五月瓜藤种苗的培养方法.pdf

本发明属于植物细胞工程技术领域，五月瓜藤种苗的培养步骤依次包括预处理、无菌外植体获得、愈伤组织诱导、丛生芽诱导增殖、生根培养及移栽；采用本发明生产五月瓜藤种苗的技术方案，其产生的有益效果是：（1）增殖率高，生物产量大，培养周期短；（2）组培苗质量好，种苗健壮，栽培成活率高；本发明利用通过预处理、无菌外植体获得、愈伤组织诱导、丛生芽诱导增殖和生根培养及移栽的方法对五月瓜藤种苗进行培育相对于其它培养方式具有扩繁效率高、培养时间短、转接方便；种苗健壮、栽培成活率高及成本低，适合五月瓜藤种苗规模化培育生产。

权利要求书1.  一种五月瓜藤种苗的培养方法，培养步骤依次包括预处理、无菌外植体获得、愈伤组织诱导培养、丛生芽诱导增殖、生根培养及移栽；其特征在于，具体包括以下步骤：（1）预处理：不同的外植体的类型采用不同的浸泡预处理及冷藏预处理；（2）无菌外植体获得：对外植体进行消毒灭菌处理获得无菌外植体用于下一步培养；（3）愈伤组织诱导培养：将步骤（2）中获得的无菌外植体接种至液体浅层愈伤诱导培养基上进行愈伤组织的诱导培养得到状态良好的愈伤组织；（4）丛生芽诱导增殖：将步骤（3）中获得的良好的愈伤组织接种到固液双层丛生芽培养基上进行丛生芽增殖培养；（5）生根培养及移栽：将步骤（4）中获得的丛生芽浸泡处理后接种到固体生根培养基上进行生根培养，然后将得到的生根苗炼苗后栽培到基质中进行生长得到五月瓜藤种苗。2.  根据权利要求1所述的五月瓜藤种苗的培养方法，其特征在于，所述的步骤（1）中的所述外植体为叶片或叶柄或幼嫩枝条。3.  根据权利要求2所述的五月瓜藤种苗的培养方法，其特征在于，所述的步骤（1）中，所述外植体预处理的方法为：将所述外植体离体后立即置于添加1~5g/L PVP+1~3g/L Vc的水溶液中进行浸泡处理3~5h，后置于2~8℃条件下保湿冷藏5~10 d。4.  根据权利要求2所述的五月瓜藤种苗的培养方法，其特征在于，所述的步骤（2）中，灭菌处理的方式为：将预处理完后的外植体采用75%酒精消毒20~40s后采用升汞灭菌5~10min，然后无菌水冲洗备用。5.  根据权利要求3所述的五月瓜藤种苗的培养方法，其特征在于，所述的步骤（3）中所述培养基的配方为WPM或Ms+1.0~4.0mg/L 2,4-D+0.05~0.5mg/L NAA+0.1~1.5g/L PVP+30 g/L蔗糖，pH5.6~6.0；培养条件为：光照0 h/d，温度25±1℃；所述液体浅层厚度为0.5~3cm。6.  根据权利要求4所述的五月瓜藤种苗的培养方法，其特征在于，所述的步骤（4）中所述固液双层丛生芽培养基中的液体培养基的配方为WPM或Ms+1.0~4.0 mg/L 6-BA+0.02~0.5mg/L NAA+2.0mg/L KT+0.1~1.5g/L PVP +30 g/L蔗糖，pH5.6~6.0，厚度为0.2~1cm；所述固液双层丛生芽培养基下层添加6.5g/L琼脂的固体培养基，从而形成固液双层培养基；培养条件为：光照强度1500-2000 lux，光照10~15 h/d，温度25±1℃。7.  根据权利要求6所述的五月瓜藤种苗的培养方法，其特征在于，所述的步骤（5）中生根培养及移栽中，首先将丛生芽放入到添加1~5g/L PVP+1~3g/L Vc的水溶液中浸泡1~2h，后接种到固体生根培养基中进行生根培养，所述生根培养基的配方为1/2Ms+1.0~2.0 mg/L IBA+0.01~0.1 mg/L NAA+40 g/L蔗糖，pH5.6~6.0；培养条件为：光照强度1500-2000 lux，光照10~15 h/d，温度25±1℃。8.  根据权利要求7所述的五月瓜藤种苗的培养方法，其特征在于，所述的步骤（5）中获得的生根苗炼苗后栽种到泥：珍珠岩=2~5:1的基质中，保持适度遮阴和70%~80%的湿度进行栽培即培养条件为：光照强度1500-2000 lux，光照10~15 h/d，温度20±1℃，从而得到五月瓜藤种苗。

说明书五月瓜藤种苗的培养方法
技术领域
    本发明属于植物细胞工程技术领域，具体涉及一种利用植物组织培养方式综合处理进行五月瓜藤培养快繁以获得大量种苗的方法。
背景技术
五月瓜藤（Holboellia fargesii Reaub.）为木通科（Lardizabalaceae）八月瓜属（Holboellia）植物，产于云南、贵州、四川、湖北、湖南、陕西、安徽、广西、广东和福建。野生分布于海拔500-3000米的山坡杂木林及沟谷林中。五月瓜藤为常绿木质藤本植物，花雌雄同株，红色紫红色暗紫色绿白色或淡黄色，数朵组成伞房式的短总状花序，具有较高观赏价值，可作为垂直绿化材料进行栽培；其花期4-5月，果期7-8月，果实表皮紫色，长圆形，长5-9厘米，果肉甘甜，可作为水果种植；另外其种子含油40％，可榨油，作为油料作物；此外其根药用，治劳伤咳嗽，果治肾虚腰痛、疝气等。由此可见五月瓜藤具有很高的应用价值，具有极大的开发潜力。
由于生态环境的破坏和掠夺式的采摘挖掘，五月瓜藤的资源日趋缩小，严重影响了其有序的开发利用，因此需要对其进行种苗繁殖技术的开发。
利用植物组织培养的方式进行五月瓜藤种苗的培养快繁是一种较好的规模化获得五月瓜藤种苗的方法，且该方法未见报道和公开应用。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种生长周期短、移栽存活率高、成本低、操作简单的五月瓜藤种苗的培养方法。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：培养步骤依次包括预处理、无菌外植体获得、愈伤组织诱导培养、丛生芽诱导增殖和生根培养及移栽；具体包括以下步骤：
（1）预处理：不同的外植体的类型采用不同的浸泡预处理及冷藏预处理；
（2）无菌外植体获得：对外植体进行消毒灭菌处理获得无菌外植体用于下一步培养；
（3）愈伤组织诱导培养：将步骤（2）中获得的无菌外植体接种至液体浅层愈伤诱导培养基上进行愈伤组织的诱导培养得到状态良好的愈伤组织；
（4）丛生芽诱导增殖：将步骤（3）中获得的良好的愈伤组织接种到固液双层丛生芽培养基上进行丛生芽增殖培养；
（5）生根培养及移栽：将步骤（4）中获得的丛生芽浸泡处理后接种到固体生根培养基上进行生根培养，然后将得到的生根苗炼苗后栽培到基质中进行生长得到五月瓜藤种苗。
采用上述技术方案，通过大量实验证实，该五月瓜藤种苗的培养方法能够实现增殖率高，生物产量大，培养周期短；组培苗质量好，种苗健壮，栽培成活率高。
作为本发明进一步的改进在于，所述的步骤（1）中的所述外植体为叶片或叶柄或幼嫩枝条。。本发明使用的外植体是叶片或叶柄或幼嫩枝条，可以通过多种外植体实现对五月瓜藤种苗的培养，既方便外植体的获得，又节省了材料避免了浪费。
作为本发明进一步的改进在于，所述的步骤（1）中，当所选外植体为叶片或叶柄或幼嫩枝条时，所述预处理的方法是：将所述外植体离体后立即置于添加1~5g/L PVP+1~3g/L Vc的水溶液中进行浸泡处理3~5h，后置于2~8℃条件下保湿冷藏5~10 d。对外植体进行预处理，所采用的预处理方法适合各个外植体的后续培养，且该预处理过程有利于后续的培养，缩短培养周期。
作为本发明进一步的改进在于，所述的步骤（2）中，当所选外植体为叶片或叶柄或幼嫩枝条时，灭菌处理的方式为：将预处理完后的外植体采用75%酒精消毒20~40s后采用升汞灭菌5~10min，然后无菌水冲洗备用。无菌的处理对后续的培养过程是非常关键的，直接影响后续培养的诱导率、增殖率以及生根率，通过大量实验验证，该灭菌方法对后续的培养最好。
作为本发明进一步的改进在于，所述的步骤（3）中所述愈伤组织的诱导培养基的配方为WPM或Ms+1.0~4.0mg/L 2,4-D+0.05~0.5mg/L NAA+0.1~1.5g/L PVP+30 g/L蔗糖，pH5.6~6.0；培养条件为：光照0 h/d，温度25±1℃；所述液体浅层厚度为0.5~3cm。愈伤组织的诱导培养基的组成直接关系到愈伤组织的诱导率以及愈伤组织的质量高低，为了提高五月瓜藤外植体的愈伤组织的诱导率，本发明对五月瓜藤外植体的愈伤组织的诱导培养基进行了优化，通过大量的筛选试验最终确定，采用上述的愈伤组织诱导培养基进行五月瓜藤外植体的愈伤组织诱导培养，愈伤组织的诱导效果最好。
作为本发明进一步的改进在于，所述的步骤（4）中所述固液双层丛生芽培养基中的液体培养基的配方为WPM或Ms+1.0~4.0 mg/L 6-BA+0.02~0.5mg/L NAA+2.0mg/L KT+0.1~1.5g/L PVP +30 g/L蔗糖，pH5.6~6.0，厚度为0.2~1cm；所述固液双层丛生芽培养基的下层添加6.5g/L琼脂的固体培养基，从而形成固液双层培养基；培养条件为：光照强度1500-2000 lux，光照10~15 h/d，温度25±1℃。通过大量的筛选试验证实，采用固液双层丛生芽培养基可以明显提高丛生芽的增殖率且减少其褐化率。
作为本发明进一步的改进在于，所述的步骤（5）中生根培养及移栽中，首先将丛生芽放入到添加1~5g/L PVP+1~3g/L Vc的水溶液中浸泡1~2h，后接种到固体生根培养基中进行生根培养，所述生根培养基的配方为1/2Ms+1.0~2.0 mg/L IBA+0.01~0.1 mg/L NAA+40 g/L蔗糖，pH5.6~6.0；培养条件为：光照强度1500-2000 lux，光照10~15 h/d，温度25±1℃。
作为本发明进一步的改进在于，所述的步骤（5）中获得的生根苗炼苗后栽种到泥：珍珠岩=2~5:1的基质中，保持适度遮阴和70%~80%的湿度进行栽培即培养条件为：光照强度1500-2000 lux，光照10~15 h/d，温度20±1℃，从而得到五月瓜藤种苗。
采用本发明生产五月瓜藤种苗的技术方案，其产生的有益效果是：（1）增殖率高，生物产量大，培养周期短；（2）组培苗质量好，种苗健壮，栽培成活率高；本发明利用通过预处理、无菌外植体获得、愈伤组织诱导培养、丛生芽诱导增殖和生根培养及移栽的方法对五月瓜藤种苗进行培育相对于其它培养方式具有扩繁效率高、培养时间短、转接方便；种苗健壮、栽培成活率高及成本低，适合五月瓜藤种苗规模化培育生产。
具体实施方式
实施例1
一种以茎段为外植体利用植物组织培养方式综合处理进行五月瓜藤培养快繁以获得大量种苗的方法具体步骤如下：
（1）预处理：预处理方法为将茎段离体后立即置于添加4 g/L PVP+1.5g/L Vc的水溶液中进行浸泡处理4h，后置于4℃条件下保湿冷藏9 d；
（2）无菌外植体获得：预处理完毕的茎段利用75%酒精消毒30s后升汞灭菌10 min，然后无菌水冲洗备用；
（3）愈伤组织诱导培养：将得到的无菌茎段外植体接种至液体浅层愈伤组织诱导培养基上进行愈伤组织诱导培养；处理方法为：将得到的茎段无菌外植体切割至长度为1cm后接种至液体浅层愈伤组织诱导培养培养基上，培养基配方为Ms+3.0 mg/L 2,4-D+0.4mg/L NAA+0.6g/L PVP+30 g/L蔗糖，pH5.8；培养条件为：光照0 h/d，温度25±1℃；液体浅层愈伤组织诱导培养培养基的厚度为2cm；此条件下愈伤组织诱导率为90%，褐化率为2%；愈伤为黄绿色；其中愈伤组织诱导率（%）＝产生愈伤组织的外植体数/接种外植体总数×100%；
（4）丛生芽增殖培养：将愈伤组织接种到固液双层丛生芽增殖培养基上进行丛生芽诱导增殖培养，固液双层丛生芽增殖培养基中的上层的液体培养基的配方为Ms+3.0 mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+2.0mg/L KT+0.6g/L PVP +30 g/L蔗糖，pH5.8，其厚度为0.2~1cm；下层的固定培养基为添加6.5g/L琼脂的固体培养基，上下层培养基组成一致；培养条件为：光照强度1500-2000 lux，光照12 h/d，温度25±1℃；此条件下丛生芽诱导率为95%，增殖率为1:6.5，褐化率为2%；其中丛生芽诱导率（%）＝产生的丛生芽数/接种总数×100%；
（5）生根培养及移栽：首先将丛生芽浸泡到添加3g/L PVP+1g/L Vc的水溶液中处理1h，后接种到固体生根培养基中进行生根培养，生根培养基为1/2Ms+1.5 mg/L IBA+0.1 mg/L NAA+40 g/L蔗糖，pH5.8；培养条件为：光照强度1500-2000 lux，光照12 h/d，温度25±1℃；生根率为98%；得到的生根苗炼苗后栽种到泥：珍珠岩=3:1的基质中，保持适度遮阴（遮阴面积为18%）和温度20℃，75%湿度条件下进行栽培得到五月瓜藤种苗，成活率为90%。
实施例2
一种以叶柄为外植体利用植物组织培养方式综合处理进行五月瓜藤培养快繁以获得大量种苗的方法具体步骤如下：
（1）预处理：预处理方法为将叶柄离体后立即置于添加3 g/L PVP+1g/L Vc的水溶液中进行浸泡处理4h，后置于4℃条件下保湿冷藏7 d；
（2）无菌外植体获得：预处理完毕的叶柄利用75%酒精消毒30s后升汞灭菌5min，然后无菌水冲洗备用；
（3）愈伤组织诱导培养：将得到的无菌叶柄外植体接种至液体浅层愈伤组织诱导培养基上进行愈伤组织诱导培养；处理方法为：将得到的叶柄无菌外植体切割至1cm长度后接种至液体浅层愈伤组织诱导培养培养基上，培养基配方为Ms+2.0 mg/L 2,4-D+0.2mg/L NAA+1.0g/L PVP+30 g/L蔗糖，pH5.8；培养条件为：光照0 h/d，温度25±1℃；液体浅层愈伤组织诱导培养培养基的厚度为1cm；此条件下愈伤组织诱导率为88%，褐化率为6%，愈伤为黄绿色；
（4）丛生芽增殖培养：将愈伤组织接种到固液双层丛生芽增殖培养基上进行丛生芽诱导增殖培养，固液双层丛生芽增殖培养基中的上层的液体培养基的配方为Ms+2.0 mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+2.0mg/L KT+0.6g/L PVP +30 g/L蔗糖，pH5.8，其厚度为0.2~1cm；下层固体培养基为添加6.5g/L琼脂的固体培养基，上下层培养基组成一致；培养条件为：光照强度1500-2000 lux，光照12 h/d，温度25±1℃；此条件下丛生芽诱导率为90%，增殖率为1:4.7褐化率为5%；
（5）生根培养及移栽：首先将丛生芽浸泡到添加3g/L PVP+1g/L Vc的水溶液中处理1.5 h，后接种到固体生根培养基中进行生根培养，生根培养基的配方为1/2Ms+1.0 mg/L IBA+0.1 mg/L NAA+40 g/L蔗糖，pH5.8；培养条件为：光照强度1500-2000 lux，光照12 h/d，温度25±1℃；此条件下的生根率为95%；得到的生根苗炼苗后栽种到泥：珍珠岩=3:1的基质中，保持适度遮阴（遮阴面积为18%）和温度20℃，75%湿度条件下进行栽培得到五月瓜藤种苗，成活率为85%。
实施例3
一种以叶片为外植体利用植物组织培养方式综合处理进行五月瓜藤培养快繁以获得大量种苗的方法具体步骤如下：
（1）预处理：预处理方法为将叶片离体后立即置于添加3 g/L PVP+1g/L Vc的水溶液中进行浸泡处理3h，后置于4℃条件下保湿冷藏5 d。
（2）无菌外植体获得：预处理完毕的叶片利用75%酒精消毒30s后升汞灭菌5min，然后无菌水冲洗备用。
（3）愈伤组织诱导培养：将得到的无菌叶片外植体接种至液体浅层愈伤组织诱导培养培养基上进行愈伤组织诱导培养；处理方法为：将得到的叶片无菌外植体切割至大小为1cm2后接种至液体浅层愈伤组织诱导培养基上，液体浅层愈伤组织诱导培养基的厚度为1cm；培养基配方为Ms+2.0 mg/L 2,4-D+0.2mg/L NAA+1.0g/L PVP+30 g/L蔗糖，pH5.8；培养条件为：光照0 h/d，温度25±1℃；此条件下愈伤组织诱导率为85%，褐化率为10%；愈伤为黄绿色；
（4）丛生芽增殖培养：将愈伤组织接种到固液双层丛生芽增殖培养基上进行丛生芽诱导增殖培养，固液双层丛生芽增殖培养基中的上层的液体培养基的配方为Ms+2.0 mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+2.0mg/L KT+0.6g/L PVP +30 g/L蔗糖，pH5.8，其厚度为0.2~1cm；下层固体培养基为添加6.5g/L琼脂的固体培养基，上层为液体培养基，上下层培养基组成一致；培养条件为：光照强度1500-2000 lux，光照12 h/d，温度25±1℃。此条件下丛生芽诱导率为95%，增殖率为1:4.7，褐化率为2%；
（5）生根培养及移栽：首先将丛生芽浸泡到添加3g/L PVP+1g/L Vc的水溶液中处理1h，后接种到固体生根培养基中进行生根诱导，生根培养基为1/2Ms+1.0 mg/L IBA+0.1 mg/L NAA+40 g/L蔗糖，pH5.8；培养条件为：光照强度1500-2000 lux，光照12 h/d，温度25±1℃；生根率为97%；得到的生根苗炼苗后栽种到泥：珍珠岩=3:1的基质中，保持适度遮阴（遮阴面积为18%）和温度20℃，75%湿度条件下进行栽培得到五月瓜藤种苗，成活率为89%。
实施例4
一种以茎段为外植体利用植物组织培养方式综合处理进行五月瓜藤培养快繁以获得大量种苗的方法具体步骤如实施例1所示，不同的是固液双层丛生芽诱导增殖培养基中的上层液体培养基的配方为Ms+1.0 mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+2.0mg/L KT+0.1g/L PVP +30 g/L蔗糖，pH5.8，其厚度为0.2cm；下层固体培养基为添加6.5g/L琼脂的固体培养基，上下层培养基组成一致；培养条件为：光照强度1500-2000 lux，光照12 h/d，温度25±1℃；此条件下丛生芽诱导率为82%，增殖率为1:21，褐化率为2%；丛生芽培养生根率为100%，成活率为95%以上。
实施例5
一种以茎段为外植体利用植物组织培养方式综合处理进行五月瓜藤培养快繁以获得大量种苗的方法具体步骤如实施例1所示，不同的是固液双层丛生芽诱导增殖培养基中的上层液体培养基的配方为Ms+1.0 mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+2.0mg/L KT+0.1g/L PVP +30 g/L蔗糖，pH5.8，其厚度为1cm；下层固体培养基为添加6.5g/L琼脂的固体培养基，上下层培养基组成一致；培养条件为：光照强度1500-2000 lux，光照12 h/d，温度25±1℃；此条件下丛生芽诱导率为80%，增殖率为1:20，褐化率为2%；丛生芽培养生根率为100%，成活率为95%以上。
实施例6
一种以茎段为外植体利用植物组织培养方式综合处理进行五月瓜藤培养快繁以获得大量种苗的方法具体步骤如实施例1所示，所不同的是其中愈伤组织诱导培养、丛生芽增殖培养及生根培养基中基础培养基均将Ms及1/2Ms替换为WPM，此条件下丛生芽诱导率为92%，增殖率为1:6，褐化率为4%；丛生芽培养生根率为86%，成活率为88%以上。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。