说明书过表达BnNRT1-3基因提高油菜氮素利用率
技术领域
本发明属于油菜转基因技术领域，具体涉及过表达BnNRT1-3基因提高油菜氮素利用率。
背景技术
氮素(N)对植物产量和品质的形成起着至关重要的作用。我国是世界农业生产大国，广泛种植有水 稻、玉米、小麦、油菜、棉花等农作物。虽然我国的耕地面积只有全球耕地面积的8％左右，但化肥(氮 肥)使用量却占到了全球的1/3，接近35％。究其原因，主要有以下两个方面：一是我国农作物的氮肥利 用效率低，如水稻、玉米和小麦氮肥平均利用率为28.7％(闫湘等，2008)，油菜氮肥平均表观利用率为 34.6％(邹娟等，2011)，远远低于发达国家的50％以上；二是我国在氮肥使用上存在不合理之处，往往 发达地区用量过剩而贫困地区用量不足，这进一步导致了氮肥的有效利用率下降。氮肥的使用量过多以及 氮素利用率下降导致了农业生态环境的急剧恶化，同时也带来了诸多环境问题，如土壤酸化、水体富营养 化以及臭氧层破坏等。因此，提高氮素利用效率，减少氮肥使用量，不仅有利于农作物产量潜力的发挥， 提高农作物品质，更能促进农业的健康可持续发展。
关于提高植物氮素利用效率，目前的研究往往集中在如何通过优化氮肥管理、合理施用氮肥以及改革 种植制度等措施来实现，但实际操作存在一定的障碍，因为不同的作物对氮肥的需求在量上和时间上均存 在差异，无法形成统一的标准。虽然在氮营养高效种植资源的收集、鉴定与筛选方面有一些报道，如水稻 (童汉华等，2007)、玉米(周联东等，2003)、棉花(韩璐和张薇，2011)中，以期解析氮高效的遗传 基础，但进展缓慢。植物主要是从土壤中获取氮营养元素的，这其中涉及到一系列的N吸收与转运系统。 硝态氮是植物利用氮素的主要形态，硝酸盐转运子在植物的N吸收与转运方面起着重要的作用。
植物硝酸盐转运子包含两个基因家族，其中NRT1/PTR基因家族主要为低亲和转运子，称为低亲和转 运系统(LATS)；NRT2基因家族为高亲和转运子，称为高亲和转运系统(HATS)，在外界硝酸根离子 浓度很低时发挥作用。正常情况下，植物对硝态氮的吸收主要依赖于LATS。目前在拟南芥中研究得比较 清楚的LATS成员主要有AtNRT1.1、AtNRT1.2、AtNRT1.3、AtNRT1.4、AtNRT1.5、AtNRT1.6、AtNRT1.7、 AtNRT1.8和AtNRT1.9(Wang et al.,2012)。其中AtNRT1.1和AtNRT1.2负责N的吸收(Liu et al.,1999； Okamoto et al.,2003)；AtNRT1.4对维持叶片的硝酸根离子稳态有重要作用(Chiu et al.,2004)；AtNRT1.5、 AtNRT1.6、AtNRT1.8和AtNRT1.9与N的转运相关(Lin et al.,2008；Almagro et al.,2008；Li et al.,2010；Wang et al.,2011)；AtNRT1.7负责N的再利用(Fan et al.,2009)。AtNRT1.3是诱导型的N转运子，其功能研 究还不清楚。有研究表明，在豆科模式植物蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)中，MtNRT1.3为双亲和型转 运子，在植物缺氮时上调表达，促进植物对N的吸收(Morère-Le et al.,2011)。另外在小麦中，与AtNRT1.3 同源的基因TaNPF6.6的表达模式和对N的反应亦不同于拟南芥，其在根中表达且对缺氮表现为上调表达 (Buchner and Hawkesford,2014)。由此可见，NRT1.3基因的功能在不同的物种中有所差异，总体来看其 对植物N的吸收与利用具有正向效应。
发明内容
本发明的目的是确定甘蓝型油菜中BnNRT1-3基因在N吸收与利用方面的功能，涉及BnNRT1-3在提 高植物氮素利用效率方面的应用，以培育氮高效的农作物。
为了实现上述目的，本发明通过以下技术方案实现：
本发明首先克隆了甘蓝型油菜中NRT1.3的同源基因，申请人将该基因命名为BnNRT1-3基因，在 CaMV35S启动子控制下在甘蓝型油菜中过量表达BnNRT1-3基因，能提高油菜的氮素利用效率。
所述的硝酸盐转运子BnNRT1-3基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1中第1-1914位碱基所示的 序列所示，其对应的氨基酸序列如SEQ ID NO：1中第1-1914位碱基所示的序列所示，该基因编码的蛋白 质序列如SEQ ID NO：1所示。
该基因调控甘蓝型油菜对氮素利用效率的提高主要表现为增加了植株干物质的量。
利用引物对F46和R46-1(见序列表SEQ ID NO：3，4)，通过RT-PCR技术从甘蓝型油菜中克隆硝 酸盐转运子BnNRT1-3基因，然后利用该基因构建植物过表达载体，进行植物转基因操作，获得转基因植 株。研究结果表明BnNRT1-3过表达植株的氮素利用效率明显高于野生型(WT)。
本发明确定了BnNRT1-3基因在提高植物氮素利用效率方面的作用，为利用转基因的手段培育氮高效 的植物奠定了基础。
附图说明
1、序列表SEQ ID NO：1是本发明克隆的BnNRT1-3基因的核苷酸序列，序列长度为1914bp，其中178-1914 位碱基对应的序列是该基因的CDS区，编码578个氨基酸序列。
2、序列表SEQ ID NO：2是本发明克隆的BnNRT1-3基因编码的蛋白质序列。
3、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4是扩增BnNRT1-3基因的特异引物对，我们将其命名为引物F46和引 物R46-1；其中：BnACT2-F/BnACT2-R为BnActin2内参基因的扩增引物。
图1：本发明的其中一个实施例的过表达植物表达载体pBnNRT1-3的构建。图1中的A图为 pCAMBIA1300载体图；图1中的B图为pCAMBIA1300s载体示意图；图1中的C图为本发明构建的 pBnNRT1-3载体的示意图。
图2：BnNRT1-3过表达转基因株系的表达分析。图中：WT为野生型(非转基因)对照，其余编号对 应不同的转基因株系。编号1表示转基因株系D-1，编号2表示转基因株系D-2，以此类推。图中BnNRT1-3 的扩增引物对为F46/R46-1(引物序列见表1)；BnActin2内参基因的扩增引物对为BnACT2-F/BnACT2-R (引物序列见表1)。
图3：野生型与BnNRT1-3过表达株系在不同浓度硝酸盐生长条件下的干重比较。过表达植株和野生 型植株均在1/4Hoagland营养液中培养两周，之后移入不同硝酸盐浓度的1/2Hoagland营养液中继续培养 生长三周，取地上部分称取干重，实验进行两次重复。其中WT为野生型对照，D-2、D-19和D-25为三 个过表达株系。误差线为标准偏差，*和**分别表示转基因植株同野生型植株t测验在P<0.05和P<0.01水 平下差异显著。
具体实施方式
实施例1 甘蓝型油菜BnNRT1-3基因的克隆
1.克隆甘蓝型油菜BnNRT1-3基因的cDNA序列
根据甘蓝型油菜基因组参考序列(http://www.genoscope.cns.fr/brassicanapus/)获得BnNRT1-3的 基因组序列信息(BnaA05g19580D)。根据基因组序列信息设计引物对F46和R46-1(该引物序列见说明 书表1和序列表SEQ ID NO:3和4)。其中F46为正向引物，含有XbaⅠ酶切接头；R46-1为反向引物， 含有PstⅠ酶切接头。由于甘蓝型油菜角果皮和种子的芯片结果显示BnNRT1-3在角果发育后期的角果皮 中有较强的表达，于是利用TransZol Plant试剂盒(购自北京全式金生物技术有限公司)提取甘蓝型油菜 角果发育42d后的角果皮的RNA(具体操作步骤见试剂盒说明书)。利用RT-PCR的方法，使用高保真的 TransStart FastPfu DNA Polymerase(购自北京全式金生物技术有限公司)扩增BnNRT1-3的cDNA序列。 PCR反应条件为95℃1min；95℃20s，54℃20s，72℃50s，40个循环；72℃5min。将克隆得到的产物连 入pEASY-Blunt载体(购自北京全式金生物技术有限公司)中，构建测序中间载体，命名为pEASY-NRT1.3， 进行序列测定，验证克隆序列的正确性。
2.甘蓝型油菜的BnNRT1-3基因的序列信息和特性分析
甘蓝型油菜BnNRT1-3基因编码区cDNA为1737bp，编码578个氨基酸。克隆得到的SEQ ID NO：1 序列包含了BnNRT1-3基因5’UTR区段的177个碱基。BnNRT1-3蛋白与AtNRT1.3和MtNRT1.3的同源 性分别为89％和70％。通过ProtComp 9.0软件预测BnNRT1-3蛋白定位于细胞膜，这与其功能相一致。
实施例2 BnNRT1-3转基因植株的获得
1.含有BnNRT1-3编码区cDNA表达载体的构建
将实施例1中包含BnNRT1-3基因的pEASY-NRT1.3载体质粒用XbaⅠ和PstⅠ双酶切后，将酶切下 的片段与用相应酶酶切后的pCAMBIA1300s载体质粒的载体部分相连，得到以CaMV 35S启动子驱动 BnNRT1-3过表达的植物表达载体，我们将其命名为pBnNRT1-3载体(如图1中C图所示)。其中 pCAMBIA1300s载体是通过pCAMBIA1300载体(购自YRGene公司，货号：VAC0323)改造而来。首先 将pCAMBIA1300载体(如图1中A图所示)用HandⅢ和EcoRⅠ进行双酶切，切下多克隆位点部分；然 后将含有CaMV 35S、多克隆位点以及poly A三个元件的片段与酶切后的pCAMBIA1300载体质粒的载体 部分相连，得到pCAMBIA1300s载体(如图1中B图所示)。
将构建好的BnNRT1-3过表达的植物表达载体pBnNRT1-3转入农杆菌GV3101电转感受态细胞。具体 步骤如下：取一管50μl GV3101电转感受态细胞置于冰上，溶化后加入0.1μg构建好的pBnNRT1-3载体 质粒并用移液器轻轻吸打混匀；将含有载体质粒的感受态用移液器吸入冰上预冷的电转杯中，使用Gene pulser电转仪(购自Bio-Rad公司)在1800V电压下电击6ms；向电转杯中加入500μl液体LB混匀后将 菌液转到2mL离心管中，28℃摇床中150rpm培养2hrs；取100μl菌液铺固体LB平皿(含庆大霉素25μg/ml 和卡那霉素50μg/ml)，吹干后28℃培养箱中培养2-3天；挑取菌斑进行PCR检测和酶切验证，阳性克隆 进行摇菌分装于-70℃保存或直接用于植物转化。
2.农杆菌介导的植物转化方法
将上述构建的pBnNRT1-3载体转化至农杆菌GV3101后，利用农杆菌介导的下胚轴转化法转化甘蓝型 油菜。具体步骤如下
(1)取避光下生长5d的甘蓝型油菜(华双5号，一个在中国公开推广应用并通过品种审定的油菜新品 种)下胚轴，切成5-7mm长节段。用侵染悬浮液M0将OD＝0.8的农杆菌进行重悬浮后稀释20倍，侵染 甘蓝型油菜的下胚轴15min。
M0配方：MS基本培养基，30.0g/L蔗糖，100.0μM/L乙酰丁香酮(AS)，补充蒸馏水至1L，灭菌 前调培养基的pH至5.85。
(2)将侵染后的甘蓝型油菜下胚轴转入共培养培养基M1中，暗光培养(光照培养16h，试管架黑布遮光 的暗培养8h(简称光暗培养)，光照强度230-300μEm-2s-1)共2d。
M1配方：MS基本培养基(简称MS-本领域通用术语)，30.0g/L蔗糖，18.0g/L甘露醇，1.0mg/L 2,4-D， 0.3mg/L的细胞激动素(KT)，30.0μM/L硫代硫酸银(STS)，300.0mg/L特美汀(Timentin)，8.0g/L琼 脂，补充蒸馏水至1L；灭菌前调培养基的pH至5.85。
(3)将共培养2d的下胚轴外植体转到愈伤诱导培养基M2中诱导愈伤组织，于培养室(光照下培养16h， 暗培养8h，光照强度230-300μEm-2s-1)中培养20d。M2配方：MS，30.0g/L蔗糖，18.0g/L甘露醇，1.0mg/L 2,4-D，0.3mg/L的细胞激动素(KT)，30.0μM/L硫代硫酸银(STS)，300.0mg/L特美汀(Timentin)， 25.0mg/L潮霉素B，8.0g/L琼脂，补充蒸馏水至1L；灭菌前调培养基的pH至5.85。
(4)将步骤(3)中培养20d的愈伤组织转入分化培养基M3中，继续在光照培养室中培养，每20d继代 一次。M3配方：MS，10.0g/L葡萄糖，0.25g/L木糖，0.6g/L吗啉乙磺酸(MES)，2.0mg/L玉米素(ZT)， 0.1mg/L吲哚乙酸(IAA)，300.0mg/L特美汀(Timentin)，25.0mg/L潮霉素B，8.0g/L琼脂，补充蒸馏 水至1L；灭菌前调培养基的pH至5.85；置于光照培养室中培养，光照强度为230-300μEm-2s-1；
(5)将步骤(4)中再生出的植株移入生根培养基M4中生根培养。M4配方：MS，30.0g/L蔗糖，8.0g/L 琼脂，补充蒸馏水至1L，灭菌前调培养基的pH至5.85。置于光照培养室中培养，光照强度为230-300 μEm-2s-1；
3.转基因植株的分子鉴定
对获得的转基因株系进行基因表达水平的检测。采用TransZol Up试剂(购自北京全式金生物技术有 限公司)提取转基因甘蓝型油菜植株和野生型甘蓝型油菜植株的苔茎叶RNA，提取程序按照该试剂的说明 书进行。将RNA溶于50μL RNA溶解液，取3μL使用TransScript One-Step gDNA Remover and cDNA Synthesis Kit(购自北京全式金生物技术有限公司)进行反转，合成第一链cDNA(具体方法参照该试剂盒 的说明书进行)。以BnACT2-F/BnACT2-R作为内标基因BnActin2引物(引物序列见表1)，F46/R46-1 (引物序列见表1)作为外源基因BnNRT1-3特异性引物进行表达检测。其中BnActin2基因的PCR反应 条件为94℃3min；94℃30s，58℃30s，72℃30s，26个循环；72℃5min；BnNRT1-3基因的PCR反应条 件为94℃3min；94℃30s，56℃30s，72℃2min，30个循环；72℃10min。结果显示，野生型对照WT(非 转基因植株)中未检测到BnNRT1-3基因的表达，不同的转基因株系中BnNRT1-3基因的表达量存在差异。 其中转基因株系D-3、D-4、D-20、D-21、D-22和D-26中外源基因BnNRT1-3基本无表达，而转基因株系 D-2、D-9、D-11、D-14、D-19、D-23、D-25和D-27中外源基因BnNRT1-3表达量较高(见图2)。故选 择三个表达量较高的株系如D-2、D-19和D-25进行后续的工作。
表1本发明中甘蓝型油菜基因表达检测引物序列表
实施例3 BnNRT1-3过表达植株与野生型植株氮素利用效率的比较
选取萌发一周生长一致的过表达转基因甘蓝型油菜植株和野生型甘蓝型油菜植株幼苗，置于1/4改 良的Hoagland营养液(本领域常用培养液，文献：Hoagland and Arnon,1950)中培养两周(改良的Hoagland 完全培养液配方见说明书表2)，之后转入含不同浓度硝酸盐(例如0.3mM、3mM和7.5mM)的1/2Hoagland 营养液中继续培养三周，期间4-5d换一次新鲜的Hoagland营养液。其中培养液中硝酸盐浓度的控制是通 过调节培养液中四水硝酸钙和硝酸钾的含量来实现的，考虑到伴随的钙离子和钾离子的流失，会补充相应 量的钙离子和钾离子，分别以硫酸钙和硫酸钾的形式进行补充。培养完毕后，取植株地上部分于70℃烘箱 中烘干，称取干重，比较野生型植株和过表达植株的地上部分干重差异。结果显示当营养液中硝酸盐浓度 从3mM提高到7.5mM时，虽然过表达植株和野生型植株的地上部分干重均无显著变化，但总体来看3mM 条件下过表达植株的地上部分干重大于7.5mM条件下的过表达植株的地上部分干重。而在3mM条件下， 过表达植株的干重显著高于野生型植株(见图3)。由此可见，在较低浓度的硝酸盐条件下，过表达植株 的氮素利用效率更高，且其有优于高氮水平(7.5mM)条件下的生长优势，这进一步说明了BnNRT1-3基 因在培育氮高效甘蓝型油菜方面的应用价值。
表2改良的Hoagland营养液配方
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