马尾松优良单株无菌外植体制备及初始芽诱导方法.pdf

本发明公开了一种马尾松优良单株无菌外植体制备及初始芽诱导方法，选用成年优株当年新抽嫩稍的萌芽条为接穗，以马尾松组培苗为砧木进行嫁接，萌芽条采用系列消毒剂配合消毒的方式进行消毒处理，将外植体接穗置于经优化的诱导培养基中进行初始芽诱导，获得无菌外植体及生长快、活力旺盛的马尾松初始芽。本发明解决了马尾松成年优株组织培养中外植体消毒困难、褐化、初始芽发生率低、芽苗活性差等的技术问题，提高了初始芽发生率和芽苗活性，可获得90%以上无菌的健壮外植体，具有较好的经济效益和社会效益。

权利要求书1.  一种马尾松优良单株无菌外植体制备及初始芽诱导方法，其特征在于：包括外植体准备、外植体消毒处理、初始芽诱导，获得无菌外植体及生长快、活力旺盛的马尾松初始芽，其操作步骤如下：（1）外植体准备：采用半年生的马尾松组培苗为砧木,选择成年优良的马尾松母树当年新抽嫩梢作为接穗，用常规方法进行嫁接，成活后剪掉嫁接苗主梢促芽生长，选取3.0-5.0 cm长萌芽条为外植体；（2）外植体消毒处理：将外植体用无菌水冲洗干净后，置于体积浓度为0.1-0.3 %的广谱杀菌剂中浸泡0.5-1 h，取出外植体将其置于体积浓度为70 %酒精中浸泡1-2 min，再移入体积浓度为5-8 %的次氯酸钠溶液中浸泡10-20 min，取出放于体积浓度为10-25 %的双氧水和5-10滴吐温的混合液中搅拌浸泡20-30 min后，最后用无菌水洗3-4次，每次冲洗3-5 min；（3）初始芽诱导：将消毒处理后的外植体切成1.0 cm长后，接种于诱导培养基中；所述的诱导培养基为：改良MS培养基 + 噻苯隆（TDZ）0.5-2.0 mg·L-1 + Meta-Topolin（MT） 1.0-3.0 mg·L-1 + KT 1.0-3.0 mg·L-1 + 葡萄糖30000 mg·L-1 + 琼脂3500 mg·L-1 + 0.1-0.3 %广谱杀菌剂；初始芽诱导培养周期为：2-3个月，温度：20±1℃，光照培养时间为：16 h，光照强度为：≤500 lx，获得生长健壮、活力旺盛的马尾松初始芽。2.  根据权利要求1所述的马尾松优良单株无菌外植体制备及初始芽诱导方法，其特征在于：所述的改良MS培养基的组成为：KNO3 1650 mg·L-1；NH4NO3 600 mg·L-1；CaCl2·2H2O 260 mg·L-1；MgSO4·7H2O 370 mg·L-1；Ca(NO3)2·4H2O 400 mg·L-1；KH2PO4 170 mg·L-1；MnSO4·H2O 22.3 mg·L-1；ZnSO4·7H2O 8.6 mg·L-1；CuSO4·5H2O 0.025 mg·L-1；H3BO3  6.2 mg·L-1；Na2MoO4·2H2O 0.025 mg·L-1；KI 0.83 mg·L-1；CoCl2·6H2O 0.025 mg·L-1；维生素B1 1.0 mg·L-1；维生素B6 0.5 mg·L-1；烟酸 0.5 mg·L-1；甘氨酸 2.0 mg·L-1；肌醇 200 mg·L-1。3.  根据权利要求1所述的马尾松优良单株无菌外植体制备及初始芽诱导方法，其特征在于：步骤（1）所述的外植体准备过程中，接穗从成年优良马尾松母树剪下后，用湿毛巾包好后放入装有冰袋的保温箱中带回置于4℃冰箱冷藏，在24 h内完成嫁接。4.  根据权利要求1所述的马尾松优良单株无菌外植体制备及初始芽诱导方法，其特征在于：步骤（1）所述的外植体准备过程中，嫁接成活后，打掉嫁接苗主梢促芽生长，待萌芽条达到3.0-5.0 cm长时，用常规方法喷施体积浓度0.1 %多菌灵，1-2日后于晴好天气采下活力旺盛萌芽条作为外植体备用。

说明书马尾松优良单株无菌外植体制备及初始芽诱导方法
技术领域
本发明属植物繁殖技术领域，涉及组织培养育苗技术，尤其是一种马尾松优良单株无菌外植体制备及初始芽诱导方法。
背景技术
马尾松（Pinus massoniana Lamb.）属松科（Pinaceae）松亚科（Pinoideae）松属（Pinus L.）双维管束松亚属（Subgen Pinus）植物，系我国亚热带地区特有乡土造林脂材两用树种。作为一种综合利用价值高、推广前景广阔的树种，马尾松不仅可用来生产三板、造纸及化纤工业制造，还可用来生产松香、松节油等工业原料。近年来，随着人们日益增长的生活需求与木材资源短缺和石油等不可再生资源逐渐枯竭等矛盾的激化，生态、经济和社会的可持续发展越来越受到社会关注。基于我国生态安生、资源安全与社会安全等问题，马尾松作为我国主要的工业用材树种和生物质能源树种，大力发展马尾松人工林很有必要。
广西在马尾松种质资源收集、选育及保存方法，在全国属于先列。自“六五”国家科技攻关以来，选育了大量马尾松优良无性系。现代林业发展讲究速生丰产、优质高效，欲达到预期目标，最有效的途径是实现优良无性系苗木造林。植物组培技术的使用，是实现马尾松无性系产业化的有效途径。
马尾松属组织培养困难的树种，尤其是以成年母株 茎段芽为外植体进行组培培养时，由于松脂含量高，外植体消毒困难，而在初始芽诱导培养中，易褐化、初始芽发生率低、芽苗不伸长、活性差等瓶颈问题，严重限制了马尾松优良无性系的推广与应用。
发明内容
本发明针对现有马尾松成年优株组织培养中外植体消毒困难、褐化、初始芽发生率低、芽苗活性差等的技术问题，提供一种马尾松优良单株无菌外植体制备及初始芽诱导的方法。
为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：
一种马尾松优良单株无菌外植体制备及初始芽诱导方法，包括外植体准备、外植体消毒处理、初始芽诱导，获得无菌外植体及生长快、活力旺盛的马尾松初始芽，其操作步骤如下：
（1）外植体准备：
采用半年生的马尾松组培苗为砧木,选择成年优良的马尾松母树当年新抽嫩梢作为接穗，用常规方法进行嫁接，成活后剪掉嫁接苗主梢促芽生长，选取3.0-5.0 cm长萌芽条为外植体；
（2）外植体消毒处理：
将外植体用无菌水冲洗干净后，置于体积浓度为0.1-0.3 %的广谱杀菌剂中浸泡0.5-1 h，取出外植体将其置于体积浓度为70 %酒精中浸泡1-2 min，再移入体积浓度为5-8 %的次氯酸钠溶液中浸泡10-20 min，取出放于体积浓度为10-25 %的双氧水和5-10滴吐温的混合液中搅拌浸泡20-30 min后，最后用无菌水洗3-4次，每次冲洗3-5  min；
（3）初始芽诱导：将消毒处理后的外植体切成1.0 cm长后，接种于诱导培养基中；所述的诱导培养基为：改良MS培养基 + 噻苯隆（TDZ）0.5-2.0 mg·L-1 + Meta-Topolin（MT） 1.0-3.0 mg·L-1 + KT 1.0-3.0 mg·L-1 + 葡萄糖30000 mg·L-1 + 琼脂3500 mg·L-1 + 0.1-0.3 %广谱杀菌剂；初始芽诱导培养周期为：2-3个月，温度：20±1℃，光照培养时间为：16 h，光照强度为：≤500 lx，获得生长健壮、活力旺盛的马尾松初始芽。
以上所述的改良MS培养基的组成为：KNO3 1650 mg·L-1；NH4NO3 600 mg·L-1；CaCl2·2H2O 260 mg·L-1；MgSO4·7H2O 370 mg·L-1；Ca(NO3)2·4H2O 400 mg·L-1；KH2PO4 170 mg·L-1；MnSO4·H2O 22.3 mg·L-1；ZnSO4·7H2O 8.6 mg·L-1；CuSO4·5H2O 0.025 mg·L-1；H3BO3  6.2 mg·L-1；Na2MoO4·2H2O 0.025 mg·L-1；KI 0.83 mg·L-1；CoCl2·6H2O 0.025 mg·L-1；维生素B1 1.0 mg·L-1；维生素B6 0.5 mg·L-1；烟酸 0.5 mg·L-1；甘氨酸 2.0 mg·L-1；肌醇 200 mg·L-1。
以上步骤（1）所述的外植体准备过程中，接穗从成年优良马尾松母树剪下后，用湿毛巾包好后放入装有冰袋的保温箱中带回置于4℃冰箱冷藏，在24 h内完成嫁接。
以上步骤（1）所述的外植体准备过程中，嫁接成活后，打掉嫁接苗主梢促芽生长，待萌芽条达到3.0-5.0 cm长时，用常规方法喷施体积浓度0.1 %多菌灵，1-2日后于晴好天气采下活力旺盛萌芽条作为外植体备用。
对比于现有技术，本发明的优点及积极效果如下：
1、本发明选用的外植体是以马尾松组培苗为砧木，成年优株当年新抽嫩稍为接穗进行的本砧嫁接，由于马尾松组培苗相较一般的实生苗，根系发达、枝叶繁茂、茎杆粗壮、营养生长旺盛，嫁接伤口愈合快、亲和性好、成活率高，去掉嫁接成活苗的主稍后，芽苗萌发率高、生长快，用于外植体的萌芽条幼态化程度高，极大地提高了外植体的有效性。
2、本发明依次采用一定的浓度及消毒时间的广谱抗菌剂、酒精、次氯酸钠、双氧水和吐温相配合的消毒处理的方式，无菌外植体获取率高，达到90%以上。
3、本发明使用优化诱导培养基及培养方式，外植体褐化少，初始芽发生率高，芽苗伸长快、活力旺盛，具有较好的经济效益和社会效益。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进一步说明。
实施例1：
一种马尾松优良单株无菌外植体制备及初始芽诱导方法，采用半年生马尾松组培苗为砧木，选择来自广西国营派阳山林场优良林分中成年马尾松优株GL38当年新抽嫩梢作为接穗。接穗从成年优良马尾松母树剪下后，用湿毛巾包好后放入装有冰袋的保温箱中带回置于4℃冰箱冷藏，在24 h内用常规方法进行嫁接。嫁接成活后，打掉嫁接苗主梢促芽生长，待萌芽条达到3.0-5.0 cm长时，用常规方法喷施体积浓度0.1 %多菌灵，1-2日后于晴好天气采下活力旺盛，长为3.0-5.0 cm的长萌芽条作为外植体备用。
将外植体用无菌水冲洗干净后，置于体积浓度为0.1 %的多菌灵溶液中浸泡1 h，取出外植体将其置于体积浓度为70 %酒精中浸泡1 min，再移入体积浓度为5 %的次氯酸钠溶液中浸泡20 min，取出放于体积浓度为10 %的双氧水和5滴吐温的混合液中搅拌浸泡30 min后，最后用无菌水洗3次，每次冲洗3 min。
将消毒处理后的外植体切成1.0 cm长后，接种于诱导培养基中；所述的诱导培养基为：改良MS培养基 + 噻苯隆（TDZ）0.5 mg·L-1 + Meta-Topolin（MT） 1.0 mg·L-1 + KT 1.0 mg·L-1 + 葡萄糖30000 mg·L-1 + 琼脂3500 mg·L-1 + 0.1 %多菌灵。所述的改良MS培养基的组成为：KNO3 1650 mg·L-1；NH4NO3 600 mg·L-1；CaCl2·2H2O 260 mg·L-1；MgSO4·7H2O 370 mg·L-1；Ca(NO3)2·4H2O 400 mg·L-1；KH2PO4 170 mg·L-1；MnSO4·H2O 22.3 mg·L-1；ZnSO4·7H2O 8.6 mg·L-1；CuSO4·5H2O 0.025 mg·L-1；H3BO3  6.2 mg·L-1；Na2MoO4·2H2O 0.025 mg·L-1；KI 0.83 mg·L-1；CoCl2·6H2O 0.025 mg·L-1；维生素B1 1.0 mg·L-1；维生素B6 0.5 mg·L-1；烟酸 0.5 mg·L-1；甘氨酸 2.0 mg·L-1；肌醇 200 mg·L-1。
初始芽诱导培养周期为：90 d，温度：20±1℃，光照培养时间为：16 h，光照强度为：400 lx，获得生长健壮、活力旺盛的马尾松初始芽，初始芽得芽率为90.8%。
实施例2：
一种马尾松优良单株无菌外植体制备及初始芽诱导方法，采用半年生马尾松组培苗为砧木，选择来自广西国营派阳山林场优良林分中成年马尾松优株GL38当年新抽嫩梢作为接穗。接穗从成年优良马尾松母树剪下后，用湿毛巾包好后放入装有冰袋的保温箱中带回置于4℃冰箱冷藏，在24 h内用常规方法进行嫁接。嫁接成活后，打掉嫁接苗主梢促芽生长，待萌芽条达到3.0-5.0 cm长时，用常规方法喷施体积浓度0.1 %多菌灵溶液，1-2日后于晴好天气采下活力旺盛，长为3.0-5.0 cm的长萌芽条作为外植体备用。
将外植体用无菌水冲洗干净后，置于体积浓度为0.3 %的多菌灵溶液中中浸泡0.5 h，取出外植体将其置于体积浓度为70 %酒精中浸泡1 min，再移入体积浓度为6 %的次氯酸钠溶液中浸泡15 min，取出放于体积浓度为15 %的双氧水和10滴吐温的混合液中搅拌浸泡30 min后，最后用无菌水洗4次，每次冲洗3min。
将消毒处理后的外植体切成1.0 cm长后，接种于诱导培养基中；所述的诱导培养基为：改良MS培养基 + 噻苯隆（TDZ）1.0 mg·L-1 + Meta-Topolin（MT） 2.0 mg·L-1 + KT 1.5 mg·L-1 + 葡萄糖30000 mg·L-1 + 琼脂3500 mg·L-1 + 0.3 %多菌灵。所述的改良MS培养基的组成为：KNO3 1650 mg·L-1；NH4NO3 600 mg·L-1；CaCl2·2H2O 260 mg·L-1；MgSO4·7H2O 370 mg·L-1；Ca(NO3)2·4H2O 400 mg·L-1；KH2PO4 170 mg·L-1；MnSO4·H2O 22.3 mg·L-1；ZnSO4·7H2O 8.6 mg·L-1；CuSO4·5H2O 0.025 mg·L-1；H3BO3  6.2 mg·L-1；Na2MoO4·2H2O 0.025 mg·L-1；KI 0.83 mg·L-1；CoCl2·6H2O 0.025 mg·L-1；维生素B1 1.0 mg·L-1；维生素B6 0.5 mg·L-1；烟酸 0.5 mg·L-1；甘氨酸 2.0 mg·L-1；肌醇 200 mg·L-1。
初始芽诱导培养周期为：65 d，温度：20±1℃，光照培养时间为：16 h，光照强度为：≤500 lx。获得生长健壮、活力旺盛的马尾松初始芽，初始芽得芽率为91.5%。
实施例3：
一种马尾松优良单株无菌外植体制备及初始芽诱导方法，采用半年生马尾松组培苗为砧木，选择来自广西国营派阳山林场优良林分中成年马尾松优株GL105当年新抽嫩梢作为接穗。接穗从成年优良马尾松母树剪下后，用湿毛巾包好后放入装有冰袋的保温箱中带回置于4℃冰箱冷藏，在24 h内用常规方法进行嫁接。嫁接成活后，打掉嫁接苗主梢促芽生长，待萌芽条达到3.0-5.0 cm长时，用常规方法喷施体积浓度0.1 %甲基托布津溶液，1-2日后于晴好天气采下活力旺盛，长为3.0-5.0 cm的长萌芽条作为外植体备用。
将外植体用无菌水冲洗干净后，置于体积浓度为0.2 %的甲基托布津溶液中浸泡1 h，取出外植体将其置于体积浓度为70 %酒精中浸泡2 min，再移入体积浓度为8 %的次氯酸钠溶液中浸泡15 min，取出放于体积浓度为20 %的双氧水和8滴吐温的混合液中搅拌浸泡25 min后，最后用无菌水洗4次，每次冲洗5min。
将消毒处理后的外植体切成1.0 cm长后，接种于诱导培养基中；所述的诱导培养基为：改良MS培养基 + 噻苯隆（TDZ）1.5 mg·L-1 + Meta-Topolin（MT） 2.5 mg·L-1 + KT 2.0 mg·L-1 + 葡萄糖30000 mg·L-1 + 琼脂3500 mg·L-1 + 0.2 %甲基托布津。所述的改良MS培养基的组成为：KNO3 1650 mg·L-1；NH4NO3 600 mg·L-1；CaCl2·2H2O 260 mg·L-1；MgSO4·7H2O 370 mg·L-1；Ca(NO3)2·4H2O 400 mg·L-1；KH2PO4 170 mg·L-1；MnSO4·H2O 22.3 mg·L-1；ZnSO4·7H2O 8.6 mg·L-1；CuSO4·5H2O 0.025 mg·L-1；H3BO3  6.2 mg·L-1；Na2MoO4·2H2O 0.025 mg·L-1；KI 0.83 mg·L-1；CoCl2·6H2O 0.025 mg·L-1；维生素B1 1.0 mg·L-1；维生素B6 0.5 mg·L-1；烟酸 0.5 mg·L-1；甘氨酸 2.0 mg·L-1；肌醇 200 mg·L-1。
初始芽诱导培养周期为：84 d，温度：20±1℃，光照培养时间为：16 h，光照强度为：400 lx，获得生长健壮、活力旺盛的马尾松初始芽，初始芽得芽率为90.3%。
实施例4：
一种马尾松优良单株无菌外植体制备及初始芽诱导方法，采用半年生马尾松组培苗为砧木，选择来自广西国营派阳山林场优良林分中成年马尾松优株GL68当年新抽嫩梢作为接穗。接穗从成年优良马尾松母树剪下后，用湿毛巾包好后放入装有冰袋的保温箱中带回置于4℃冰箱冷藏，在24 h内用常规方法进行嫁接。嫁接成活后，打掉嫁接苗主梢促芽生长，待萌芽条达到3.0-5.0 cm长时，用常规方法喷施体积浓度0.1 %苯菌灵溶液，1-2日后于晴好天气采下活力旺盛，长为3.0-5.0 cm的长萌芽条作为外植体备用。
将外植体用无菌水冲洗干净后，置于体积浓度为0.3 %的苯菌灵溶液中浸泡0.5 h，取出外植体将其置于体积浓度为70 %酒精中浸泡2 min，再移入体积浓度为8 %的次氯酸钠溶液中浸泡10 min，取出放于体积浓度为25%的双氧水和10滴吐温的混合液中搅拌浸泡20 min后，最后用无菌水洗4次，每次冲洗5min。
将消毒处理后的外植体切成1.0 cm长后，接种于诱导培养基中；所述的诱导培养基为：改良MS培养基 + 噻苯隆（TDZ）2.0 mg·L-1 + Meta-Topolin（MT）3.0 mg·L-1 + KT 3.0 mg·L-1 + 葡萄糖30000 mg·L-1 + 琼脂3500 mg·L-1 + 0.2 %苯菌灵。所述的改良MS培养基的组成为：KNO3 1650 mg·L-1；NH4NO3 600 mg·L-1；CaCl2·2H2O 260 mg·L-1；MgSO4·7H2O 370 mg·L-1；Ca(NO3)2·4H2O 400 mg·L-1；KH2PO4 170 mg·L-1；MnSO4·H2O 22.3 mg·L-1；ZnSO4·7H2O 8.6 mg·L-1；CuSO4·5H2O 0.025 mg·L-1；H3BO3  6.2 mg·L-1；Na2MoO4·2H2O 0.025 mg·L-1；KI 0.83 mg·L-1；CoCl2·6H2O 0.025 mg·L-1；维生素B1 1.0 mg·L-1；维生素B6 0.5 mg·L-1；烟酸 0.5 mg·L-1；甘氨酸 2.0 mg·L-1；肌醇 200 mg·L-1。
初始芽诱导培养周期为：60 d，温度：20±1℃，光照培养时间为：16 h，光照强度为：400 lx，获得生长健壮、活力旺盛的马尾松初始芽，初始芽得芽率为94.5%。