一种辅助筛选抗条锈病小麦的方法及其专用引物技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种辅助筛选抗条锈病小麦的方法及其专用引物。
背景技术
小麦是重要的世界性粮食作物，21世纪以来，其平均每年种植面积约2362万hm2。
小麦产量影响着我国人民生活和国家粮食安全，高产稳产是我国小麦生产中的一件大
事。小麦条锈病(Pucciniastriiformisf.sp.tritici)是世界上最严重的小麦病害之一。小
麦条锈病是一种分布广泛的气传病害，在气候冷凉、湿度大和高海拔地区尤为严重，
具有流行频率高、爆发性强、发生范围广和危害性大等特点，严重威胁着小麦的高产
稳产，因此如何控制其流行危害，越来越受到人们的高度重视。全世界有4300万hm2
条锈病易发区，占总种植面积的19.4％。我国是世界上条锈病最大的流行地区，约2000
万hm2，特别在西北和西南地区连年发生。20世纪50年代至今，我国先后出现8次
条锈病大流行，给小麦生产造成巨大损失，其中1950年、1964年、1990年和2002
年四次大流行发生面积最大、危害最重，分别引起小麦产量损失600万吨、320万吨、
180万吨和130万吨，前两次发病面积高达1333万hm2以上，后两次发病面积为733
万hm2以上。随着小麦广谱毒性条锈菌新生理小种条中32号(条锈菌小种CYR32)
和条中33号(条锈菌小种CYR32)的出现及其迅速蔓延，致使我国大部分麦区抗病品种
丧失抗性。据统计，2004-09年我国条锈病每年平均发生面积约420万hm2，最大年份
667万hm2左右，给小麦生产造成巨大损失。
生产实践中，可以用化控措施对条锈病进行防治，但容易对环境及人畜带来安全
隐患，利用抗病品种无疑是防治小麦条锈病最为经济、安全、有效的措施。目前已经
命名的小麦抗条锈病基因分布于67个位点(Yr1-Yr67)，除Yr18、Yr29、Yr30、Yr36、
Yr39、Yr46、Yr48、Yr49、和Yr52(成株抗病基因)外，其余已命名的抗条锈病基因
多为具有生理专化性的主效抗病基因，由于其对条锈病表现高抗且易于田间选择而深
受育种家的喜爱。为了避免大面积播种抗源单一而造成抗性频繁丧失，需要持续发掘
利用新的抗病基因及其连锁标记。为了利用抗病品种，科研工作者提出了如多系品种、
聚合育种及抗性品种的合理布局等许多理论。这些理论和方法的核心是抗病基因的合
理利用，即实现抗病基因在时空分布上多元化，使抗病基因和病菌毒性基因互作趋于
稳定状态，从而延缓毒性小种产生和发展。要实现小麦品种抗条锈病基因多样化，必
需掌握丰富的抗病基因明确的抗源，并不断发掘和创制新的抗源，扩大和充实抗病基
因库，为培育抗病品种提供更加丰富广泛的抗源和抗病基因。
分子标记辅助选择(Marker-assistedselection，MAS)是在作物遗传改良过程中用
分子标记作为辅助选择的手段，其原理是选用与目标基因紧密连锁或者共分离的分子标
记对后代株系进行目标基因或染色体区段的筛选，进而在早代即可获得含有目标基因的
优良单株，提高选择效率。分子标记在小麦抗病育种中表现诸多优势，其标记量大，基
因位点丰富，不受环境条件及植物生长因素影响，该技术使检测多个抗病基因导入工作
成为可能，极大地提高基因聚合效率。小麦育种中常用的分子标记包括连锁标记(SSR
等)和依据基因序列开发的功能标记(STS等)两大类。单核苷酸多态性(Singlenucleotide
polymorphism，SNP)是基因组中最常见的遗传多态性，随着下一代测序技术(NGS)
的发展，使用高密度SNP微阵列芯片对大量样本进行扫描成为MAS的新方向。
发明内容
本发明的目的是提供一种辅助筛选抗条锈病小麦的方法及其专用引物。
本发明提供了一种引物组合，为如下(a)或(b)或(c)：
(a)wmc658引物对和wsnp_ex_c10555_17235832引物组；
(b)所述wmc658引物对；
(c)所述wsnp_ex_c10555_17235832引物组；
所述wmc658引物对为能扩增片段A的引物对；所述片段A为以小麦基因组DNA
为模板采用序列表的序列1所示的单链DNA分子和序列表的序列2所示的单链DNA
分子组成的引物对进行PCR扩增得到的片段；
所述wsnp_ex_c10555_17235832引物组为能扩增片段B的引物对；所述片段B为
以小麦基因组DNA为模板采用序列表的序列3所示的单链DNA分子、序列表的序列
4所示的单链DNA分子和序列表的序列5所示的单链DNA分子组成的引物组进行
PCR扩增得到的片段。
所述wmc658引物对由序列表的序列1所示的单链DNA分子和序列表的序列2
所示的单链DNA分子组成。
所述wsnp_ex_c10555_17235832引物组由序列表的序列3所示的单链DNA分子、
序列表的序列4所示的单链DNA分子和序列表的序列5所示的单链DNA分子组成。
所述引物组合(a)中，每个引物对单独包装。所述引物组合(a)中，每条引物
单独包装。所述引物组合(b)中，每条引物单独包装。所述引物组合(c)中，每条
引物单独包装。
所述引物组合的用途为如下(Ⅰ)或(Ⅱ)：(Ⅰ)辅助筛选抗条锈病植物；(Ⅱ)
辅助鉴定植物的抗条锈病性状。
本发明还保护所述引物组合在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的用途为如下(Ⅰ)
或(Ⅱ)：(Ⅰ)辅助筛选抗条锈病植物；(Ⅱ)辅助鉴定植物的抗条锈病性状。
本发明还保护含有所述引物组合的试剂盒；所述试剂盒的用途为如下(Ⅰ)或(Ⅱ)：
(Ⅰ)辅助筛选抗条锈病植物；(Ⅱ)辅助鉴定植物的抗条锈病性状。
本发明还保护所述试剂盒的制备方法，包括将所述引物组合中的每条引物独立包
装的步骤。
以上任一所述抗条锈病植物可为抗条锈病小麦，具体可为小麦品种“济麦22”、小
麦品种“AvocetS”、小麦品种“济麦22”的衍生品种或小麦品种“济麦22”与其它小麦品
种的杂交后代。以上任一所述抗条锈病植物可为小麦品种“济麦22”和小麦品种“Avocet
S”的杂交后代。
以上任一所述植物可为小麦。以上任一所述抗条锈病性状可为侵染型IT＝0-2。
以上任一所述条锈病具体可为条锈菌小种CYR32引起的条锈病。
本发明还保护一种辅助鉴定待测小麦的抗条锈病性状的方法，包括如下步骤：
以待测小麦的基因组DNA为模板，分别采用所述wmc658引物对和所述
wsnp_ex_c10555_17235832引物组进行PCR扩增；
如果采用所述wmc658引物对进行PCR扩增得到的扩增产物中具有242bp的特异
片段且采用所述wsnp_ex_c10555_17235832引物组进行PCR扩增得到的扩增产物中目
标SNP的基因型为非CC纯合型，待测小麦为候选的具有抗条锈病性状的小麦；如果
采用所述wmc658引物对进行PCR扩增得到的扩增产物中不具有242bp的特异片段且
采用所述wsnp_ex_c10555_17235832引物组进行PCR扩增得到的扩增产物中所述目标
SNP的基因型为CC纯合型，待测小麦为候选的具有感条锈病性状的小麦；所述非CC
纯合型为TT纯合型或TC杂合型；所述目标SNP为小麦基因组中的序列表的序列8
所示核苷酸序列中的第24位核苷酸。
本发明还保护一种辅助鉴定待测小麦的抗条锈病性状的方法，包括如下步骤：
以待测小麦的基因组DNA为模板，采用所述wmc658引物对进行PCR扩增；
如果PCR扩增产物中具有242bp的特异片段，待测小麦为候选的具有抗条锈病性
状的小麦；如果PCR扩增产物中不具有242bp的特异片段，待测小麦为候选的具有感
条锈病性状的小麦。
本发明还保护一种辅助鉴定待测小麦的抗条锈病性状的方法，包括如下步骤：
以待测小麦的基因组DNA为模板，采用所述wsnp_ex_c10555_17235832引物组进
行PCR扩增；
如果PCR扩增产物中目标SNP的基因型为非CC纯合型，待测小麦为候选的具有抗
条锈病性状的小麦；如果PCR扩增产物中所述目标SNP的基因型为CC纯合型，待测小
麦为候选的具有感条锈病性状的小麦；所述非CC纯合型为TT纯合型或TC杂合型；所
述目标SNP为小麦基因组中的序列表的序列8所示核苷酸序列中的第24位核苷酸。
本发明还保护一种辅助筛选抗条锈病小麦的方法，包括如下步骤：按照以上任一
所述方法鉴定待测小麦的抗条锈病性状性状，筛选具有高抗条锈病性状的小麦。
采用wmc658引物对时的PCR扩增的程序：94℃5min；94℃30s、60℃1min、
72℃1min，35个循环；72℃10min。
具体可通过6％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染显色检测采用wmc658引物对时
的PCR扩增产物。
采用wsnp_ex_c10555_17235832引物组时的PCR扩增的程序：94℃15min；94℃
20s、61-55℃1min(每个循环降0.6℃)、10个循环；94℃20s、55℃60s、26个循环。
具体可通过酶标仪使用FAMVICROM光束扫描和KlusterCaller分型软件对采用
wsnp_ex_c10555_17235832引物组时的PCR扩增产物进行分型检测。
以上任一所述抗条锈病小麦为侵染型IT＝0-2的小麦。以上任一所述感条锈病小麦
为侵染型IT＝3-4的小麦。以上任一所述具有抗条锈病性状的小麦为侵染型IT＝0-2的
小麦。以上任一所述具有感条锈病性状的小麦为侵染型IT＝3-4的小麦。
以上任一所述抗条锈病植物可为抗条锈病小麦，具体可为小麦品种“济麦22”、小
麦品种“AvocetS”、小麦品种“济麦22”的衍生品种或小麦品种“济麦22”与其它小麦品
种的杂交后代。以上任一所述抗条锈病植物可为小麦品种“济麦22”和小麦品种“Avocet
S”的杂交后代。
以上任一所述条锈病具体可为条锈菌小种CYR32引起的条锈病。
所述引物组合、所述试剂盒、所述方法在小麦育种中的应用也属于本发明的保护
范围。
本发明所提供的引物对和分子标记可用于小麦抗条锈病分子育种和抗条锈病基因
的克隆。本发明的专用引物和分子标记将在小麦抗病育种中发挥重要作用。
附图说明
图1为wmc658引物对对抗感亲本、抗感池和F2群体株系的扩增结果。
图2为wsnp_ex_c10555_17235832引物组对抗感亲本、抗感池和F2群体株系的扩
增分型结果。
图3为5个SSR标记和2个SNP标记与该抗病基因的连锁图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验
方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，
均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实
验，结果取平均值。
济麦22(Triticumaestivum)记载于如下参考文献：超高产广适小麦新品种济麦22
产量形成分析，宋健民，核农学报，2010年第24期。济麦22是山东省农业科学院作物
研究所利用自育系935024和935106杂交选育的超高产与抗倒伏、抗病、抗逆和广泛适
应性相结合的小麦新品种，实现了我国小麦高产育种的新突破。先后通过国家、山东
和天津审定，江苏、安徽和河南认定，在山东、河北、河南、江苏、安徽、山西和天
津7省市大面积推广。2006-2011年济麦22累计推广1.17亿亩，新增经济效益88.37亿元。
该品种田间表现抗条锈病，且在抗病鉴定中对多种条锈菌生理小种均表现抗性。
AvocetS(Triticumaestivum)记载于如下参考文献：不同小麦品种抗病性变异观察，
龙玲，贵州农业科学，2009年10期。
小麦品种“铭贤169”，可从国家作物种质资源库获得。
条锈菌小种CYR32记载于如下参考文献：中国小麦条锈菌条中32号的命名及其
特性，万安民，《植物保护学报》2003年第4期。
侵染型分级标准采用6级标准(即IT＝0、0；、1、2、3或4)(Bariana和McIntosh1993)，
详见表1。
表1小麦条锈病苗期侵染型分级标准
侵染型(IT)
症状
0
叶片上不产生任何症状
0；
叶片上产生小型坏死斑，零星分布，不产生夏孢子堆
1
叶片上产生坏死斑，坏死斑上零星的散生很小的夏孢子堆
2
叶片上产生坏死斑，坏死斑上着生较多的很小的夏孢子堆
3
叶片连片褪绿，孢子堆大型且数量多
4
叶片不褪绿，上面着生大量夏孢子堆
注：0-2级为抗病型(R)，3-4为感病型(S)。
检测抗病性的方法如下：将待测小麦种植于9cm×9cm×9cm的塑料钵中，当麦苗长
至一心一叶时，采用扫抹法将条锈菌小种CYR32的孢子均匀接种至小麦叶片(接种方
法：将附着有新鲜孢子的铭贤169小心的移至待测小麦的上方，然后将其叶片上的孢子
均匀的扫抹于每片待测小麦的叶片)，接种后第14天(作为感病对照的铭贤169植株已
充分发病，侵染型IT＝4)时记载待测小麦植株的侵染型。
实施例1、抗条锈病基因的分子标记wmc658和wsnp_ex_c10555_17235832及其专
用引物的获得
用我国条锈菌小种CYR32对小麦材料济麦22(抗病品种)和AvocetS(感病品
种)及其F1和F2代群体进行苗期抗性鉴定，结果如表2所示。
表2济麦22、AvocetS以及F2后代对CYR32的苗期侵染型
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亲本济麦22全部抗病，亲本AvocetS全部感病，F1全部抗病，F2抗感分离符合3：
1(χ2＝0.07，P>0.05)，表明济麦22中含有一个显性抗病基因。从中选用20个典型
抗病株和20个典型感病株分别组成抗病池和感病池。
选用SSR标记，以济麦22、AvocetS、抗病池和感病池的基因组DNA为模板，进
行PCR检测。对SSR标记的PCR扩增产物进行6％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，银染
显色。位于染色体2AL上的5个SSR标记Xcfd50、Xgwm311、Xgwm382、Xwmc658和
Xgdm93在亲本和抗感池之间有多态性。选用SNP芯片IlluminaiSelect90kWheatChip对
抗感池DNA进行扫描，其中位于2AL上的wsnp_Ex_c10555_17235832and
RAC875_c27530_860在抗感池之间有多态性，初步表明这些标记和抗条锈病基因连锁。。
用SSR标记wmc658引物对对抗感亲本、抗感池和F2群体单株进行PCR扩增，PCR
扩增产物的电泳检测结果如图1所示。图1中，M为Marker，Pr为济麦22，Ps为Avocet
S，Br为抗病池，Bs为感病池，R为抗病单株，S为感病单株。用SSR标记wmc658引
物对扩增，出现了2种电泳带型，分别称为带型A1(具有242bp的特异片段)和带型
A2(不具有242bp的特异条带)，济麦22、抗病池和抗病单株可扩增出242bp的特异
DNA片段，AvocetS、感病池和感病单株不能扩增出242bp的特异DNA片段。
用SNP标记wsnp_Ex_c10555_17235832引物组(SNP位点位于2AL末端，为T/C
多态)对抗感亲本、抗感池和F2群体单株进行PCR扩增，然后通过酶标仪使用FAM
VICROM光束扫描和KlusterCaller分型软件对PCR扩增产物进行分型检测，结果见
图2。图2中，A1为济麦22，A2为抗病池，A3-A12、B1-B12、C1-C12均为抗病单
株，D1为AvocetS，D2为抗病池，D3-D12、E1-E12、F1-F10均为感病单株，F11和
F12为阴性对照。济麦22、抗病池和抗病单株均为非CC纯合型(即TT纯合型或TC
杂合型)，AvocetS、感病池和感病单株均为CC纯合型。
用7个引物Xcfd50、Xgwm311、Xgwm382、Xwmc658、Xgdm93、
wsnp_Ex_c10555_17235832和RAC875_c27530_860对F2群体377个单株分别进行扩
增(反应体系和反应条件同上)，用JoinMap4.0进行处理，绘制基因连锁图，如图3
所示，7个标记都与抗病基因连锁，遗传距离从1.0cM到17.3cM。进一步对济麦22
进行遗传分析发现，其2AL染色体上携带一个显性抗条锈病基因，将它命名为YrJ22。
抗条锈病基因YrJ22介于SNP标记wsnp_Ex_c10555_17235832和SSR标记wmc658之
间，与两个标记间的距离分别为7.3cM和1.0cM。
wmc658引物对如下：
上游引物(序列表的序列1)：5'-CTCATCGTCCTCCTCCACTTTG-3'；
下游引物(序列表的序列2)：5'-GCCATCCGTTGACTTGAGGTTA-3'。
wsnp_ex_c10555_17235832引物组如下：
FAM引物(序列表的序列3，上游引物)：
5'-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCAGCCGTTGAAACACTCTTAAAT-3'；FAM引物
的5’末端标记有FAM荧光基团，在激发光485nm,发射光520nm波长下观察读值；
VIC引物(序列表的序列4，上游引物)：
5'-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCAGCCGTTGAAACACTCTTAAAC-3’；VIC引物
的5’末端标记有VIC荧光基团，在激发光528nm,发射光560nm波长下观察读值；
COMMON引物(序列表的序列5，下游引物)：
5'-CAAGCACTTTACAGGTTTCCC-3’；COMMON引物的5’末端标记有ROX荧光基
团，在激发光560nm,发射光610nm波长下观察读值。
实施例2、用wmc658引物对和wsnp_ex_c10555_17235832引物组筛选抗条锈病小麦
一、待测株系的获得
1、以济麦22为母本，以AvocetS为父本，进行杂交，得到F1代种子。
2、F1代种子长成的植株为F1代植株，F1代植株自交获得F2代种子。
3、种植F2代种子，可获得F2代单株，从中随机选取10个单株。
4、步骤3得到的每个单株自交产生株系，10个单株总计产生10个株系，依次命名
为J1株系至J10株系。
二、用wmc658引物对和wsnp_ex_c10555_17235832引物组从待测株系中筛选抗条锈
病小麦
取J1株系至J10株系的植株(F2代单株的自交后代)，取济麦22和AvocetS，
分别作为待测小麦，进行如下检测：
1、提取待测小麦叶片的基因组DNA。
2、以步骤1提取的基因组DNA为模板，采用wmc658引物对进行PCR扩增。
PCR扩增的程序：94℃5min；94℃30s、60℃1min、72℃1min，35个循环；
72℃10min。
3、将步骤2得到的PCR扩增产物进行6％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后银染
显色。结果表明：J1株系、J2株系、J4株系、J5株系、J7株系、J8株系和J9株系均
与济麦22的带型相同，显示具有242bp的特异片段；J3株系、J6株系和J10株系与
AvocetS的带型相同，显示不具有242bp的特异片段。
4、将步骤2得到的PCR扩增产物进行测序验证，与步骤3得到的结果一致。
5、以步骤1提取的基因组DNA为模板，采用wsnp_ex_c10555_17235832引物组
进行PCR扩增。
PCR扩增的程序：94℃15min；94℃20s、61-55℃1min(每个循环降0.6℃)、10
个循环；94℃20s、55℃60s、26个循环。
6、通过酶标仪使用FAMVICROM光束扫描和KlusterCaller分型软件对步骤5
得到的PCR扩增产物进行分型检测。J1株系、J2株系、J4株系、J5株系、J7株系、
J8株系、J9株系和济麦22的均为非CC纯合型，J3株系、J6株系、J10株系和Avocet
S均为CC纯合型。
7、将步骤5得到的PCR扩增产物进行测序验证，结果如下：
CC纯合型的株系的PCR扩增产物的测序结果如序列表的序列6所示。
TT纯合型的株系的PCR扩增产物的测序结果如序列表的序列7所示。
TC杂合型的株系的PCR扩增产物的测序结果如序列表的序列6和序列7所示。
每个株系取10棵植株，结果一致。
三、抗病型鉴定
分别检测步骤二中的各个待测小麦的抗病性，结果见表3。J1株系、J2株系、J4
株系、J5株系、J7株系、J8株系和J9株系为抗病型，J3株系、J6株系和J10株系为
感病型。
表3济麦22、AvocetS以及F3后代对CYR32的苗期侵染型
株系名称
侵染型
济麦22
10株植株均侵染型IT＝0
AvocetS
10株植株均侵染型IT＝4
J1
11株植株均侵染型IT＝0；
J2
5株植株侵染型IT＝2，3株植株均侵染型IT＝0；
J3
13株植株均侵染型IT＝4
J4
8株植株均侵染型IT＝0；
J5
9株植株侵染型IT＝0；，2株植株侵染型IT＝1
J6
5株植株侵染型IT＝3,3株植株侵染型IT＝4
J7
7株植株侵染型IT＝0；，1株植株均侵染型IT＝1
J8
6株植株均侵染型IT＝0；
J9
5株植株均侵染型IT＝0；
J10
6株植株侵染型IT＝3,1株植株侵染型IT＝4
以上结果表明，利用分子标记wmc658和wsnp_ex_c10555_17235832可应用辅助
鉴定和筛选具有抗病型的小麦。
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