6-10倍细胞体积的红细胞裂解液，轻轻吹打混匀，室温放置4-5min；

4℃，400-500g离心5min，弃上清；

重复b)和c)

洗涤1-2次：加入适量PBS，重悬沉淀，400-500g离心3min，弃上清；

加入200μLTrizol。

(2)提取RNA，合成cDNA

①提取RNA

在分离出的每一管细胞中加入200μLTRIZOL，用枪头吹打使细胞全部脱离板底，将其转入1.5mLEp管中；

用5mL带7号针头的1次性注射器快速吹打10次进行匀浆以剪切基因组DNA，将匀浆样品在室温孵育5min以使核蛋白体完全分解；

加40μL氯仿，盖紧Ep管盖，用手剧烈振荡15s并于室温孵育2-3min；

4℃，12,000×g离心15min。离心后混合物分成3层：下层红色的为苯酚-氯仿层，中间层为细胞残渣，上层无色的为水相层，RNA存在于水相层中，水相层的容量大约为所加TRIZOL容量的60％；

将水相层转移到干净的1.5mLEp管中，加入等量异丙醇，颠倒混匀，将混匀后的样品于室温孵育10min；

4℃，12,000×g离心10min。倒掉上清液，用75％的乙醇1mL洗涤RNA沉淀1-2次，旋涡振荡混合样品后，4℃，7,500×g离心5min；

倒掉乙醇，常温干燥RNA沉淀10min，加入20μL无RNA酶的H2O，并于55℃孵育5min，以使RNA充分溶解；

取5μLRNA样品，加495μL无RNA酶的TE缓冲液(pH8.0)稀释后，用紫外分光光度计检测样品在260nm和280nm处的吸收值，分析纯度和浓度。

②合成cDNA

提前取出cDNA合成试剂盒，室温下至少放置30min，实验前15min内取出RNA样品。

将合成试剂与样品按如下比例配制：

表3cDNA合成试剂配制表

将配制好的cDNA样品放置于PTC-200中，选择cDNA合成程序开始进行合成。cDNA合成程序如下：

1＝5minutesat25℃

2＝60minutesat42℃

3＝5minutesat70℃

4＝10minutesat20℃

5＝End

(3)testisin基因的检测

①qPCR实验样品配制

a)qRT-PCR实验样品配制

提前取出qRT-PCR试剂盒及合成好的cDNA样品，室温下放置15-20min。实验样品配制如下：

qRT-PCR样品：15ul＝10ulMasterMix+0.2ulSample+4.8ulH₂O

引物：5ul＝1ulForwardPrimer+1ulReversePrimer+3ulH₂O

利用PrimerExpress5.0软件对所需检测基因进行引物设计，检测testisin基因的表达量变化情况，选择小鼠β-Actin基因为内参基因。

表4标识基因及内参基因的引物信息

b)qRT-PCR样品上机

将配制好的qPCR样品分装置0.5ml薄壁管中，瞬时离心10-30s，样品上机。上机程序如下：

1＝95℃for3:00

2＝95℃for0:10

3＝55℃for0:20

+PlateRead

4＝72℃for0:30

5＝GOTO2,39moretimes

6＝MeltCurve50.0to95.0℃，increment0.5℃

For0:05+PlateRead

7＝END

c)qRT-PCR实验数据处理与分析

将软件BioRad所分析得出的ct值悉数拷至EXCEL表格中排列整齐，参照qPCR经典数据处理方法，以同组中β-Actin为内参，计算出每组基因△ct值(△ct＝ct₁-ct_β-Actin)，以2为底数算出2^△ct即每个基因表达量的绝对值。

利用PrimerExpress5.0软件对所需检测基因进行引物设计，检测Testisin基因的表达量变化情况，选择人β-Actin基因为内参基因。

2.结果

运用EXCEL软件计算出各组各基因2^△ct，所有数据均扩大10³倍。经SPSS17.0软件统计，采用非参数检验法。

如表5所示，运用qRT-PCR对对照组及阳虚质组testisin基因检测可知，阳虚质组外周血细胞testisin基因表达与正常健康人相比显著下调(P＜0.05)。

表5阳虚患者testisin基因表达情况

注：与对照组比较，▲P<0.05

3.结论

实验结果说明，与正常健康女性相比，女性阳虚不孕患者外周血细胞testisin基因表达下调。

说明女性阳虚不孕与testisin基因的表达水平负相关，通过检测testisin的表达水平，可以筛查女性阳虚不孕患者。

实施例2本发明试剂盒的组成及待检样本的检测

一、RT-PCR检测试剂盒

1、试剂盒的组成

逆转录试剂(50人份)：

扩增和检测试剂(50人份)：

目标基因testisin的引物对(SEQIDNO.2～3所示)：

F:5-ATAGTGGGTGGCGATGA-3

R:5-TTGGTAACGGTTGGAAT-3

β-Actin的引物对(SEQIDNO.4～5所示)：

F:5-TGGCATCCATGAAACTACATTCA-3

R:5-TGCCTGGGTACATGGTGGTA-3

2、试剂盒的使用方法

(1)取待检样品，用常规的TRIZOL法提待检样本的总RNA。

(2)反转录

以步骤(1)得到的总RNA为模板，用上述逆转录试剂，得cDNA混合物。

(3)cDNA扩增

取步骤(2)得到的cDNA为模板，用上述cDNA扩增及实时荧光定量检测试剂扩增并检测cDNA的量。

(4)数据分析作图

设定一个荧光强度的阈值，利用BIO-RAD公司开发的CFXManager软件分析各组细胞的基因表达情况，分析方法使用△Ct值法。

综上，本发明试剂盒通过检测testisin基因的表达水平，可以筛查待检女性患女性阳虚质不孕症的风险：若testisin基因的表达水平高，则患女性阳虚质不孕症的风险低，若testisin基因的表达水平低，则患女性阳虚质不孕症的风险高，可用于临床女性阳虚质不孕症的辅助诊断，为患者采取相关的治疗措施或者决策提供有效的依据，临床应用前景良好。